Download Capítulo 62: HORMONA DE CRECIMIENTO

UNIDAD VII: Endocrinología
Capítulo 62: HORMONA DE CRECIMIENTO
Nelio E. Bazán
Los efectos endocrinos de la hormona de crecimiento se conocen desde hace tiempo, incluso fue
utilizada en preparados de hipófisis cadavéricas en niños. Se conocía también la estimulación por
parte de la hormona de crecimiento de algunos tejidos como el hepático, para producir
intermediarios activos como las somatomedinas. Pero siempre el objetivo fue intentar descubrir
que ocurre realmente en el músculo esquelético cuando es sometido a una sobrecarga de fuerza.
Ahora sabemos de la importancia del rol del sistema IGF-I en la hipertrofia en respuesta al daño
muscular provocado por el ejercicio de fuerza. En este capítulo se repasan algunos aspectos
generales de la hormona de crecimiento haciendo hincapié en el sistema IGF con sus acciones
autocrinas y paracrinas a nivel muscular.
Síntesis y regulación, ##.
Estructura, ##.
Secreción, ##.
Acciones, ##.
Factor de crecimiento, ##.
GH y deporte, ##.
SINTESIS Y REGULACION
Estructura
La somatotrofina u hormona de crecimiento (GH) es un polipéptido compuesto por 191
aminoácidos, con un peso molecular de cerca de 21.500 dalton. La hipófisis anterior contiene
entre cinco y diez miligramos de GH, que es sintetizada y acumulada en las células somatotropas
que son las más numerosas de la pituitaria. Los humanos poseen un gen funcional (GH-N) y una
variante (GH-V), integrantes de una familia de genes que se encuentra en el cromosoma 17. Este
gen sólo se expresa en las células somatotropas de la pituitaria anterior, productoras de GH. Una
vez sintetizada en el retículo endoplásmico se transporta a gránulos de secreción que son
liberados ante un estímulo. Cerca de la mitad de la GH secretada, es transportada a través de la
circulación en asociación a proteínas que se unen a ella (GHBP).
Su producción esta influenciada por la edad y el sexo. Aunque no es importante en el
crecimiento fetal, sí lo es en el período neonatal. Los niveles más altos de GH se observan antes
del nacimiento y durante el período postnatal inmediato. Influye en el crecimiento durante la
adolescencia para estabilizarse en el adulto y luego de los 35 años. Su secreción es de alrededor
de 0.4 a 1.0 mg/día en el varón adulto, con valores más elevados en los adolescentes. Las
concentraciones séricas varían durante el día hasta 0.5 ng/ml en el varón adulto. Se metaboliza
en el hígado y el riñón que internalizan los complejos GH-receptor y completan la degradación
hasta aminoácidos, así es que solo mínimas cantidades de GH aparecen en la orina. Tiene una
vida plasmática entre 15 y 20 minutos luego de la secreción o de una inyección intravenosa. Si la
inyección es subcutánea o intramuscular, las concentraciones sanguíneas de GH alcanzan un pico
entre 1 y 3 horas posteriores y cae hasta niveles indetectables luego de 24 horas.
Secreción
La secreción espontánea de GH es pulsátil. Los intervalos entre los pulsos varían según las
especies, y son aproximadamente de dos horas en humanos. El patrón de secreción de GH
depende de la interacción finamente regulada de dos hormonas hipotalámicas, la hormona
liberadora de hormona de crecimiento (GHRH) o somatotrofina de acción excitatoria, y la
somatostatina también conocida como hormona inhibidora de la liberación somatotropa (SS).
La GH se excreta en respuesta a numerosos estímulos fisiológicos (sueño, estrés físico y
emocional, apetito y ejercicio) y farmacológicos que actúan sobre áreas específicas del cerebro a
través de vías controladas por neuronas serotoninérgicas, dopaminérgicas, adrenérgicas y
colinérgicas.
El patrón secretorio de GH es sexualmente dimórfico, los machos exhiben pulsos mayores,
influenciado por andrógenos y estrógenos: mientras que los primeros regulan la amplitud del
pulso, los estrógenos, regulan la secreción basal. Los andrógenos y los estrógenos pueden afectar
la expresión del gen de la GH en la pituitaria, aunque también tienen influencia en la secreción
de GHRH y SS. Los patrones de dimorfismo sexual observado en enzimas, receptores y otras
proteínas, puede ser atribuible a los diferentes patrones de secreción de GH en machos y
hembras.
