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Herramientas de laboratorio
aplicadas al diagnóstico y el
monitoreo del tratamiento de la
infección por VIH (Virus
Inmunodeficiencia Humana)
Fabián Fay
CIBIC.
Rosario.
Argentina
Test de laboratorio para el
diagnóstico, pronostico y
seguimiento de la infección por HIV
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Detección de Anticuerpos Anti-HIV EIA
Detección de Ag P24
Detección combinada Ag+Ac EIA
Detección de Ac- anti-HIV (Western Blot)
HIV-RNA cuantitativo (Carga Viral)
Detección de HIV-DNA en CMSP
Determinación de Resistencia a antiretrovirales
Determinación de tropismo viral
Test NAT para bancos de sangre
Historia Natural de la Infección por HIV-1
Respuesta Inmune
Conteo CD4+
ARN HIV-1en Plasma
Meses
Años
Síntomas
Nature Medicine (1996) 2:625
Evolución natural de la carga viral en un
paciente infectado
Nivel
Replicativo
de base
log (copias/ml)
12
10
8
6
4
Este nivel de replicación
obtenido condiciona el
pronostico de la evolución
hacia SIDA.
2
0
0
1,5
2
3
6
8
12
20
Tiempo infección (meses)
años
Diagnóstico de HIV
• Test de screening: Anticuerpo Anti-HIV
– 3era generación: Ac. Anti – HIV
– 4ta generación:
• Test combinado: Ac. Anti-HIV + AgP24 HIV
HIV RNA
Ag P24
Ac- anti-HIV.
HIV
RNA
Acanti
HIV
P24
Exposición
0
20
30
40
50 Dias
Diagnóstico de HIV
ELISA 3° (+)
ELISA 4° (COMBINADO) (+)
HIV RNA
Ag P24
Anticuer.
HIV
RNA
Ac-anti
HIV
P24
Exposición
0
20
30
40
50 Dias
Algoritmo Diagnóstico
¿Cómo confirmar un Elisa de HIV (+)?
Carga Viral HIV
Límite
detección 20
UI/ml
Anticuerpos
Western Blot
No define nivel
de replicación
Elisa HIV (+)
Decisión de
Tratamiento
Diagnóstico de HIV
Western Blot
(+) DIAGNOSTICO CONFIRMADO
Ac- Anti-HIV (+)
3er generación
IND REPETIR EN 1 MES
(-) FALSO POSITIVO DE ELISA
HIV RNA
Ag P24
Anticuer.
HIV
RNA
Ac-anti
HIV
P24
Exposición
0
20
30
40
50 Dias
Diagnóstico de HIV
Western Blot
(+) DIAGNOSTICO CONFIRMADO
Ac- Anti-HIV (+)
4ta generación
INDETERMINADO O NEGATIVO
HACER P24 O CARGA VIRAL
HIV RNA
Ag P24
Antic.
Exposición
0
(+) SE CONFIRMA EL DIAGNÓSTICO
(-) RESULTADO DISCORDANTE
HIV
RN
A
P24
20
30
Acanti
HIV
40
50 Dias
RECOMENDACIÓN
REPETIR ELISA Y CARGA VIRAL
AL MES DE LA PRIMERA MUESTRA
Algoritmo Diagnóstico
¿Cómo confirmar un Elisa de HIV (+)?
Elisa HIV (+)
Carga Viral
HIV
Límite
detección 20
UI/ml
Decisión de
Tratamiento
Ventajas:
•Sobre la misma muestra del screening se realiza la
confirmación de la infección y se estratifica al paciente para
definir si se inicia o no el tratamiento.
•Se minimizan los tiempos de resolución del diagnóstico
evitando el drop-out de pacientes para ser tratados.
Test de Laboratorio en el
seguimiento de pacientes con HIV
Test cuantitativos:
• Parámetros que permiten observar la
evolución, definir la decisión terapéutica y
evaluar la respuesta a la misma.
• Son independientes de las características
individuales del Huésped y o de la población del
virus de HIV que lo infecta.
• Ejemplos: Carga Viral, Recuento de CD4.
Test de Laboratorio en el
seguimiento de pacientes con HIV
Nuevos Tests:
• Permiten definir y caracterizar parámetros
específicos del Huésped o de la población de Virus
de HIV que lo infecta con el objeto de poder tomar
decisiones terapéuticas específicas para cada
asociación Huésped-Virus
• Pueden ser utilizados en distintos momentos: previo
al inicio de la terapia antiviral o como soporte de las
decisiones a tomar una vez instaurada la misma.
