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Publicado en línea 08 de octubre 2009
Ciencia 23 de octubre 2009:
Vol. 326 no. 5952 pp 585-589
DOI: 10.1126/science.1179052
Informe
La detección de un síndrome infeccioso Retrovirus, XMRV, en las células
sanguíneas de pacientes con fatiga crónica
1. Vicente C. Lombardi 1 , * ,
2. Francis W. Ruscetti 2 , * ,
3. Jaydip Das Gupta 3 ,
4. Max A. Pfost 1 ,
5. Kathryn S. Hagen 1 ,
6. Daniel L. Peterson, uno ,
7. Sandra K. Ruscetti 4 ,
8. Rachel K. Bagni 5 ,
9. Cari Petrow-Sadowski 6 ,
10. Bert Oro 2 ,
11. Michael Dean 2 ,
12. Robert H. Silverman 3 y
13. Judy A. Mikovits 1 , †
+ Afiliaciones de los autores
1. 1 Whittemore Peterson Institute en Reno, NV 89557, EE.UU..
2. 2 Laboratorio de Inmunología Experimental del Cáncer-Instituto Nacional de
Frederick, Frederick, MD 21701, EE.UU..
3. 3 Departamento de Biología del Cáncer, el Instituto de Investigación Lerner, The
Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, OH 44195, EE.UU..
4. 4 Laboratorio de Prevención del Cáncer, el cáncer Instituto Nacional de Frederick,
Frederick, MD 21701, EE.UU..
5. 5 Programa de Tecnología Avanzada, Instituto Nacional del Cáncer-Frederick,
Frederick, MD 21701, EE.UU..
6. 6 Programa de Investigación Básica, Corporación Internacional de Aplicaciones
Científicas, Instituto Nacional del Cáncer-Frederick, Frederick, MD 21701, EE.UU..
1.
† ¿A quién debe dirigirse la correspondencia. E-mail: [email protected]
Resumen
El síndrome de fatiga crónica (SFC) es una enfermedad debilitante de etiología desconocida que se
calcula que afecta a 17 millones de personas en todo el mundo. El estudio de células
mononucleares de sangre periférica (CMSP) de pacientes con SFC, hemos identificado el ADN de
un gammaretrovirus humanos, el virus de la leucemia murina xenotropic relacionada con el virus
(XMRV), en 68 de 101 pacientes (67%) en comparación con 8 de los 218 (3,7%) controles sanos.
experimentos de cultivo celular reveló que el XMRV derivadas del paciente es infeccioso y que tanto
la transmisión asociada a células y células libres del virus son posibles. Secundaria infecciones
virales se establecieron en linfocitos infectados primaria y líneas indicadoras de células después de
su exposición a PBMC activado, las células B, células T, o derivados de plasma de los pacientes
con SFC. Estos hallazgos plantean la posibilidad de que el XMRV puede ser un factor contribuyente
en la patogénesis del SFC.
Síndrome de fatiga crónica (SFC) es un trastorno de etiología desconocida que afecta a múltiples
sistemas de órganos en el cuerpo. Los pacientes con SFC muestra anormalidades en la función del
sistema inmunológico, a menudo incluyendo la activación crónica del sistema inmune innato y una
deficiencia en la actividad de las células asesinas naturales ( 1 , 2 ). Un número de virus, incluyendo
el virus herpes y enterovirus en todas partes, han sido implicados como posibles desencadenantes
ambientales de síndrome de fatiga crónica ( 1 ). Los pacientes con SFC a menudo tienen
infecciones activas herpesvirus β, lo que sugiere una inmunodeficiencia subyacente.
El reciente descubrimiento de un gammaretrovirus, virus de la leucemia murina relacionadas con el
virus de xenotropic (XMRV), en el tejido tumoral de un subconjunto de pacientes con cáncer de
próstata nos llevó a probar si el XMRV puede estar asociado con el síndrome de fatiga crónica.
