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Tecnología farmacéutica
El arte de la purificación
Filtración de virus
Volkmar Thom
Director Membrane R&D. Sartorius Stedim Biotech GmbH
Susanne Roederstein
Director Purification Technologies Europe. Sartorius Stedim Biotech GmbH
Los autores describen los procesos de análisis y
validación de Virosart HF, un filtro de parvovirus
de fibra hueca de polietersulfona con superficie
modificada
Palabras clave
Filtración de virus, purificación
The authors describe testing and validation
processes for Vorostart HF, a surface
modified polyethersulfone hollow-fiber
parvovirus filter
Keywords
Virus filtration, Purification
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PHARMATECH
Todos los productos de biotecnología procedentes de
fuentes animales representan un riesgo de contaminación
por virus, incluidos los que son endógenos del material
original, como los retrovirus [1] y los que se introducen
de forma accidental durante la fabricación por causa del
personal o a través de las materias primas. Los virus en
los productos biofarmacéuticos podrían transmitirse a los
pacientes con graves consecuencias, especialmente si el
paciente se encuentra inmunodeprimido [2]. No obstante,
no se ha informado de tales eventos en el contexto de las
proteínas recombinantes producidas mediante fermentación; esto es así gracias a las estrictas normas de seguridad
que se han aplicado durante la fabricación, incluyendo los
pasos específicos para la eliminación y/o inactivación de virus. También se ha aplicado un programa de pruebas para
garantizar que estos pasos son eficaces, de acuerdo con
las directrices establecidas en la ICH Q5A [2].
Las directrices normativas requieren como mínimo dos
pasos ortogonales para la inactivación y/o eliminación de
virus y, por tanto, se deben usar diferentes principios de
separación/inactivación en cada método [2, 3]. Debido a
que el tamaño, la carga y la presencia o ausencia de envoltura de los virus puede variar, los métodos disponibles
difieren en su eficacia contra determinados tipos de virus.
Estos factores deben integrarse en el espacio de diseño
durante el desarrollo de un proceso antes de los ensayos
clínicos de Fase I. También se espera que los fabricantes
proporcionen una estrategia de remoción viral que se haya optimizado para cada producto, ya que los productos
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biofarmacéuticos suelen ser proteínas
grandes y complejas que se asemejan
a virus más pequeños en sus propiedades físicas y químicas. Las estrategias
remoción viral deben, por tanto, adaptarse para evitar la pérdida de producto. Los pasos de eliminación de virus
deben analizarse frente a un mínimo
de dos virus modelo que representen
a aquellos con mayor probabilidad de
estar presentes en el flujo del proceso
[2-3] y deben incluir un virus endógeno si resulta útil para el proceso. Lo
ideal sería analizar también un virus
accidental como el virus diminuto del
ratón (MVM, por sus siglas en inglés) o
el parvovirus porcino (PVP), ya que se
trata del estándar de referencia en los
pasos de purificación en función del
tamaño con filtros de 20 nm [2-4]. La
eliminación/inactivación se suele mostrar en estudios de inactivación viral,
en los que se añaden virus específicos
de forma deliberada al flujo del proceso antes del funcionamiento de la
unidad que proceda. Antes de que se
puedan autorizar los ensayos clínicos
de Fase III, se deben analizar dos virus
más si es probable que haya contaminantes en el flujo del proceso. Los dos
esquemas tienen distintos objetivos: la
remoción viral general está diseñada
para demostrar la robustez del proceso, mientras que la remoción viral
específica con contaminantes previstos está concebida para garantizar la
seguridad del producto [4].
Aunque la remoción viral debe
crearse en el espacio de diseño para cada producto, se han establecido
varias estrategias sólidas y eficaces en
el sector [5-6]. Los métodos de inactivación de virus adecuados incluyen el
tratamiento mediante calentamiento/
pasteurización o con disolvente/detergente [7]; sin embargo, también
pueden producir un impacto negativo
en algunas proteínas recombinantes
y solo son eficaces frente a virus con
envoltura. Con mayor frecuencia se
utiliza una conservación con pH bajo
[8] para los virus con envoltura, siempre que sea compatible con las condiciones del amortiguador en el proceso
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Figura 1. (a) Corte transversal de una fibra hueca
(b) Comparación de un módulo de proceso de 0,8/2,4 m² y un módulo de
laboratorio de 5 cm² con filtro de ventilación para el lavado seguro
Figura 2. Caudal de agua en las cápsulas Virosart HF obtenido de tres lotes
individuales del módulo de 2,4 m². Cada lote de cápsulas se ha creado a partir de
un lote de membranas distinto. La permeabilidad media es de 170 litros/m²/h/bar
(por ejemplo: durante la producción de
anticuerpos monoclonales); se utiliza la
exposición a luz ultravioleta en el rango ultravioleta C para inactivar todos
los virus mediante reticulación de los
ácidos nucleicos a 254 nm [9]. Los métodos de eliminación de virus separan
físicamente las partículas víricas de la
corriente de alimentación; los métodos
más adecuados son la cromatografía,
en la que se capturan las partículas víricas mediante adsorción [10] y la filtración con retención con filtros de 20
nm, que elimina hasta los virus de menor tamaño mediante exclusión por tamaño [2-4]. Sin embargo, actualmente
no existen normas comunes para la filtración de virus. En su lugar se permite
que los fabricantes muestren, caso por
caso, que sus pasos de purificación de
virus son aceptables y eficaces.