Figura 62.1: Secreción de GH. Estímulo o inhibición
por retroalimentación positiva o negativa.
GHRH
El eje hipotálamo – hipófisis es regulado por la GH a través de un feedback negativo inhibiendo
su propia liberación siendo el regulador más importante de la expresión génica de la GHRH. El
mayor sitio de producción de GHRH es el hipotálamo basomedial y su gen está localizado en el
cromosoma 20, que codifica para un precursor de 108 aminoácidos (preproGHRH), que debe
modificarse para llegar a la forma biológicamente activa.
Su expresión es también afectada por la testosterona, que determina que los niveles de GHRH
sean mayores en machos que en hembras, y por la administración del factor trófico semejante a
la insulina (IGF-I) directamente en el sistema nervioso central, que suprime los niveles de
GHRH. Existen algunas alteraciones metabólicas asociadas a cambios en la expresión del gen de
la GHRH:
Diabetes, en humanos aumenta la secreción de GHRH
Obesidad genética, en ratas con obesidad genética, los niveles de GHRH se encuentran
disminuidos
Toxicidad por etanol, produce disminución de los niveles de GHRH
Deprivación proteica, en humanos la malnutrición proteica resulta en un aumento de la
secreción de somatotrofina
La secreción de GHRH es estimulada también por los sistemas b-adrenérgicos, dopaminérgicos y
serotoninérgicos. También estimulan su secreción los aminoácidos y la inhiben la glucosa, los
ácidos grasos, el IGF-I y la SS.
Somatostatina
El gen humano de la SS se encuentra en el cromosoma 3, que codifica un precursor de 116
aminoácidos (preproSS). Las neuronas que producen SS, a diferencia de las que producen
GHRH, se encuentran localizadas en todo el SNC, pero principalmente en la región anterior del
hipotálamo, y participan otras vías no relacionadas con GH. El principal regulador de su
secreción es la somatotrofina. Del mismo modo que con la GHRH, los niveles de SS son
mayores en ratas machos que en hembras e incrementados por la acción de la testosterona. La
hipoglucemia y la hiperglucemia incrementan los niveles de SS, en animales con diabetes, los
niveles de SS se hallan aumentados. La GH, el IGF-I y la GHRH estimulan la liberación de SS.
Muchos neuropéptidos incluyendo la hormona liberadora de tirotrofina, la GHRH, la secretina, el
glucagón y la neurotensina, estimulan la secreción de SS cuando son administrados directamente
en el SNC. Los efectos inhibitorios de la SS sobre la síntesis de GH y la proliferación de células
somatotropas se debe a la modulación de la acción de la GHRH.
Figura 62.2: Somatostatina. Se observa el proceso por el cual a partir de la preproSS se arribará
a la molécula biológicamente activa.
Otras influencias hormonales y metabólicas
La hormona tiroidea (el mayor efecto de esta hormona es aumentar la expresión del gen GH), los
glucocorticoides, los andrógenos y los estrógenos influencian la secreción de GH. Las hormonas
glucocorticoideas contribuyen a la regulación de la secreción a nivel hipotalámico y a nivel
pituitario incrementa la expresión del gen de la GH en concentraciones fisiológicas, aunque el
hipercortisolismo inhibe la respuesta a los estímulos.
Los andrógenos aumentan la expresión del gen de la GH, mientras que los estrógenos la
disminuyen. Los combustibles metabólicos ejercen su principal efecto a nivel hipotalámico. La
deprivación de proteínas disminuye la secreción de GH y se postula que la ingesta de
aminoácidos, sobre todo la arginina, lisina y ornitina la estimulan. La hipoglucemia inducida por
insulina, la aumenta en humanos y considera un test para valorar la función hipofisaria,
desencadenando un aumento de GH en el 85 % de los sujetos normales, mientras que la
hiperglucemia la inhibe. Incrementos en la concentración plasmática de ácidos grasos libres
suprimen la liberación de GH bloqueando los efectos de la GHRH, y los descensos, la aumentan.
