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"Herramientas diagnosticas en el
Laboratorio Clínico"
Beatriz Livellara
En el diagnostico de la Hepatitis B
Es importante establecer:
 Hepatitis Aguda vs Hepatitis crónica
 En Hepatitis crónicas: estratificación del
estado de replicación viral
 Respuesta a tratamiento antiretrovirales y
desarrollo de resistencia
 Estado de replicación residual.
 Marcadores subrogantes del ccc-DNA del
HBV
Organización Genómica del VHB
•
S – Codifica las proteínas del
AgsHB
•
Core –Codifica la proteína
core y el AgeHB
•
Polimerasa – codifica a la
enzima ADN polimerasa con
actividad de transcriptasa
reversa
•
X – proteina involucrada en la
génesis de CHC,
indispensable para
replicación y propagación
Dienstag JL. Management of Hepatitis B: A Case-Based Approach. Available at:
http://www.meds.com/hepatitis/casebased/dienstag.html
Marcadores Serológicos
HBsAg: Antígeno de Superficie
Anti-HBc (total): Anticuerpo anti-core total
Anti-HBc (IgM): Anticuerpo anti-core a clase IgM
Anti-HBs: Anticuerpo anti-HBs
HBeAg: Antígeno e
Anti-HBeAg: Anticuerpo anti-e
AntiHBs
Inmunidad
AntiHBc
Exposición
HBsAg
ADN
HBV
Infección
HBeAg
ADN
HBV
Replicación
Anti HBcIgM
ADN Infección
HBV Aguda
Inicio del diagnóstico de Hepatitis B
Solicitar HBsAg y IgG
antiHBc
Escenario 1
HBsAg (-)
IgG antiHBc(-)
Sin contacto con HBV
Vacunar contra VHB
Escenario 2
HBsAg (+) IgG antiHBc(+)
IgM anti HBc
No reactivo
Reactivo
Infección crónica
por HBV
Infección aguda por
HBV
Escenario 3
HBsAg (+) IgG antiHBc(-)
Repetir a los 30 días con
una nueva muestra
HBsAg (+)
IgG antiHBc(+)
HBsAg (+)
IgG antiHBc(-)
CASO
CONFIRMADO
Caso poco probable de
infección por HBV
Estudiar
HBeAg/AntiHBe y
carga viral HBV
Resultado NO
REACTIVO para
ambos marcadores
Vacunar contra
HBV
Escenario 4
HBsAg (-) IgG antiHBc(+)
Realizar anti HBs
Anti HBs (+)
Hepatitis B
resuelta
Anti HBs (+)
Hepatitis B resuelta
Anti HBs (-) Iniciar
Vacunación. Repetir a
los 30 días
AntiHBs (-) Estudiar carga viral
HBV posible infeccion oculta
AntiHBc aislado completar esquema
de vacunación
Caso confirmado de
HBV OCULTA por
HBV
Falso positivo
metodológico
Anti-HBc positivo aislado
1. Recuperación de infección aguda
2. Test no sensible para anti-HBs
3. Falso positivo
4. Mutante del HBsAg
5. Niveles no detectables de HBsAg
Infección oculta
(OBI)
Infección por HBV oculta
Ac anti HBV
nunca +
Perdida HBsAg
Hepatitis aguda
HBcAc +
Perdida HBsAg
Aňos depues de
una portacion
cronica
HBV oculta
HBcAc -
HBV DNA +
Semin Immunopathol (2013) 35:39–52
DOI 10.1007/s00281-012-0327-7
Ac anti HBV
Que se pierden
con el tiempo
HBV oculta (OBI)
HBV-ADN en hígado
Seropositiva
Seronegativa
HBsAg negativo
antiHBc positivo
antiHBs positivo / negativo
antiHBe positivo / negativo
HBsAg negativo
antiHBc negativo
antiHBs negativo
antiHBe negativo
HBV-ADN en suero <103 copias/ml
HBsAg
1. No se produce
2. Se produce en concentraciones no detectables
3. Se produce una variante no detectable por los métodos convencionales
1. Virus
2. Hospedador
Caracterización de una
crónica
•
•
•
HBeAg
Anti HBeAg
HBV-DNA cuantitativo.
Hepatitis B
Historia natural de la infección crónica
Inmuno
Tolerancia
Inmuno
Clearence o
Eliminación
Portador
Inactivo
antiHBe
Titulo
HBeAg
Reactivación
VN
Tiempo
ALT
HBV-DNA
(UI/mL)
N
↑
N
2 X 10 ⁸
2 X 10 9
< 2000
↑
2X 10 5- 9
Curso serológico
HBsAg
anti HBs
HBc IgM
HBc total
HBeAg
anti HBe
HBV-ADN
HBsAg
Título
HBsAg
+
antiHBc
+
HBV-ADN +
Total anti-HBc
IgM anti-HBc
Infección crónica
0
4
8 12 16 20 24 28 32 36
52
Semanas post exposición
años
Marcadores Moleculares
 HBV-DNA cuantitativo - Carga Viral.
 Mutantes pre-Core
 Mutantes de Resistencia a antivirales
 Genotipos de HBV
 NAT en banco de sangre
Detección de HBV-DNA cualitativo
Aplicaciones:
Definición de replicación activa del HBV en pacientes con
patrón compatible con infección crónica
Definición de infección HBV oculta (HBsAg negativa)
Monitoreo de respuesta de tratamiento antiviral
Métodos: comerciales, no comerciales
Límites de detección: 5 - 50 copias/ml
Aplicación principal: TAN en bancos de sangre con métodos
comerciales específicos para este objetivo diagnóstico
Detección de HBV-DNA cuantitativo Carga Viral
Permite detectar y cuantificar la viremia
Sólo se utilizan métodos comerciales
Estandardización de las unidades de
cuantificación del HBV DNA en UI/ml
La alta sensibilidad de métodos como
Taqman permiten usarlo como test
cualitativos (Sensibilidad analítica de 6
UI/ml)
Usos de DNA-HBV cuantitativo
 Diagnostico de estadío

