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Revista Laboratorio Actual
Current Laboratory Journal
www.abj.org.co/revista-digital.html
Vol. 2015, No. 46, Págs 21 - 25
COMUNICACIÓN
CORTA
SICI: 1794-6220(201501/09)2015:46<021:DDMPDHEDDSDBDCCATDPSDV>2.0.TS;2-V
Editado por:
Revista
LABORATORIO ACTUAL
CURRENT LABORATORY
Asociación de Bacteriólogos Javerianos · ISSN: 1794-6220
Volumen 2015 · Número 46
Journal
Recibido: 01.07.15 • Aceptado: 31.08.15 • Publicado Online: 30.09.15
Detección de mutantes precore del HBeAg en donantes de sangre
de Bogotá, D.C., Colombia, a través del perfil serológico del virus
Precore mutant detection of HBeAg in blood donors
from Bogota, D.C., Colombia, through serological profile of the virus
Luzmila Martínez de Rodriguez1*, Antonio Carlos Jaramillo Tobón2,
Aura Rosa Manascero-Gómez3, Raúl A. Poutou-Piñales4
Instituto de Cardiología, Fundación Cardioinfantil. Bogotá, D.C., Colombia.
Instituto de Virología y Enfermedades Infecciosas, Bogotá, D.C., Colombia.
3
Grupo de Inmunobiología y Biología Celular, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias,
Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia.
4
Laboratorio de Biotecnología Molecular, Grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial (GBAI), Departamento
de Microbiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia.
*E-mail: [email protected]
1
2
ABSTRACT. Hepatitis B Virus (HBV) is a retrovirus and up to date eight genotypes have been identified. In the
disease’s natural course, mutations in the Virus appear as precore mutants HBeAg- that increment the virulence and
are associated to chronic Hepatitis, cirrhosis and Hepatocellular carcinoma. In this study, we determined the presence
of precore mutants HBeAg -from HBV from blood donors, through serological profile from the virus. 84 reactive
samples were analyzed for HBsAg and/or anti-HBc. For the detection of HBsAg, presuntive and confirmatory tests
like ELFA (Biomerieux-Francia) and Chemiluminescence (Abbott-USA) were used; HBeAG detection was performed
by Electrochemiluminescence (Roche Germany). 23% (20/84) from the samples were classified as precore mutants
(HBsAg Ag Reactive-HBsAg confirmatory positive, Non-reactive HBeAg), 2.4% (2/84) as wild strains (Reactive
HBsAg Ag, HBsAg confirmatory positive, Reactive HBeAg), 3.6% (3/84) as false positives (Reactive HBsAg
Ag, HBsAg confirmatory negative), and the 70.2% (59/84) likely mutants pre-s or cured patient (Reactive HBsAg
Ag, HBsAg confirmatory positive, Reactive HBeAg). Given the Precore mutant´s prevalence found on the studied
population, the determination of HBsAg, anti-HBc, HBeAg could become a valid tool as the minimum tests used to
detect possible mutants of the virus, especially for blood banks.
Key words: Hepatitis B Virus, precore mutation, genotypes HBV, Liver cirrhosis, hepatocellular carcinoma.
I. INTRODUCCIÓN
La hepatitis B crónica es un problema crítico de
salud pública a nivel mundial; esta enfermedad puede
presentar complicaciones como la hepatopatía crónica,
la cirrosis hepática y el carcinoma hepatocelular. Según
la OMS (Organización Mundial de la Salud) hay
2000 millones de personas infectadas por el virus de
la hepatitis B (VHB) en todo el mundo, cerca de 350
millones son portadores crónicos y 600 mil personas
mueren cada año como consecuencia de sufrir hepatitis
aguda o crónica y sus complicaciones (Organización
Mundial de la Salud, 2008, Desantiago and Loreto,
2012). El carcinoma hepatocelular (CHC) es la quinta
causa de neoplasia y la tercera causa principal de muerte
por cáncer en el mundo, con una prevalencia estimada
de más de 500 mil casos por año (Shinkai et al., 2007).