Diseño y validación
de filtros
Con el fin de superar las limitaciones actuales en la filtración de virus
(y como paso hacia la creación de
normas comunes), se ha creado un
filtro de parvovirus de fibra hueca de
alto rendimiento, el cual muestra una
retención sólida a presiones transmembrana elevadas. La estructura
única de la membrana, así como su
superficie químicamente modificada,
subsanan las limitaciones de los filtros
de retención actuales.
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Figura 3. El rendimiento de la familia de módulos Virosart HF se ha analizado
para determinar su escalabilidad mediante el uso del mismo lote de flujo de
proteínas modelo de IgG humano amortiguado de solución altamente obstruida
hasta conseguir una reducción de flujo del 95%
Figura 4. Los módulos de laboratorio Virosart HF se han probado con una
solución de anticuerpos monoclonales de 10-20 g/l (6-7 de pH, 4-8 mS/cm de
conductividad) con añadido de 0,5 % de MMV. Los experimentos se realizaron
con un flujo constante a 120 l/m²h. La membrana se probó con hasta 7,4 kg de
anticuerpo/m², dando lugar a una reducción de la permeabilidad de más del
70%. Se consiguió un valor de reducción logarítmica superior a 5 en ambos
ensayos de inactivación viral (análisis B y análisis C).
El filtro Virosart HF (Sartorius Stedim) cuenta con una membrana de
fibra hueca de polietersulfona (PES)
asimétrica con superficie modificada, optimizada para la fabricación
de anticuerpos monoclonales (Figura 1a). La membrana se caracteriza
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PHARMATECH
por su gradiente de tamaño de poros en forma de embudo, diseñado
para conseguir una retención sólida
de parvovirus en condiciones difíciles (como ocurre con la liberación de
presión o el bloqueo elevado); esto
se realiza sin dificultar la transferen-
cia eficaz de proteínas de alto peso
molecular, como los anticuerpos monoclonales. La membrana cuenta con
una superficie modificada con un
polímero de formación de hidrogel
de baja unión, con el fin de reducir
la adsorción de proteínas solubles
y agregados proteicos. El gradiente de tamaño de poro y el hidrogel
son aspectos únicos de la membrana
que contribuyen a su alto rendimiento. Las fibras huecas se pueden empaquetar densamente en módulos,
con una capacidad que puede variar
entre 5 cm² y 2,4 m², y se presentan
como dispositivo de un solo uso de
10 pulgadas previamente esterilizado
(consulte la Figura 1b). La capacidad
del filtro se puede ampliar mediante
su combinación con el prefiltro de adsorción Virosart MAX, el cual cuenta
con una membrana de lámina plana
de microfiltración de poliamida optimizada en una configuración de triple capa homogénea, con un tamaño
de poro nominal de 0,1 µm.
La validación de Virosart HF ha demostrado el rendimiento sólido de la
familia de productos. En la Figura 2
se muestran datos de validación seleccionados (módulos de proceso con
una permeabilidad de 2,4 m²) con fines ilustrativos. No obstante, se han
realizado mediciones para garantizar
la calidad futura del producto entre
lotes. Las pruebas validadas durante
el proceso, así como las pruebas de
liberación, se realizan durante la fabricación y liberación de membranas
y módulos Virosart HF, en función de
los planes de obtención de muestras
previamente definidos para medir y
supervisar las características de rendimiento fundamentales de todos los
componentes del producto.
