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ESTANDARIZACIÓN DE LA INMUNOFLUORESENCIA PARA LA DETECCIÓN DEL VIRUS DE PRRS
Sotomayor-González A1*, Trujillo-Ortega ME1, Sciutto-Conde E2, Sarmiento-Silva RE3, Sánchez-Betancourt J. I1.
1
Departamento de Medicina y Zootecnia de Cerdos, FMVZ, UNAM; 2 Laboratorio de Inmunología, Instituto de
Investigaciónes Biomedicas, UNAM; 3 Departamento de Microbiología e Inmunología, FMVZ, UNAM.
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Introducción
El Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino
(PRRS) es considerado la enfermedad más importante
que afecta la producción del cerdo, causando grandes
pérdidas económicas en todo el mundo. La alta
variabilidad genética (15% y 12,5% entre los genotipos)
del virus junto con la tasa de sustitución de nucleótidos
(entre 4,7 × 10-2 y 1,55 × 10-3) y la recombinación,
favorecidos por el comercio de animales afecta el control
y el diagnóstico preciso de la enfermedad. El desarrollo y
aplicación de pruebas de diagnóstico precisos juega un
papel importante en los programas de vigilancia y control
de la enfermedad. El objetivo de este estudio fue
desarrollar y aplicar el ensayo de inmunofluorescencia
(IFA) para el diagnóstico del virus de PRRS y de esta
manera tener más herramientas disponibles para
investigación y el diagnóstico.
Material y Métodos
Se cultivaron células MARC 145 en placas de 96 pozos a
37° C con 5% de CO2 durante 24 horas o hasta que se
observó un 80-90% de confluencia. Las células fueron
infectadas por cuadruplicado durante 96 horas con
diferentes concentraciones de seis virus de campo
provenientes de diferentes estados de la República
Mexicana (Sonora, Jalisco, Guanajuato, Hidalgo,
Michoacán, Estado de México). Las placas fueron
lavadas tres veces con 100 µl de PBS estéril y se fijaron
con 50 µl de acetona al 80%. El bloqueo se realizó con
200 µl de PBS-BSA durante 30 minutos a temperatura
ambiente; se decantó y se añadieron 30 µl de anticuerpo
fluorescente (Rural Technologies SDOW-F 1009282 para
la proteína de la nucleocápside, ORF 7) probando
diferentes diluciones de 1:10 hasta 1: 100 en PBS 5%
BFS y se dejó incubar a 37 ° C. Finalmente se decantó y
se lavó la placa tres veces con 100 µl de PBS a 4° C
dejando 50 µl para observar la placa bajo el microscopio
Life Technologies EVOS FL.
Resultados
La fluorescencia se observó en todas las diluciones
mientras que las células control negativo no mostraron
ninguna fluorescencia. Las seis cepas muestran
resultados positivos con fluorescencia observada con
diferentes intensidades. El ensayo se estandarizó para la
dilución 1: 100 para optimizar el reactivo. La IFA se
estandarizó a una concentración de 1:100 del anticuerpo.
Discusión y Conclusión
El diagnóstico se logró adecuadamente con la técnica de
IFA utilizando reactivos comerciales para las seis cepas
de virus utilizados, que son una muestra representativa de
cepas endémicas que circulan en México. Es importante
contar con técnicas de laboratorio para el diagnóstico de
la enfermedad; específicamente en el caso del virus de
PRRS, donde la variabilidad del virus produce un efecto
citopático variable y en algunos casos difíciles de
observar, lo que puede complicar la investigación y el
diagnóstico.
El uso de la IFA como prueba
comprobatoria proporciona una herramienta más para el
diagnóstico preciso.
Bibliografía
1. Drigo M, et al. 2014. J Virol Methods; 202:79-86.
2. Nieuwenhuis N, et al. 2012. Vet Rec. 3;170(9):225.
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