Respecto a la prevalencia del antígeno de superficie
del VHB (HBsAg), en la población en general se han
identificado regiones de baja (menos de 2%), intermedia
(2 a 8%) y alta endemia (más de 8%). De acuerdo al
Ministerio Nacional de Salud, Colombia es un país con
moderada endemia, con una prevalencia de 2.6 para
el año 2007, de 3.0 para el 2008 y 4.1 para el 2010
(Cubides et al., 2009). No obstante, existen regiones
con alta endemia, con seroprevalencia entre 8 y 20%
como las reportadas en los departamentos de Guaviare,
Vaupés, Norte de Santander, Vichada, Tolima y Guainía
(Juliao-Ruiz, 1991, Beltrán G. et al., 2005, Cubides
et al., 2009, Instituto Nacional de Salud, 2010, Tolosa
Pérez, 2014).
21
Mutantes precore del HBeAg
Martínez de Rodríguez, et al.
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El genoma del VHB está compuesto de DNA circular
y parcialmente de doble cadena, el extremo de una de
las cadenas está asociado a una DNA polimerasa viral.
Contiene 4 marcos abiertos de lectura (ORF) con 4
genes codificantes parcialmente solapados (S, C, X y
P), que codifican para las proteínas HBsAg, HBcAg,
HbeAg y la proteína X polimerasa. La expresión de
estos genes está regulada por los promotores S1p, S2p,
Cp y Xp y por los elementos activadores I y II (Moreno
et al., 2004).
Hasta el momento se han identificado 8 genotipos (A, B,
C, D, E, F, G y H) y 9 subtipos de acuerdo a la variación
en la secuencia de nucleótidos del gen S (Moreno et al.,
2004, Cortés-Mancera and Navas, 2008, RodríguezFrias and Jardi, 2008). El gen C permite sintetizar dos
proteínas diferentes, el antígeno core (HBcAg) y el
antígeno e (HBeAg). La proteína HBcAg consta de 183
aminoácidos y la proteína HBeAg de 212 aminoácidos
provenientes de la proteína de cápside más la adición
de 29 aminoácidos codificados por el gen precore,
HBeAg es identificada también como proteína precore
y considerada como la forma soluble del HBcAg, no
es una proteína estructural y su concentración aumenta
cuando hay replicación activa siendo capaz de atravesar
la barrera placentaria (Rodríguez-Frias and Jardi, 2008).
El promotor básico del core (PBC) es un fragmento del
genoma que está ubicado entre los nucleótidos 1742 y
1849, contiene elementos que de forma independiente
dirigen la transcripción de ambos RNA precore-core,
estos elementos se solapan parcialmente, dando origen
a varios sitios de inicio de la transcripción, tres cajas
TATA: TA1, TA2, TA3 para la transcripción del RNA
precore y TA4 la cual posee doble función, región de
inicio para el RNA pregenómico y algunos RNA precore
(Cortés-Mancera and Navas, 2008).
El VHB tiene una elevada variabilidad genómica, las
mutaciones asociadas pueden ocurrir espontáneamente,
como un mecanismo de supervivencia o ser inducidas
por vacunación y tratamientos antivirales (Prince,
1968). Estas mutaciones afectan la evolución clínica de
la infección, la respuesta a la terapia, provocan escape
del control inmune, fracaso de la vacunación con falsa
protección post vacunación, con cambios en los patrones
serológicos que generan falsos negativos a las pruebas
de diagnóstico utilizadas tradicionalmente.
Numerosos estudios realizados en diferentes poblaciones
a nivel mundial evidencian que las mutaciones en el PBC
y gen precore son las que más impactan en el curso de la
enfermedad con una fuerte asociación con el desarrollo
de hepatitis crónica, cirrosis y hepatocarcinoma, estas
mutaciones se presentan con disminución parcial o total
del HBeAg y anti-HBc (Chen et al., 2007, Tong et al.,
2007, Hayashi et al., 2008, Rodríguez-Frias and Jardi,
2008).