El análisis de membrana incluye
pruebas durante el proceso y de liberación de lotes. Las pruebas de liberación de rendimiento de la membrana
se realizan en módulos de laboratorio
que se han sometido a los mismos
pasos de fabricación que los módulos
de laboratorio o de proceso que se
enviarían a los clientes. La integridad
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de los módulos de Virosart HF se ha
probado en las instalaciones mediante difusión de aire y también se han
irradiado con rayos gamma. Por tanto, se han realizado tres pruebas para
la liberación de la membrana (retención en amortiguador de bacteriófago PP7, retención en IgG humano de
bacteriófago PP7 (muestra puntual
al 75% de reducción de flujo) y permeabilidad del agua) en módulos de
laboratorio, los cuales se han lavado
también con agua, se han secado y,
posteriormente, se han expuesto a
irradiación con rayos gamma. La capacidad de filtración de proteínas se
supervisa a la vez que se determina
la retención de PP7 en solución IgG
humana amortiguada. Estas pruebas
de liberación garantizan que los elementos de rendimiento de la membrana alcanzan los niveles previstos y
validados.
Además, los módulos de Virosart
HF se han validado mediante un programa de inspección completo. El
caudal de agua y la integridad de cada módulo se ponen a prueba antes
del envío. Las pruebas de integridad
se basan en una prueba de difusión
de aire a 4,5 bar y los módulos posteriormente lanzados se basan en una
correlación entre el caudal de difusión y la retención de PP7.
El rendimiento de la familia de
módulos Virosart HF se ha probado
para determinar su escalabilidad mediante el mismo lote de un IgG humano amortiguado a 2 g/l. Se han
puesto a prueba tres módulos de
laboratorio distintos de 5 cm² y un
módulo de proceso de 0,8 m² a una
presión diferencial de 2 bar hasta
alcanzar una reducción de flujo del
95% (Figura 3). Se han promediado
los datos de volumen frente a los datos de filtración de los tres módulos
de laboratorio y se han comparado
con los datos correspondientes al
módulo de proceso, en función de
la masa proteica filtrada por área de
filtración. En la Figura 3 se confirma
que, según los datos de rendimiento
obtenidos mediante dispositivos de
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Virosart HF es un filtro de parvovirus innovador y de alto rendimiento
basado en una membrana de fibra hueca de PES asimétrica con superficie
modificada
Figura 5. Retención de PVP en una corriente de alimentación de proteínas
modelo de IgG humano a diferentes niveles de reducción de flujo, durante un
lavado posterior y en una mezcla final de filtrado y lavado, realizada a dos niveles
pico diferentes
Figura 6. Análisis del lavado inverso de un módulo de proceso Virosart HF de
0,8 m². Los datos muestran que, tras un lavado de 3 litros por m² de área de
membrana, se recupera el 99% de proteínas
5 cm², los módulos de laboratorio se
pueden ampliar para aumentar los
volúmenes de corriente de alimentación y las áreas de filtración.
Las capacidades de retención del
filtro Virosart HF se han puesto a
prueba en las condiciones más difíciles posibles; las pruebas se han
realizado mediante una solución de
anticuerpos monoclonales de 10-20
g/l (6-7 de pH y 4-8 mS/cm de conductividad), con un añadido de 0,5%
de MMV. Se realizaron experimentos
con un flujo constante a 120 l/m²/h.
Con el fin de incluir las condiciones
de carga más difíciles, se puso a prueba la membrana con más de 5,5 kg
de anticuerpos/m² y el resultado fue
una reducción de la permeabilidad de
más del 70%. Se realizaron dos ensa-
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El arte de la purificación
Tabla 1. Resumen de los datos de filtración y MMV para el ensayo de control (análisis A) y los dos ensayos de inactivación viral
(análisis B y análisis C)
Análisis
Permeabilidad
del agua
(l/m²/h/bar)
Permeabilidad
final
(l/m²/h/bar)
Reducción de
permeabilidad
final (%)
Rendimiento
de masa
(kg/m²)
Valor de reducción
logarítmica de
MMV (-)
A
190
42,1
77,5
5,8
N/A
B
184
39,2
78,4
5,9
5,19
C
162
43,5
72,7
7,4
≥5,21
yos de inactivación viral y un ensayo
de control con fines comparativos.
En los tres ensayos la presión transmembrana aumentó con el tiempo,
pero los perfiles de presión variaron
ligeramente de un análisis a otro con
un rendimiento de masa entre 5,8 y
7,4 kg/m² (Figura 4). La presión transmembrana no superó los 2,7 bar en
ninguno de los ensayos y, de este modo, se mantuvo por debajo de la presión activa. Se observó un avance en
uno de los ensayos de inactivación viral, pero el otro obtuvo una retención
completa. Los valores de reducción
logarítmica del permeado combinado
fueron 5,19 y 5,21 respectivamente
(Tabla 1).
Estos datos muestran que Virosart
HF consigue unos valores de reducción logarítmica sólidos superiores a
5, incluso en condiciones difíciles; de
este modo, se cumplen los requisitos
de retención de un filtro de parvovirus de alto rendimiento con una variabilidad mínima entre lotes.