Ambos de estos trastornos, positivo de cáncer de próstata-XMRV y el síndrome de fatiga crónica, se
han relacionado con alteraciones en el antiviral enzima RNasa L ( 3 - 5 ). Uso de WPI) nacionales
tejido Whittemore Peterson Institute (Instituto de repositorio, que contiene muestras de
caracterizados cohortes bien de los pacientes con SFC, aislamos los ácidos nucleicos a partir de
PBMC y se analizaron las muestras para XMRV mordaza secuencias por reacción en cadena
anidada (PCR) ( 5 , 6 ). De las 101 muestras analizadas síndrome de fatiga crónica, 68 (67%)
contenían XMRV mordaza secuencia. La detección de XMRV se confirmó en 7 de 11 muestras de
WPI SFC de la Clínica Cleveland por PCR-amplificación y secuenciación de segmentos de XMRV
env [352 nucleótidos (nt)] y la mordaza (nt 736) en el SFC PBMC ADN ( Fig. 1A ) ( 6 ). Por el
contrario, XMRV mordaza secuencias se detectaron en 8 de 218 (3,7%) PBMC muestras de ADN de
individuos sanos. De las 11 muestras de ADN de control sanos analizados por PCR para env y gag ,
sólo una muestra fue positiva para la mordaza y ninguno de env ( fig. 1B ). En todos los casos
positivos, el XMRV gag y env secuencias fueron más de un 99% similares a los reportados
previamente para el tumor de próstata asociados cepas de XMRV (VP62, VP35 y VP42) (fig. S1) ( 5
).
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Fig. 1
XMRV secuencias de ADN en las CMSP de pacientes con SFC. ronda de PCR en los resultados
individuales de gag , env y GAPDH secuencias en PBMCs de ( A ) los pacientes con SFC y ( B ) se
muestran los controles sanos. Las posiciones de los amplicones se indican y marcadores de ADN
(escalera) se muestran en la. Estos resultados son representativos de un grupo de 20 pacientes.
Las secuencias de los genomas XMRV de larga duración a partir de dos pacientes con SFC y un
genoma parcial de un tercer paciente se generaron (tabla S1). CFS cepas XMRV 1106 y 1178 cada
uno diferente en un 6 nt de la referencia del cáncer de próstata cepa VP62 XMRV (EF185282), y con
la excepción de un nt, la variante de nucleótidos asignan a diferentes lugares dentro del genoma
XMRV, que indicaba una infección independiente. En comparación, los derivados del cáncer de
próstata cepas XMRV VP35 y VP42 VP62 diferían de un 13 y NT 10, respectivamente. Así, los
genomas XMRV completa en estos pacientes con SFC fueron> 99% idéntico en orden a los
detectados en pacientes con cáncer de próstata. Para excluir la posibilidad de que se detecta un
virus de la leucemia murina (MLV) contaminantes de laboratorio, se determinó la relación
filogenética entre los endógenos (no ecotropic) secuencias MLV, XMRV secuencias, y secuencias
de los pacientes con SFC 1104, 1106, y 1178 (fig. S2). secuencias XMRV de los pacientes con SFC
se agruparon con las secuencias XMRV de los casos de cáncer de próstata y formó una rama
distinta de MLV no ecotropic común en cepas de ratones consanguíneos. Por lo tanto, el virus
detectado en muestras de sangre de los pacientes con SFC "es poco probable que sea un
contaminante.