Ejercicio físico
El ejercicio es un potente estimulo para la secreción de GH y al igual que el estrés psíquico
puede incrementar la secreción a través del aumento de la secreción central de catecolaminas. Un
ejercicio de 20 minutos entre el 75 y el 90 % del consumo máximo de oxigeno, provoca una
respuesta de secreción de GH equivalente a la de la hipoglucemia insulinica y mayor que la
respuesta inducida por el sueño, por la arginina y por la levodopa. La respuesta de la hormona
esta influenciada por las características del individuo y del ejercicio que realiza. Los niveles de la
hormona aumentan entre los 15 y 30 minutos y más precozmente cuanto más intenso es el
ejercicio. En un ejercicio breve e intenso (subir escalones o en el levantamiento de pesas, con
una carga elevada y con pocas repeticiones) se registra secreción de GH, pero difícilmente en
ejercicios poco intensos y prolongados (caminata moderada hasta 6.4 km/h durante una hora o un
trabajo de pesos con poca carga y muchas repeticiones). El aumento de la temperatura durante el
ejercicio es otro estimulo para la secreción de GH y el ejercicio realizado en un ambiente
caluroso provoca una respuesta mayor que el mismo en ambiente frío.
Sueño
El 70 % de la secreción de GH ocurre durante la noche con un pico en la secreción entre los 60 y
90 minutos después del comienzo del sueño. Este es el sueño profundo, estados III y IV, con
ondas lentas en el EEG. La secreción nocturna de GH puede verse aumentada en los atletas.
ACCIONES
Anabolicas
La principal acción de la GH es estimular la síntesis de proteínas, en forma tan potente como la
testosterona (sus efectos individuales son aditivos), a través de la movilización de
transportadores de aminoácidos. El efecto promotor del crecimiento de la GH requiere de
numerosos factores, incluyendo efectores nutricionales como proteínas, reguladores hormonales
como la misma insulina y hormona tiroidea, factores específicos de tejidos y factores genéticos.
Cuando se utiliza STH por vía exógena se produce un desequilibrio en el sistema de regulación
hormonal ya que se alteran las relaciones de GH y las otras hormonas como la hormona tiroidea,
insulina, corticoesteroides, gonadotrofina y estrógenos.
Tejido muscular
El desarrollo muscular se produce en función de la actividad física y los factores hormonales. El
ejercicio y algunas hormonas aumentan las proteínas necesarias para el crecimiento, que son,
entre otras, la actina, miosina y tropomiosina, que se sintetizan en los polirribosomas que se
encuentran en el sarcoplasma de las miofibrillas. Al administrar GH a las células musculares
tras una fase silenciosa inicial de 20-30 minutos se evidencia un aumento de la velocidad de
captación de los aminoácidos durante uno o dos horas. Los adultos normales, tratados con GH
pueden obtener un aumento del peso total del 20 % y un aumento del diámetro de las fibras
musculares de cerca del 10 % respecto al grupo de control. Los efectos de la GH en la
recuperación de músculos atróficos por inmovilización son de interés práctico. La GH estimula
también la síntesis del colágeno a nivel muscular.
Metabolismo intermedio
La GH aumenta la movilización de los lípidos del tejido adiposo, reduciendo las reservas
adiposas, incrementando el contenido hepático de lípidos y la concentración plasmatica de ácidos
grasos libres. En forma opuesta a la acción lipogénica de la insulina, moviliza el metabolismo
oxidativo hacia la utilización de ácidos grasos durante el ayuno y el ejercicio. Estimula la
utilización de aminoácidos para la síntesis proteica. Posee una marcada acción contrainsular,
estimula la glucogénesis y la glucógeno lisis hepática, la secreción de insulina mediante
hiperglucemia o por acción directa sobre las células beta del páncreas.
Otras acciones
Otras acciones de esta hormona son el crecimiento de los órganos como la hipertrofia cardiaca y
renal, la producción de hormonas, regulación del metabolismo, el crecimiento y la maduración
ósea y la función inmune. Estos efectos son más fácilmente visibles durante el tratamiento con
somatostatina en humanos con deficiencias en su producción aunque para la expresión máxima,
muchos de estos efectos los tejidos requieren una exposición intermitente, más que continua, a la
GH.