El siguiente paso fue someter Virosart HF a pruebas con una corriente
de alimentación que abarcaba la solución IgG humana amortiguada de
PVP con una concentración de IgG de
0,1 g/l. Se realizaron dos ensayos de
inactivación viral con diferentes cantidades de virus, el primero con 5x105
pfu/ml y el segundo con 5x106 pfu/
ml. Los valores de reducción logarítmica se determinaron mediante fracciones de permeado obtenidas a una
reducción de flujo de 25% y 90%. El
valor de reducción logarítmica también se determinó en la fracción de
lavado posterior, así como en la mezcla total de filtrado y lavado. Como
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se muestra en la Figura 5, Virosart HF
alcanzó valores sólidos de reducción
logarítmica para virus humanos, independientemente del nivel de bloqueo.
El valor de reducción logarítmica de
PVP también fue alto en la fracción
de lavado posterior, dando lugar a un
valor de reducción logarítmica combinado > 6 en ambas pruebas.
Finalmente, el volumen de lavado
necesario para lograr la recuperación
de la proteína objetivo se determinó
mediante la supervisión del flujo de
permeado, mediante un detector UV
en línea a 280 nm (Figura 6). Se puso
a prueba un módulo de Virosart HF
de 0,8 m², con una solución modelo
de IgG humana amortiguada de 2 g/l,
hasta que se observó una reducción
de flujo de ~40%; a continuación,
se lavó el módulo con amortiguador
a una presión diferencial de 2 bar. La
concentración proteica en la corriente
de permeado se calculó a partir de la
medición de UV, basada en una curva
de calibración previamente determinada. El lavado de la membrana con
3 l/m² consiguió una recuperación de
proteínas del 99%.
Conclusión
Virosart HF es un filtro de parvovirus innovador y de alto rendimiento
basado en una membrana de fibra
hueca de PES asimétrica con superficie modificada. Mediante pruebas
rigurosas se ha confirmado la solidez
constante de sus propiedades de retención, así como su alta capacidad
de filtración en condiciones difíciles;
esto incluye una presión de entrada
de hasta 5 bar, un bloqueo de hasta
el 90%, una carga de hasta 7,4 kg de
anticuerpos/m² y una carga viral de
hasta el 0,5% de PVP. La membrana
de fibra hueca se puede empaquetar
densamente en módulos escalables,
con un tamaño reducido que es ideal
para procesos de un solo uso.
Agradecimientos
Los autores desean dar las gracias a Amit Mehta, Alexander Seay y John Salvador de Genentech, miembro del grupo Roche, por su
contribución y apoyo a este desarrollo.
Referencias
[1]. K.P. Anderson, M.A. Low, Y.S. Lie, G.A. Keller, M. Dinowitz. Virol. 181,305-311 (1991).
[2]. International Conference on Harmonization, Q5A. Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human
or animal origin. (Ginebra, Suiza; 1998).
[3]. EMEA, Guideline on virus safety evaluation of biotechnological investigational medicinal product. EMA/CHMP/BWP/398498/2005;
(2008)
[4]. CPMP, Note for guidance on quality of biotechnology products, viral safety evaluation of
biotechnology products derived from cell lines
of human or animal origin. CPMP/ICH/295/95;
(Londres, 1997).
[5]. J.K. Walter, F. Nothelfer, W. Werz “Validation of viral safety for pharmaceutical proteins,” in Bioseparation and bioprocessing, vol
1. G. Subramanian, Eds., (Wiley-VCH, Weinhemim, Alemania, 1998), pp. 465-496.
[6]. G. Sofer, D.C. Lister, J.A. Boose. BioPharm
Int. Jun; Suppl, 37-42 (2003).
[7]. B. Horowitz A. Lazo, H. Grossberg, G. Page,
A. Lippin, G. Swan. Vox Sang. 74 Suppl 1, 203206 (1998).
[8]. K. Brorson, S. Krejci, K. Lee, E. Hamilton,
K. Stein, Y. Xu. Biotechnol Bioeng. 82, 321-329
(2003).
[9]. J. Wang, A. Mauser, S.F. Chao, K. Remington, R. Treckmann, K. Kaiser, D. Pifat, J. Hotta.
Vox Sang. 86, 230-8 (2004).
[10]. J.X. Zhou, T. Tressel, U. Gottschalk, F. Soalmo, A. Pastor, S. Dermawan, et al. J Chromatogr A. 1134 (1-2), 66-73 (2006).
Nota: Este artículo se publicó en el “Suplemento de BioPharm International” (agosto 2013).
La foto de apertura es cortesía de Sartorius
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