Para determinar si las proteínas XMRV se expresaron en CMSP de pacientes con SFC, hemos
desarrollado la citometría de flujo intracelular (CFI) y la mancha blanca / negra occidental ensayos,
el uso de anticuerpos (Acs) con nuevas características específicas virales. Estos anticuerpos
incluyen, entre otros, (i) del anticuerpo monoclonal de rata (MAB) con el enfoque de formación de
virus de bazo (SFFV) sobre (ENV), que reacciona con todos y xenotropic MLV politrópico ( 7 ), (ii)
antisuero de cabra contra toda ratón NZB xenotropic MLV, y (iii) un anticuerpo monoclonal de rata a
MLV P30 mordaza ( 8 ). Todos estos ABS detectó la cepa VP62 XMRV humanas cultivadas en
humanos Raji, LNCaP, y las células Sup-T1 (fig. S3) ( 5 ). La CFI de linfocitos activados ( 6 , 9 )
reveló que 19 de 30 muestras de CMSP de pacientes con SFC reaccionaron con el anticuerpo
monoclonal para MLV P30 mordaza ( Fig. 2A ). La mayoría de las 19 muestras positivas también
reaccionaron con antisueros de otras proteínas purificadas MLV (fig. S4A). En contraste, 16
controles sanos culturas PBMC arrojaron resultados negativos ( Fig. 2A y fig. S4A). Estos resultados
fueron confirmados por Western blot ( Figura. 2, B y C ) ( 6 ) con ABS a SFFV Env, ratón xenotropic
MLV, y MLV P30 mordaza. Las muestras de cinco donantes sanos no mostró ninguna expresión de
proteínas XMRV ( Fig.. 2C ). Las frecuencias de los casos de síndrome de fatiga crónica en
comparación con los controles sanos que fueron positivos y negativos para las secuencias de XMRV
se utilizaron para calcular de Pearson χ 2 valor de 154 (dos colas P valor de 8,1 x 10 -35 ). Estos
datos arrojan una odds ratio de 54,1 (un intervalo de confianza del 95% de 23,8 a 122), lo que
sugiere una asociación no aleatoria con síndrome de fatiga crónica y los pacientes XMRV.
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Fig. 2
Expresión de proteínas XMRV en PBMCs de los pacientes con SFC. ( A ) PBMC fueron activadas
con fitohemaglutinina y la interleucina-2, reaccionar con un anticuerpo monoclonal para MLV P30
mordaza, y analizadas por la CFI. ( B ) lisados de PBMCs activa de los pacientes con SFC (calles 1
a 5) se analizaron por Western blot con el anticuerpo monoclonal de rata a SFFV Env (panel
superior), antisuero de cabra contra xenotropic MLV (panel central), o antisuero de cabra a MLV P30
Gag ( panel inferior). Calle 7, lisado de SFFV infectados HCD-57 células. peso de marcadores
moleculares en kilodaltons están a la izquierda. ( C ) lisados de PBMCs activa de donantes sanos
(carriles 1, 2, 4, 5 y 7) o de los pacientes con SFC (calles 3 y 6) se analizaron por Western blot
utilizando anticuerpos monoclonales de rata a SFFV Env (panel superior) o de cabra antisuero para
MLV P30 Gag (panel inferior). Calle 8, SFFV infectados HCD-57 células. Peso molecular (MW)
marcadores en kilodaltons son a la izquierda. ( D ) CD4 + células T (izquierda) o CD19 + células B
(derecha) fueron purificados, que se activa, y examinados por citometría de flujo para XMRV
mordaza con un anticuerpo monoclonal para MLV P30 mordaza.
Para determinar qué tipos de linfocitos en la sangre expresar XMRV, se aislaron las células B y T de
un paciente PBMC ( 6 ). Utilizando anticuerpos monoclonales para MLV P30 mordaza y la CFI,
encontramos que tanto T activadas y las células B se infectaron con XMRV ( Fig.. 2D y fig. S4A).
Además, el uso de anticuerpos monoclonales SFFV Env, encontramos que más del 95% de las
células en una línea de células B desarrollado a partir de otro paciente fueron positivas para XMRV
Env (fig. S4B). expresión de la proteína XMRV en el SFC T activados derivados del paciente y las
células B crecido durante 42 días en la cultura fue confirmada por Western blot (fig. S4C) con ABS a
SFFV Env y xenotropic MLV.
A continuación se investigó si las proteínas virales detectados en CMSP de pacientes con SFC
representan XMRV infecciosas. linfocitos activados ( 6 ) se cocultured con LNCaP, un cáncer de
próstata de células con defectos en la vía JAK-STAT y vías RNasa L ( 10 , 11 ) que se ha
demostrado previamente para ser permisiva para la infección por XMRV ( 12 ). Después de cocultivo
con PBMC activa de pacientes con síndrome de fatiga crónica, las células LNCaP expresó XMRV
Env y múltiples proteínas Gag XMRV cuando se analizó por Western blot ( Fig.. 3A ) y la IFC (fig.