IGF-I
Entre otros efectos, la GH estimula la producción del factor de crecimiento semejante a la
insulina-I (IGF-I). La GH estimula la expresión del gen de IGF-I en todos los tejidos. En la
mayoría de ellos, el IGF-I también ejerce acciones locales autócrinas y parácrinas, pero el hígado
secreta activamente IGF-I hacia la circulación. El IGF-I circulante debe ser considerado como un
marcador de la acción de GH en el hígado. Juega un rol central en el mantenimiento de la masa
muscular esquelética y en la hipertrofia. La falta de IGF-I es una de las causas por las cuales el
músculo esquelético pierde masa y fuerza con el transcurso de la edad.
Figura 62.3: Vías de acción de la hormona de crecimiento. Formas directas e indirectas a
través del IGF.
.
Figura 62.4: Acciones de la hormona de crecimiento.
FACTORES DE CRECIMIENTO
Muchas de las acciones biológicas de la GH son mediadas por factores de crecimiento tipo
insulina (IGF) o somatomedinas. La modulación del turnover de proteínas en el músculo está
regulada por un número de factores de crecimiento de tejidos expresados localmente. La IGF-I
estimula la proliferación y diferenciación de mioblastos in vitro, como también la síntesis de
proteínas. La estimulación de la secreción de la GH por parte de la testosterona, aumenta la
producción de IGF.
El sistema IGF-I
El IGF-I (somatomedina C) es un factor de crecimiento relacionado estructuralmente con la
insulina sintetizado principalmente por el hígado y los niveles plasmáticos tienen su pico
máximo durante la pubertad. Es producida en respuesta a la GH e induce las actividades
celulares subsecuentes, particularmente sobre el crecimiento del hueso. Además de estas
actividades endócrinas, el IGF-I tiene actividades autócrinas (estimulación directa de la síntesis
de proteínas miofibrilares) y parácrinas (proliferación, diferenciación y fusión de células
satélite). El receptor IGF-I tiene actividad intrínseca de tirosina kinasa (similar al de insulina).
Los factores de crecimiento con la insulina tienen efectos importantes sobre múltiples órganos,
incluyendo el hueso.
El hígado y otros tejidos liberan proteínas unidas a IGF (IGFBP) que pueden modular sus
acciones: Es una familia de proteínas llamadas IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP5, y IGFBP-6. Las IGFBPs son carriers de IGFs en la circulación (protegen de la degradación y
transportan hacia tejidos específicos) y moduladores de la acción.
Figura 62.5: Sistema GH/IGF. Las flechas indican los efectos estimulatorios, y las líneas
paralelas indican las inhibiciones. (Modificado de Florini, 1996).
Figura 62.6: Parte de la familia de IGF. Se muestran tres hormonas, tres receptores, y seis
proteínas vinculantes.
Adaptación muscular
El IGF-I tiene un gen complejo que está regulado por múltiples promotores y es capaz de
producir al menos cuatro diferente proteínas precursoras o isoformas de IGF-I. Las dos
isoformas que tienen más relevantes son: la IGF-IEa, llamada IGF-I muscular, la cual es similar
a la IGF-I producida por el hígado, y la IGF-IEb, llamada factor de crecimiento mecánico
sensible a la sobrecarga o mechano growth factor (MGF). Estas isoformas de IGF-I son un
componente integral de la hipertrofia del músculo esquelético. La MGF inicia la proliferación de
las células satélite, mientras que la IGF-Ea promueve la diferenciación en los miotubos. La
expresión ARNm de IGF-I del músculo esquelético y la expresión de proteínas aumentan durante
las primeras fases de la sobrecarga mecánica, indicando que el hígado no es la única fuente de
IGF-I. La hipertrofia del músculo esquelético es regulada por tres procesos moleculares: mayor
actividad de células satélite, transcripción genética y codificación proteica, con cada uno de estos
procesos contribuyendo diferentemente a la hipertrofia muscular. Es interesante observar que, la
IGF-I puede influenciar a la actividad de todos esos mecanismos.