22
Las mutaciones descritas para el PBC se presentan por
la sustitución de los nucleotidos A1762T y G1764A
y suelen aparecer conjuntamente. “In vitro” se ha
identificado que la presencia de esta doble mutación
disminuye la producción del RNA precore entre 5070%, con una consecuente disminución del HBeAg
y aumento de la replicacion viral hasta en 5 veces
debido al aumento de la encapsidación del genoma.
Otra mutación frecuente considerada de alto impacto
se presenta en el gen precore-core, G1896A que genera
un codón de parada (UAG); impidiendo la transcripción
de HBeAg (Prince, 1968, Tong et al., 2007, RodríguezFrias and Jardi, 2008, Asim et al., 2010).
El curso clínico de la infección VHB es dinámico, está
condicionado por la interacción entre la replicación del
VHB y la respuesta inmune, y comprende varias fases.
La infección aguda que ocurre cuando el virus ingresa
al hospedero y comienza a replicarse, se caracteriza por
altos títulos del virus y sus antígenos especialmente
HBeAg, una respuesta primaria de anti-HBc (tipo
IgM) y respuesta necroinflamatoria severa que se
manifiesta con los signos y síntomas característicos
de hepatitis (ictericia, acolia, coluria, acompañados
de astenia, adinamia y anorexia, sin fiebre), (Barriga
et al., 1991, Cubides, 2007, Hayashi et al., 2008). El
estado de portador asintomático aparece después de
6 meses de la fase aguda por inmunotolerancia, se
produce un equilibrio dinámico entre el sistema inmune
del hospedero y el virus, el paciente es asintomático,
se detecta HBsAg, niveles elevados de DNA-VHB
(≥100.000 copias/ml) en suero y baja respuesta inmune
con ausencia de anti HBeAg y anti-HBsAg.
En la mayoría de los pacientes, el sistema inmune
finalmente controla la infección, inmunoeliminación
o inmunoaclaramiento o fase inmunoactiva; en la que
hay depuración del DNA-VHB, con cese de la necrosis
hepática y la inflamación del hígado, pero el DVA-VHB
se integra covalentemente al DNA de los hepatocitos
y permanecerá así por años. La seroconversión a antiHBe+, que ocurre en esta fase, representa el punto crucial
en la historia natural del VHB, porque marca la fase
final del control de la infección; tras la seroconversión,
los niveles de DNA-VHB son bajos, <100.000 copias/
ml, se normalizan las enzimas hepáticas, termina la
inflamación hepática, y el virus entra en la fase no
replicativa.
Hay un grupo de pacientes, que son HBeAg negativo,
perfil serológico conocido como mutante pre-core,
que pueden desarrollar niveles elevados de DNAVHB y progresar a CHC. Esto sucede por selección
natural de cepas de virus con mutaciones espontáneas
o inducidas en la región del core o el PBC del VHB.
Estos pacientes pueden sufrir una reactivación de la
replicación viral, con anti-HBe positivo, aumento de
Mutantes precore del HBeAg
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formulario de preguntas sobre antecedentes y se les
tomó nueva muestra, en algunos casos había pasado
hasta un año de haber realizado la donación de sangre
ninguno de ellos estaba recibiendo terapia antiviral ni
inmunosupresora en el momento de tomarles la muestra.
Los donantes aceptaron ser parte del estudio y firmaron
el consentimiento informado, el cual fue previamente
aprobado por el Comité de Bioética y Comité de
Investigación del hospital. Los casos provenientes del
Hemocentro se trabajaron con los sueros de su seroteca.
La muestra quedó constituida así: 54% (45/84) por
mujeres y 36% (39/84) por hombres.