S5). microscopía (electrón EM) de los infectados LNCaP (células de transmisión . Fig. 3B ), así
como el virus de la preparación de estas células (, . Fig. 3C ), en el 90 - a nm-ciernes partículas de
diámetro-100 compatible con una gamma (tipo C) retrovirus ( 13 ).
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Fig. 3
Infecciosas XMRV en PBMC de los pacientes con SFC. ( A ) lisados de células LNCaP cocultured
con PBMC de los pacientes con SFC (calles 1, 3, y 5) o de donantes sanos (carriles 2 y 4) se
analizaron por Western blot con el anticuerpo monoclonal de rata a SFFV Env (panel superior) o
antisuero de cabra xenotropic MLV (panel inferior). Carril 6, no infectados LNCaP, calle 7, SFFV
infectados HCD-57 células. marcadores MW en kilodaltons están a la izquierda. ( B ) La transmisión
de un microscopio electrónico de partículas virales en ciernes a partir de células LNCaP infectados
por incubación con un cultivo de células T activadas a partir de una paciente con SFC. ( C )
Micrografía electrónica de transmisión del virus de partículas liberadas por las células infectadas
LNCaP.
También se encontró que el XMRV puede transmitirse de paciente a las células plasmáticas SFC
LNCaP cuando se aplicó un protocolo de centrifugación para mejorar la infectividad del virus ( 6 , 14
, 15 ). Ambos XMRV gp70 env y gag P30 se expresaron en abundancia en las células de LNCaP
incubadas con las muestras de plasma de 10 de 12 pacientes con SFC, mientras que no expresión
de la proteína viral se detectó en las células de LNCaP incubadas con las muestras de plasma de 12
donantes sanos ( Fig. 4A ). Del mismo modo, las células LNCaP incubadas con plasma del paciente
dio positivo por XMRV P30 mordaza en los ensayos de la CFI (fig. S5B). También se observó la
transmisión libre de células de XMRV de las CMSP de pacientes con SFC a la línea de células T
SupT1 ( Fig. 4B ) y tanto la transmisión primaria y secundaria de libre de virus de la célula de las
células T activadas de los pacientes con SFC a la normalidad cultivos de células T ( Fig. 4C ). En
conjunto, estos resultados sugieren que tanto los asociados a la transmisión libre de células y las
células de la asociada al síndrome de fatiga crónica XMRV son posibles.
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Fig. 4
Infecciosas XMRV y anticuerpos para XMRV en plasma de los pacientes con SFC. ( A ) de plasma
de los pacientes con SFC (calles 1 a 6) se incubaron con células LNCaP y lisados se prepararon
después de seis pasajes. expresión de la proteína viral fue detectada por Western blot con el
anticuerpo monoclonal de rata a SFFV Env (panel superior) o antisuero de cabra a MLV P30 Gag
(panel inferior). Calle 7, no infectados LNCaP, calle 8, SFFV infectados HCD-57 células. marcadores
MW en kilodaltons están a la izquierda. ( B ) sin la transmisión de la célula de XMRV a la línea
celular SupT1 se demostró mediante cocultivo transwell con PBMC del paciente, seguido por
anidados mordaza PCR. El carril 1, marcador MW. Carril 2, SupT1 cocultured con Raji. Carriles 3-7,
SupT1 cocultured con PBMC paciente con SFC. Calle 8, sin control de plantilla (NTC). ( C Normal T)
Las células se expusieron a sobrenadantes libres de células obtenidas a partir de células T (calles 1,
5 y 6) o de células B (calle 4) de los pacientes con SFC. Carriles 7 y 8 son las infecciones
secundarias de la normalidad las células T activadas. Inicialmente, las células T infectadas primaria
fueron expuestos a sobrenadantes de CMSP de pacientes IPM-1220 (calle 7) y el IPM-1221 (calle
8). Calles 2 y 3, las células T infectadas; carril 9, SFFV infectados HCD-57 células. expresión de la
proteína viral se detectó por Western blot con un anticuerpo monoclonal de rata a SFFV Env.
marcadores MW en kilodaltons están a la izquierda. ( D ) Las muestras de plasma de un paciente
con síndrome de fatiga crónica o de un control sano, así como Env AcMo SFFV o control se hicieron
reaccionar con las células BaF3ER (arriba) o las células que expresan BaF3ER recombinante Env
SFFV (abajo) y analizadas por citometría de flujo. IgG, la inmunoglobulina G.