En los músculos sometidos a sobrecarga se produce una hipertrofia compensadora que esta
asociada a un aumento en la expresión del ARNm del IGF-I. Cuando hay daño muscular, las
células satélites, pequeñas células mononucleadas del músculo, son movilizadas para comenzar
el proceso de regeneración observándose una respuesta proliferativa en la cual esas células
activadas se someten a un ciclo mitótico. Luego se diferencian en mioblastos que pueden
fusionarse con otros para formar nuevas miofibras o incorporarse en las miofibras sobrevivientes
del daño muscular. La IGF-IEa y la isoforma MGF son producidas y liberadas por las miofibras
en respuesta a una carga o estiramiento modulando este proceso de regeneración de modo
manera autócrina (estimulación directa de la síntesis de proteínas miofibrilares) y parácrina
(proliferación, diferenciación y fusión de células satélite). La mayor concentración local de estos
factores estimula los procesos miogénicos necesarios para la respuesta de la hipertrofia.
Se considera que ante un trabajo de sobrecarga se produce un tipo de IGF-I para tejidos en
general con acción endócrina y las otras isoformas, IGF-IEa y MGF, trabajan por acción
parácrina o autócrina para inducir la proliferación y diferenciación de las células satélite, seguida
de una fusión de mioblastos diferenciados para hipertrofiar a las miofibras. La mayor expresión
del ARNm de las isoformas del IGF-I, se consigue con trabajos de sobrecarga, estiramientos y
contracción excéntrica muscular. La eficacia de la IGF-I muscular es dependiente no sólo de su
expresión sino también de su disponibilidad, la cual es regulada por las proteínas IGFBP-1 a -6 y
por la abundancia del receptor IGF-I. En el músculo, la IGFBP-4 tiene una alta afinidad para la
IGF-I y así inhibe sus efectos miogénicos, mientras la IGFBP-5 puede facilitar o inhibir la
diferenciación estimulada por la IGF-I bajo ciertas condiciones. La IGFBP-1 inhibe la síntesis de
proteínas estimulada por la IGF-I.
Figura 62.7: Hipertrofia compensadora. El trabajo de sobrecarga estimula la activación de las
células satélite. (Modificado de Adams, 2002).
La GH circulante se eleva durante aproximadamente 60 minutos después de un turno de
entrenamiento con pesas. El IGF-I aumenta 16 horas más tarde. La circulación puede no ser un
buen marcador de la actividad implícita del sistema GH-IGF-I ya que se produce un secuestro
por parte del tejido muscular de la IGF-I que podría servir para aumentar sus acciones
mitogénicas y, al mismo tiempo, proteger al sistema de una caída en la liberación de la GH
hipotalámica y pituitaria. Agreguemos que el IGF-I ejerce una inhibición negativa sobre la
secreción de la GH a nivel del hipotálamo y de la glándula pituitaria. La IGF-I a nivel muscular
compite con la insulina, ya que estructuralmente, se puede unir al receptor de la insulina en el
músculo.
Otro dato a tener en cuenta respecto a los niveles de IGF-I circulante es su relación con la
restricción calórica, si el gasto calórico excede el consumo energético, la IGF-I circulante cae. El
entrenamiento con pesas combinado con una suplementación de hidratos de carbono y/o
aminoácidos, por el contrario, estimulan un aumento en la IGF-I.
GH Y DEPORTE
Los niveles hemáticos de GH pueden aumentar por la inyección de la hormona o la ingesta oral
de fármacos capaces de inducir su liberación por la hipofisis. Antiguamente la GH procedía de la
hipofisis de cadáveres. Su uso estaba destinado a la terapia con niños con deficiencia de esta
hormona pero el temor a la transmisión de enfermedades virales o priónicas propias del sistema
nervioso llevó a abandonar su práctica. Actualmente esta disponible en el mercado GH
biosintetica humana, obtenida mediante el uso de técnicas de ADN. También se estimula la
síntesis hipofisaria de la GH, con fármacos tales como el propanolol, la vasopresina, la clonidina
o la levodopa. Otras sustancias postuladas son los aminoácidos como arginina, lisina ornitina y
triptofano, muy difundidos entre los atletas.
Es utilizada por parte de levantadores de peso y culturistas que buscan aumentos de peso de la
masa magra y reducción del peso graso. La utilidad de esta hormona en los deportes de fuerza y
de potencia es escasa ya que gran parte del aumento de volumen muscular puede ser debido a un
incremento del tejido conectivo exclusivamente. Es interesante la aplicación deportiva como
agente terapéutico, pues la GH puede aumentar la velocidad de consolidación de las fracturas.
También ha sido utilizada en el tratamiento de osteoporosis primaria y secundaria.