Riesgo de transmisión

Riesgo de progresión

Selección del paciente a tratar

Indica respuesta al tratamiento

Diagnostica resistencia del HBV
Carga viral y evolución de la infección
(REVEAL)
Incidencia de HCC (%)
RR de cirrosis
(n = 3653)
(n = 3482)
20
12
14.9
15
12.2
10
9.7
10
8
6
3.6
5
1.3
1.4
3.6
4
2
1.0
2.0
0
0
Carga Viral inicial
< 300 (No detectable)
300-9,999
10,000-99,999
100,000-999,999
 1 Million
Chen CJ, et al. JAMA 2006
Iloeje UH, et al. Gastroenterology 2006
10.6
Diagnóstico molecular
Secuenciación: Gold Standar
 Genotipos (A-H)
 Mutaciones:

Pre-core/ promotor del precore

Superficie: escape a la vacuna

Polimerasa: Resistencia a antivirales
Patrones de Resistencia
 Secuenciación : gold-standard
 INNO-LiPA HBV Drug Resistance
Assay
 PCR-RFLP para búsqueda de
mutaciones mas comunes
Genotipos HBV
Potenciales diferencias biológicas entre los genotipos de HBV
*
*
*
*
*
*
*
Tasa de replicación del HBV
Eliminación natural del HBeAg.
Expresión y reconocimiento de los epítopes inmunes.
Evolución de la enfermedad Hepática
Patogénesis
Asociación con desarrollo de cirrosis y hepatocarcinoma
Sensibilidad a la terapia antiviral.
En el presente :
Valores indetectables de HBV-DNA sérico, aún
con ensayos de alta sensibilidad, no implican la
ausencia o clearence de los virus ni de la
infección viral
La evaluación de la carga viral en diferentes
momentos del tratamiento es utilizada como
marcador de efectividad de la actividad antiviral
y la persistencia de la respuesta
Hasta el momento, no existen marcadores que
identifiquen el logro de que el sistema inmune
del paciente logra controlar efectivamente la
infección viral y el progreso de la enfermedad
El Futuro ….
Detección de variantes minoritarias de escape al
tratamiento : impacto de las nuevas tecnologías
(Next Generation Sequencing) que permitirán
detectar poblaciones en % inferiores al 1%
Ensayos biológicos de fenotipos del HBV, permitirán
correlacionar los hallazgos genotípicos minoritarios
con respuesta biológica y sentido clínico de las
mismas.
Detección y cuantificación del ccc-HBV-DNA
HBsAg cuantitativo: Marcador subrogante de cccHBV-DNA