A continuación se investigó si el XMRV estimula una respuesta inmune en los pacientes con SFC.
Con este fin, hemos desarrollado un ensayo de citometría de flujo que nos permitió detectar Abs a
XMRV Env mediante la explotación de su homología cerca SFFV Env ( 16 ). De plasma de 9 de
cada 18 pacientes infectados con el síndrome de fatiga crónica XMRV reaccionó con una línea de
células B de ratón que expresan recombinante Env SFFV (BaF3ER-SFFV-ENV), pero no a SFFV
control de células negativas de sobres (BaF3ER), análoga a la unión de la Env SFFV MAB a estas
células ( Fig.. 4D y S6A). Por el contrario, el plasma de siete donantes sanos no reaccionó ( Fig.. 4D
y fig. S6A). Por otra parte, los nueve de plasma muestras positivas de los pacientes con SFC, pero
ninguna de las muestras de plasma de donantes sanos bloqueado la unión del anticuerpo
monoclonal Env SFFV a SFFV Env en la superficie celular (fig. S6B). Estos resultados son
consistentes con la hipótesis de que los pacientes con SFC montar una respuesta inmune específica
para XMRV.
enfermedades neurológicas y la disfunción inmune de citoquinas inflamatorias y quimiocinasregulación hasta son algunas de las características más comúnmente reportados asociados con el
SFC. Varios retrovirus, incluido el MLV y el primado retrovirus VIH y el HTLV-1, se asocian con
enfermedades neurológicas, así como el cáncer ( 17 ). Estudios de la neurodegeneración inducida
por retrovirus en modelos de roedores han indicado que los cambios vasculares e inflamatorias
mediadas por citocinas y quimiocinas preceder a la patología neurológica ( 18 , 19 ). La presencia de
XMRV infecciosas en los linfocitos puede dar cuenta de algunas de estas observaciones de la
respuesta inmune alterada y la función neurológica en los pacientes con SFC.
Hemos descubierto una asociación altamente significativa entre el retrovirus XMRV y el síndrome de
fatiga crónica. Esta observación plantea varias preguntas importantes. ¿La infección por XMRV un
factor causal en la patogénesis del síndrome de fatiga crónica o un virus pasajero en la población de
pacientes inmunodeprimidos SFC? ¿Cuál es la relación entre el estado de infección por XMRV y la
presencia o ausencia de otros virus que se asocian a menudo con síndrome de fatiga crónica (por
ejemplo, herpes)? Es concebible que estos virus podrían ser co-factores en la patogénesis, como es
el caso de la enfermedad mediada por el VIH, en los que co-infección patógenos desempeñar un
papel importante ( 20 ). Los pacientes con SFC tienen una elevada incidencia de cáncer ( 21 ). ¿Una
infección XMRV alterar el riesgo de desarrollar cáncer en el SFC? Como se señaló anteriormente, el
XMRV se ha detectado en los tumores de próstata de pacientes que expresan una variante genética
específica del RNASEL gen ( 5 ). Por el contrario, en nuestro estudio de esta cohorte CFS, se
encontró que la infección por el estado XMRV no se correlaciona con la RNASEL genotipo ( 6 ) (S2
tabla).
Por último, cabe destacar que 3,7% de los donantes sanos en nuestro estudio dio positivo por
secuencias XMRV. Esto sugiere que varios millones de estadounidenses pueden estar infectadas
con un retrovirus de potencial patógeno aún desconocidos.
Material de apoyo en línea
www.sciencemag.org/cgi/content/full/1179052/DC1