Test que aportan datos individuales de
la relación Huésped - Virus
• Test que detectan características de la población de
Virus infectante:
– Test de Resistencia (Geno / Fenotipo)
– Test de Tropismo – TrofileTM / Genotropismo
• Test que definen características específicas del
Huésped:
– HLA B*5107
– TDM para drogas utilizadas en el tratamiento
Uso de la carga viral
Pronóstico –
Decisión terapéutica
Evaluación de la falla terapeútica
Desarrollo de resistencia
Eficacia
terapéutica
Monitoreo
respuesta
Cuando realizar una Indicación de testeo
de Carga Viral de HIV-1
• En el momento del diagnóstico y cada 4 meses en los
•
•
•
•
•
pacientes no tratados
Inmediatamente antes de iniciar una terapia
antiretroviral.
A las 4 semanas de iniciada la terapia para verificar su
eficacia.
Una vez obtenida una carga viral indetectable, cada 3 4 meses para el seguimiento de la misma.
Ante la aparición de eventos clínicos de importancia o
disminución marcada de los CD4+.
Para confirmar falla terapéutica luego de obtener
valores detectables en pacientes que habían logrado
bajar sus niveles de viremia por debajo de 50 copias/ml
Métodos Comerciales disponibles
• RealTimeTM HIV-1 m2000rt (Abbott, North
Chicago, IL, USA)
• NucliSENS EasyQ® HIV-1 v2.0
(bioMerieux; Boxtel, Netherlands)
• Cobas® Taqman® (Roche; Pleasanton,
CA, USA) CAP/CTM v.2.0
• VERSANT® HIV-1 RNA 1.0 kinetic PCR (kPCR) /
VERSANT® bDNA (Siemmens, Berkeley California)
Límites de detección –
Rango activo del ensayo
Rango activo de medición
Detectable
pero no cuantificable
(Hitrate
rate95%)
50%)
Límite
de detección
cuantitativa (Hit
25 cps/ml (~ 14.4 IU/ml)
NucliSENS EasyQ HIV-1 v 2.0
48 cps/ml (~ 27.3 IU/ml)
CAP/CTQ HIV-1 Roche
40 cps/ml (~ 22.8 IU/ml)
m2000 real time Abbott
35 cps/ml (~ 21.1 IU/ml)
k PCR Versant
10,000,000 cps/ml
~ 5,700,000 IU/ml
10,000,000 cps/ml
~ 5,700,000 IU/ml
10,000,000 cps/ml
~ 5,700,000 IU/ml
11,000,000 cps/ml
~ 6,200,000 IU/ml
Carga viral
10
100
1,000
10,000
100,000 1,000,000
10,000,000
Correlación entre métodos
R2:0.9685. En 91% de las muestras las diferencias fueron < 0,5log
Taylor et al, Antiviral therapy 2009. 14: 1189-1193.
Impacto de los subtipos sobre la
carga viral
9 Subtipos ( A, B, C, D, F ,G, H, J y K)
Grupo M (Major)
43 Formas recombinantes
Circulantes CRFs (*1)
HIV-1
Extraordinaria
variabilidad
genética.
Grupo O (outlier)
Variantes N(new), P
+ del 90% de las infecciones a
HIV-1 en el mundo son
asociadas a formas no-B (*1,
2)
Subtipos circulantes en
Argentina: B, F, B/F, C y A
* 1 Taylor B, Sobieszczyk M, McCutchan F, Hammer S: The challenge of HIV-1 subtype diversity. N. Engl. J. Med.358,1590-1602 (2008).
* 2 Perrin L, Kaiser L, Yerly S: Travel and the spread of HIV-1 genetic variants. Lancet Infect. Dis.3,22-27 (2003).
Impacto de los subtipos sobre la
carga viral
Comparison of the RealTime HIV-1, COBAS TaqMan 48 v1.0, Easy Q
v1.2, and Versant v3.0 assays for Determination of HIV-1 Viral Loads in
a Cohort of Canadian Patients with Diverse HIV Subtype Infections.
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Jan. 2011, p. 118–124
Deirdre Church,1,3,4* Daniel Gregson,1,3,4 Tracie Lloyd,1 Marina Klein,5 Brenda Beckthold,2 Kevin Laupland,1,4 and M. John Gill2,3,4 Calgary
Laboratory Services1 and Southern Alberta HIV Clinic,2 Alberta Health Services, and the Departments of
Pathology and Laboratory Medicine3 and Medicine,4 University of Calgary, Calgary, Alberta, and the McGill HIV Clinic, McGill University, Montreal,
Quebec,5 Canada
Impacto de los subtipos sobre la
carga viral
Estas razones indican la gran importancia en la elección del
método a utilizar de acuerdo a los subtipos y formas
recombinantes en la región tanto en pacientes naive como
tratados.