Hepatitis C
Hepatitis C
La enfermedad aguda dura aproximadamente 6
meses
25 % de las personas infectadas eliminan el virus
75 % llegan a desarrollar la enfermedad crónica
La enfermedad crónica se define como que dura
más de 6 meses
Hepatitis C y su efecto sobre el
hígado
1 de cada 3 pacientes desarrollan cirrosis
grave durante un período de 20 años
La cirrosis conduce a un daño permanente del
hígado
Puede conducir a cáncer de hígado
Muerte prematura
(British Liver Trust 2009)
Estructura del virus C
Proteínas
de la
Cápside
RNA viral
Bicapa lipídica 2
glicoproteínas de
Envoltura E1,E2
Envoltura
Género: Hepacivirus, Familia: Flaviviridae
Tiene 6 genotipos y más de 100 subtipos
El HCV no se integra en el genoma del huésped
Producción diaria: 1012 viriones
Genoma: 9600 nucleótidos
Infección Aguda con Recuperación
Infección Aguda con Progresión a la Cronicidad
antiHCV
Titulos
HCV RNA
ALT
Normal
0
1
3
4
5
6
1
2
3
4
¿Por
qué solicitar el test de HCV ?
Realizar diagnóstico precoz
Derivación precoz para la evaluación del especialista y
oportunidad de un tratamiento temprano
Se podría tener éxito aclaramiento de la enfermedad
(hasta 80 % )
Reducir la transmisión
Recomendación del Testeo HCV
Basado en el grupo de riesgo
Drogadictos IV
Aquellos que recibieron factores antes de 1985
Receptores de sangre/organos antes de 1993
Hemodialisados crónicos
Enfermedad hepática
Basado en la exposición
Trabajadores de la salud, emergencias,etc
despues de injuria con aguja de un individuo
HCV+
Chicos nacidos de portadora HCV+
( DOH Get Tested Get Treated Campaign 2009)
HCV
TECNICAS DE DIAGNOSTICO
Serologicas:
 EIA (screening)
 RIBA (confirmatoria)
Solicitar
anti -HVC
Reactivo
No reactivo
Estudiar
ARN-HVC
Caso
descartable
por HCV
Detectable
No detectable
DIAGNOSTICO POR
BIOLOGIA MOLECULAR
Ensayos :
 Cualitativos
 Genotipificación
 Cuantitativos
Técnicas Moleculares: Indicaciones
en Infección por HCV
• Diagnóstico
Serología indeterminada
Primoinfección asintomática
Recién nacido de madre HCV positiva
Contacto de alto riesgo
 Pronóstico y seguimiento de tratamiento
Evaluación indirecta de resistencia
Utilidad Clínica de la Carga Viral
HCV
• Infección aguda: Altos niveles de RNA
antes de la seroconversión
• Evaluación del estado de la enfermedad,
pronóstico (progresión vs estabilidad)
• Monitoreo de la terapia antiretroviral,
iniciación, mantenimiento, falla-resistencia
Detección de Genotipos/Tratamiento
Genotipos (11): Seis (1,2,3,4,5, 6 ) son generalmente
tratados Estos difieren entre un 31-34% en la secuencia
de sus nucleótidos en el extremo 5’
Subtipos: con letras a,b,c ,etc. Aproximadamente son
100: estos difieren entre 20-23 % en sus bases en toda
la longitud de la secuencia genómica
Utilidad: de acuerdo al genotipo hallado, se
implementara el tratamiento adecuado
Métodos de Genotipificacion
 Secuenciación : gold-standard
 INNO-LiPA
 PCR-RFLP para búsqueda de
mutaciones mas comunes
Restriction Fragment Length Polymorphism:
RFLP
Una Población Difícil
 Anti-HCV positivo
 RIBA indeterminado
 HCV RNA negativo
¿Falso positivo o expuesto no
virémico? (infección de larga data)
Analizar el patrón de reactividad
Verdaderos (+): c22 y c33
Falsos (+): c100 y NS5
Avanzando en el Diagnóstico Diferencial
Anti-HCV (+)
HCV RNA PCR (-)
RIBA (-)
RIBA (+)
Falso (+) Infectado
No Virémico
HCV RNA PCR (+)
ALT Elevada
Biopsia
Hepática
Seguimiento Viremia
(ALT y PCR)
ALT Normal
Seguimiento
(ALT)
Genotipo
Conclusiones
 Los métodos de detección cualitativos prácticamente están en
desuso
 Solo los métodos con límite de detección > 15 UI/Ml son utilizables
en el contexto de los nuevos tratamientos
 Un resultado detectable no cuantificable, entre el límite de
detección (25 UI/mL) y el límite de detección (15 UI/mL) debe
considerarse positivo para la toma de decisiones sobre
respuesta temprana, suspensión o reactivación post-suspension
del tratamiento
 Existen métodos que presentan límites de cuantificación y
detección diferentes
Conclusiones
Valores superiores al limite máximo de cuantificación no
requieren diluciones en función de que los nuevos
esquemas plantean requerimientos de disminución de la
carga viral que no están relacionados con el valor inicial
del tratamiento
Se recomienda medir la carga viral con el mismo método y
en el mismo laboratorio en lo posible
Asimismo , se recomienda a los laboratorios que realicen
estos ensayos que estén suscritos a programas de control
de calidad o que tengan acreditadas esta técnica ante
requisitos internacionales (CAP – ISO 15189)
Muchas gracias!!!!