Existen, además de los obvios problemas éticos, aspectos negativos fisiológicos asociados a la
utilización de GH por competidores sanos. La acromegalia es un fenómeno insidioso e
irreversible por el uso excesivo de esta hormona. En los casos de atletas víctimas de sus efectos,
se produce la modificación de la fisonomía: el aumento de la densidad ósea del rostro (facies
leonina), de las manos y de los pies. Es decir que como ya se ha producido el cierre de los
cartílagos de crecimiento, este solo puede tener fenómenos acrales. Crecen en largo los huesos
de las extremidades además de engrosarse (maxilar inferior, huesos de la mano). Se producen
aumento del tamaño de las vísceras. El páncreas se ve afectado y los pacientes se tornan
diabéticos.
Lo importante…
Los factores de crecimiento, en especial, el sistema IGF-I, son los responsables del
crecimiento muscular provocado por daño muscular inducido por ejercicio.
El aumento de IGF-I plasmático por administración exógena de GH o IGF-I estimulan la
hipertrofia de las miofibras asociadas a carga mecánica sobre el músculo.
La inducción de IGF-I exógena directamente en el músculo esquelético aumenta la masa
muscular.
La actividad muscular de la IGF-I es independiente de los cambios en la IGF-I
plasmática, lo que hace que éste último no sea considerado un buen marcador de la
actividad intrínseca (local) del sistema GH/IGF-I.
La activación del sistema hormonal IGF-I requiere de la modulación por medio de cargas
de la eficacia de hormonas en los músculos ejercitados para la respuesta hipertrófica.
Las respuestas musculares del sistema IGF-I parecen ser más sensibles a la acción
excéntrica, debido al daño muscular y su regeneración.
La isoforma MGF de la IGF-I es estimulada marcadamente en respuesta a un
estiramiento y/o sobrecarga grande sobre el músculo.
La IGF-I actúa de manera autócrina (estimulación directa de la síntesis de proteínas
miofibrilares) y parácrina (proliferación, diferenciación y fusión de células satélite).
Existe una relación entre la restricción calórica y/o excesivo gasto calórico (por ejercicio)
y los niveles de IGF-I circulantes, disminuyendo éstos últimos cuando aumentan
aquéllos.
La suplementación de hidratos de carbono y aminoácidos, combinados con entrenamiento
con pesas, aumentan los niveles circulantes de IGF-I.
BIBLIOGRAFIA
Adams GR. (2002). Exercise effects on muscle insulin signaling and actions, Invited Review:
autocrine/paracrine IGF-I and skeletal muscle adaptation. J Appl Physiol, 93:1159-1167.
Badillo González JJ. (1998). Fundamentos del entrenamiento de la fuerza. Barcelona: INDE.
Bamman MM. (2001). Mechanical load increases muscle IGF-I and androgen receptor mRNA
concentrations in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab, 280:E380-E390.
Coyle EF. (2000). Physical activity as a metabolic stressor. Am J Clin Nutr, 72S: 512s-520s.
Fiatarone Singh MA. (1999).Insulin-like growth factor I in skeletal muscle after weight-lifting
exercise in frail elders. Am J Physiol Endocrinol Metab, 277 (40): E135-E143.
Florini JR. (1996). Growth hormone and the insulin-like growth factor system in myogenesis.
Endocrine Reviews, 17(5): 481-517.
Grounds MD. (2002). Reasons for the degeneration of ageing skeltal muscle a central role for
IGF-1 signalling. Biogerontology, 3:19-24.
Häkkinen K. (2001). Selective muscle hypertrophy, changes in EMG and force, and serum
hormones during strength training in older women. J Appl Physiol, 91: 569-58.
Jenkins PJ. (2001). Growth hormone and exercise: physiology, use and abuse. Growth Hormone
and IGF Research, 11S:S71-77.
Sonksen PH. (2001). Hormones and sport. Insulin, growth hormone and sport. Journal of
Endocrinology, 170:13-25.
Takarada Y. (2000). Rapid increase in plasma growth hormone after low-intensity resistance
exercise with vascular occlusion. J Appl Physiol, 88: 61-65.
Van Cauter E y Copinschi G. (2000). Interrelationships between growth hormones and sleep.
Growth Hormone and IGF Research, 10S: S57-S62.