Dentro de las pruebas de tamizaje, el hospital realizó
HBsAg y anti-HBc por quimioluminiscencia con el
equipo automatizado Architect y utilizando reactivos
de la Casa Comercial Abbott (USA). En el Hemocentro
Distrital, a las muestras reactivas en el tamizaje se
les realizó una segunda prueba presuntiva y pruebas
confirmatorias para HBsAg y anti-HBc, utilizando la
técnica ELFA automatizada en el sistema VIDAS de la
casa comercial Biomerieux (Francia).
En este estudio las determinaciones serológicas
para HBsAg, HBsAg confirmatoria y HBeAg, se
realizaron con los Kit HBsAg II (Ref 04687787
190), el HBsAg confirmatory test (Ref 11820648
122) y HBeAg (Ref 11820583 122), por la técnica de
Electroquimioluminiscencia (EQL) de Laboratorios
Roche (Suiza) en el analizador automático COBAS e 601
y e 411. El algoritmo utilizado para la interpretación
de las pruebas serológicas se basó en los reportes de
literatura hechos por Franca et al., (2004) y Lin et al.,
(2005).
las enzimas hepáticas y otros marcadores de actividad
necroinflamatoria; generalmente son pacientes mayores
de 65 años, con otros factores de riesgo como la ingesta
de bebidas alcohólicas, coinfecciones por VHC, VHD
y VIH.Algunos autores hablan de la fase de HBsAg
negativo ó VHB oculto la cual se presenta en portadores
asintomáticos del VHB, con muchos años de evolución
en los que su sistema inmune consigue eliminar el
HBsAg aunque persiste el DNA viral a unos niveles
muy bajos o exclusivamente detectables en el tejido
hepático (DNA ligado de forma covalente al DNA de
los hepatocitos). En estos casos la lesión histológica es
mínima, aunque se ha descrito que algunos pacientes
podrían presentar cirrosis (Barriga et al., 1991, SimónMarco, 2006, Cubides, 2007, Cortés-Mancera and
Navas, 2008).
El objetivo de este estudio fue determinar la presencia
de mutantes precore HBeAg- del VHB en donantes de
sangre a través del perfil serológico del virus.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
Se emplearon 84 muestras que presentaron un marcador
reactivo para HBsAg y/o anti-HBc, provenientes de
84 donantes de sangre de dos instituciones en Bogotá
(Colombia) 52 de un banco de sangre de la Fundación
Cardioinfantil Instituto de Cardiología (FCI-IC) y
32 del Hemocentro Distrital. Estos donantes fueron
seleccionados con criterios estrictos acorde con
el Decreto 1571 de 1993 y el Manual de Normas
Técnicas y Administrativas para Bancos de Sangre
Resolución 901 de 1996. Los casos seleccionados
provenientes del hospital se les contactó, se diligenció
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la tabla 1 se observan las características del perfil serológico encontrado y la interpretación.
Tabla 1. Resultados de las pruebas serológicas e interpretación.