Se deberían realizar estudios comparativos que muestren la
correcta cuantificación de dichos métodos para dichas
variantes.
Todas estas observaciones fortalecen también el hecho de
mantener el mismo método para el seguimiento de
pacientes tratados, especialmente en el contexto de
infecciones por subtipos no-B por las diferencias existentes
en estos con los diferentes ensayos.
Nuevos métodos de carga viral de
HIV
PROS
•
Mejora en la sensibilidad y
reproducibilidad
•
Menor tiempo de ensayo
•
CONTRAS
•
Costo (el costo de los
tratamientos ha bajado, el de la
carga viral ha subido)
Disminución de los riesgos de
contaminación (extracción
cerrada, amplificación-detección
en tiempo real en tubo cerrado)
•
Aspectos técnicos y logísticos
para su implementación
•
Provisión de reactivos en tiempo y
forma
•
Menor volumen de muestra
•
•
Mayor versatilidad en los flujos de
trabajo (8 – 96 muestras)
Condiciones correctas para su
implementación tecnológica
•
Otros materiales sobre los que
trabajar (DBS, tejidos, fluidos)
Subcuantificación de subtipos y
CRF
•
Variabilidad entre distintos
ensayos
•
¿Que hacer cuando aparece un blip?
Carga Viral
BLIP
EVALUAR FALLA
TRATAMIENTO
(50 – 200 copias/ml)
Limite de detección – 50 copias/ml
Seguir frecuencia de seguimiento normal
•
•
•
•
Repetir la carga viral dentro del mes.
Descartar fallas de adherencia o procesos que puedan aumentar
temporalmente la viremia,
En general un blip se resuelve en un nuevo valor no detectable o en
un valor mayor.
En este último caso, evaluar falla de tratamiento y posible resistencia
Nuevos (viejos) objetivos en los
test de Carga Viral
• Significado clínico de valores entre el límite de detección
y el límite de cuantificación
• Capacidad para detectar y cuantificar eficientemente
todos los subtipos y formas recombinantes circulantes
existentes para evitar subestimaciones y falsos
negativos.
• Seguir mejorando la estandarización respecto de las
unidades de referencia para disminuir el impacto del
cambio de metodología para un paciente.
• Medición de CV en otros materiales en forma
estandarizada
• Medición cuantitativa de HIV-DNA proviral
Ciclo replicativo del HIV
Sitios de acción de los antivirales.
Objetivos de la Terapia antiretroviral
Suprimir la replicación viral:
– Disminuir la CV lo máximo posible.
– En lo posible a niveles indetectables.
– Mantenerlo así el mayor tiempo posible.
– Se evitará así la generación de nuevas
mutantes, o la propagación de cepas
resistentes preexistentes.
Efecto de la terapia antiviral
Carga viral
Presión de
la Droga
Virus Salvaje (WT)
susceptible a la droga
Virus mutante
Resistente a la droga
Tiempo
Evolución actual con HAART
Carga
viral
CD4/mm3
Inicio
Terapia
Nivel de detección
tiempo
Desarrollo de Resistencia
Capacidad del virus de cambiar hacia una forma poblacional que mejora o
incrementa su capacidad para replicarse en presencia de inhibidores de dicha
replicación.
Quasiespecies susceptibles a la Droga
Quasispecies resistentes a la Droga
Carga Viral
Inicio de Tratamiento
Selección de quasiespecies
resistentes
Supresión Incompleta
Potencia Inadecuada
Niveles de droga inadecuados
Falta de adherencia
Resistencia Pre-existentes
Tiempo
Desafíos de la Resistencia a drogas en el HIV
•
HIV se puede volver resistente a todas las drogas disponibles.
•
La replicación de variantes resistentes a drogas lleva al paciente a la
falla de tratamiento.
•
Durante la falla de tratamiento, el HIV desarrolla patrones de
mutación complejos que causa en muchos casos resistencias
cruzadas e imposibilita el uso de otras drogas.
•
Los virus resistentes a drogas pueden ser transmitidos a otros
pacientes complicando su tratamiento inicial, dispersando las
variantes resistentes en la población (aumento de la resistencia
poblacional primaria)
•
Si bien tratamientos de rescate pueden volver a suprimir la
replicación viral, las variantes resistentes persisten en reservorios
virales (santuarios) y pueden re-emerger en condiciones favorables
para su replicación.