Resultados
HBsAg Ag reactivo- HBsAg confirmatoria positiva, HBeAg no reactivo
HBsAg Ag reactivo- HBsAg confirmatoria positiva, HBeAg reactivo
HBsAg Ag reactivo- HBsAg confirmatoria negativa
HBsAg negativo-anti HBc positivo
n=84
%
Interpretación
20
2
3
59
23.8
2.4
3.6
70.2
Mutantes precore
Cepas salvajes
Falso positivo
Probable mutantes pre-s Paciente curado Falso positivo
El 29.8% (25/84) de las muestras analizadas fueron reactivas para HBsAg, 26.2% (22/84) se confirmaron. El 3.6%
(3/84) se clasificaron como falsos positivos. El 23.8% (20/84) no se les detectó el HbeAg; lo que correspondería al
patrón de mutantes precore; con una prevalencia del 65% (13/20) en hombres y 35% (7/20) en mujeres. La mayor
prevalencia de mutantes precore 50% (10/20) se presentó en hombres entre los 18 y 40 años. Se identificaron 2.4%
(2/84) de las muestras con HBeAg positivo que se correlacionan con cepas salvajes. El 70.2% (59/84) únicamente
presentó marcadores serológicos para anti-HBc; lo que ha sido asociado a diferentes motivos entre los que están la
presencia de mutantes pre-s, falsos positivos por la falta de especificidad de las pruebas utilizadas, inmunidad postvacunación, paciente curado o contactos infecciosos previos que pasaron como asintomáticos (Franca et al., 2004,
23
Mutantes precore del HBeAg
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Lin et al., 2005, Castells Fusté, 2006, Simón-Marco,
2006, Allain et al., 2009, García-Montalvo and VenturaZapata, 2011, Romero et al., 2011), con diferentes
niveles de DNA del virus en suero, algunos estudios
reportan que valores mayores a 200 UI/ml deben ser
tenidos en cuenta y clasificados en el grupo de los
mutantes pre-s (Candotti et al., 2011).
Hay evidencias de que los pacientes con anti-HBc
positivo asociado a mutantes pre-S pueden presentar una
patogenicidad más agresiva; actualmente los donantes
con este perfil antigénico de virus son considerados como
donantes inmunizados, pero podrían estar cursando por
un proceso infeccioso, es necesario anotar que acorde
con nuestra legislación la detección de estos anticuerpos
no es obligatoria, por lo tanto algunos bancos de sangre
no la realizan hecho que podría facilitar la transmisión
del virus a través de las transfusiones sanguíneas (Liu
et al., 2006, Devesa et al., 2008, Alvarado Mora et
al., 2011, Candotti et al., 2011, García-Montalvo and
Ventura-Zapata, 2011).
De los donantes del hospital, 3.8% (2/52), reportaron
haber tenido hepatitis en edad adulta, estos datos
no fueron consignados en el formulario que se debe
diligenciar antes de la donación por omisión de los
donantes.
En Colombia la prevalencia de la hepatitis B pasó del
2.45% en el año 2005 a 4.10% en el año 2010 (JuliaoRuiz, 1991, Beltrán G. et al., 2005, Simón-Marco, 2006,
Cubides et al., 2009). Si bien en el país no se cuenta
con estudios previos sobre mutantes de este virus, son
numerosos los estudios de otros paises que demuestran
la fuerte asociación entre la presencia de las mutantes
precore y el desarrollo de hepatitis crónica, donde
la mutación PBC se ha expresado entre el 45-73%
y la precore en el 51.5-92.5%; para los pacientes con
cirrosis hepática la mutante precore se ha observado
en el 51% y para el PBC en el 69.9%; en los pacientes
con hepatocarcinoma la mutación que se presenta con
mayor frecuencia está en el PBC en más del 70% de los
casos y la precore en el 46% (Franca et al., 2004, Lin et
al., 2005, García-Montalvo and Ventura-Zapata, 2011).
La expresión de estas mutaciones no sólo ha evidenciado
en pacientes sintomáticos con hepatitis B y sus
complicaciones, también se ha observado en donantes
de sangre de México, Argentina y Escocia donde la
mutación precore se detectó entre el 55 y 66.7% y la
del PBC en el 58.7% (Castells Fusté, 2006, Allain et al.,
2009, Romero et al., 2011). Gran parte de los estudios
descritos establecen una relación entre los fenotipos B
y C y la expresión de mutantes precore, en Colombia
24
el fenotipo con mayor prevalencia es el F (Devesa et
al., 2008, Alvarado Mora et al., 2011) pero también se
han identificado otros fenotipos en menor frecuencia,
estos resultados pueden estar asociados con la población
estudiada y el número de muestras utilizadas para la
caracterización del VHB.
IV. CONCLUSIONES
De este estudio se concluye que la mutante precore
HBeAg- está presente en el 23.8% de los donantes de
sangre estudiados, los cuales podrían estar expuestos a
sufrir complicaciones futuras relacionadas con el VHB.
Para confirmar el perfil epidemiológico es necesario
realizar pruebas adicionales como la determinación de
Anti-HBe o la confirmación por biología molecular
de la replicación viral; sin embargo, la determinación
de HBsAg, anti-HBc, HBeAg podría convertirse en
las pruebas mínimas utilizadas para detectar posibles
mutantes del virus, especialmente para los bancos de
sangre. Por otra parte es necesario tener en cuenta que
estos donantes no habían sido notificados ni tenían
estudios posteriores que aclararan su situación frente al
virus. De igual forma es necesario llamar la atención a la
necesaria intervención por parte de Salud Pública para
el control de la hepatitis B asociada a mutantes precore,
teniendo en cuenta que la vacuna no protege de las
infecciones causadas por cepas mutantes creando una
falsa sensación de seguridad en las personas vacunadas
tal y como han descritos otros autores. De igual forma,
es necesario continuar con estudios en poblaciones de
mayor tamaño que confirmen la prevalencia de mutantes
precore y pre-S en nuestra población así como la posible
asociación entre mutante precore y género masculino.
Agradecimientos. A la Fundación Cardioinfantil
Instituto de Cardiología (FCI-IC) por la revisión y
aprobación del consentimiento informado para realizar
esta investigación y por facilitar parte de las muestras
seleccionadas para este estudio. Al Hemocentro
Distrital por su colaboración con las muestras reactivas.
A Laboratorios Roche por subsidiar los reactivos
y facilitar las instalaciones físicas del Laboratorio
Clínico, a través de la Sra. Ana María Gómez y a los
Bacteriólogos de la División Diagnóstica Ricardo
Bernal y Martha Nubia Montaño Rodríguez por su
colaboración en el procesamiento y análisis de las
determinaciones serológicas.
Conflicto de intereses. Los autores declaran que no
existen conflictos de intereses en relación a este trabajo.
Mutantes precore del HBeAg
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RESUMEN: El Virus de la Hepatitis B es un retrovirus y a la fecha se han identificado 8 genotipos, en el curso natural
de la enfermedad aparecen mutaciones en el virus como las mutantes precore HBeAg- que aumentan la virulencia y
están asociadas a hepatitis crónica, cirrosis y hepatocarcinoma. En este estudio se determinó la presencia de mutantes
precore HBeAg- del VHB en donantes de sangre a través del perfíl serológico del virus. Se analizaron 84 muestras
reactivas para HBsAg y/o anti-HBc. Para la detección de HBsAg se utilizaron pruebas presuntivas y confirmatorias
como ELFA (Biomerieux-Francia), Quimioluminiscencia (Abbott-USA) y la detección de HBeAg se realizó por
Electroquimioluminiscencia (Roche-Alemania). El 23.8% (20/84) de las muestras fueron clasificadas como mutantes
precore (HBsAg Ag Reactivo-HBsAg Confirmatoria Positiva, HBeAg NO reactivo), 2.4% (2/84) como cepas salvajes
(HBsAg Ag Reactivo, HBsAg confirmatoria positiva, HBeAg reactivo), 3.6% (3/84) como falso positivo (HBsAg Ag
reactivo, HBsAg confirmatoria negativa) y el 70.2% (59/84) probables mutantes pre-s o paciente curado (HBsAg Ag
Reactivo, HBsAg confirmatoria positiva, HBeAg reactivo). Dada la prevalencia de mutantes precore encontrada en la
población estudiada, la determinación de HBsAg, anti-HBc, HBeAg podría convertirse en una herramienta válida como
las mínimas pruebas utilizadas para detectar posibles mutantes del virus, especialmente para los bancos de sangre.
Palabras clave: virus de la Hepatitis B, mutación precore, genotipos VHB, cirrosis hepática, carcinoma hepatocelular.
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