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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
“MODULACIÓN SEROTONÉRGICA DE LA VÍA ESTRIADO-PALIDAL
Y SU EFECTO SOBRE LA ACTIVIDAD ELÉCTRICA
DE LAS NEURONAS DEL GLOBO PÁLIDO”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS EN INVESTIGACIÓN EN MEDICINA
PRESENTA
M. EN C. ALDO OVIEDO CHÁVEZ
DIRECTOR DE TESIS:
DR. ENRIQUE QUEREJETA VILLAGÓMEZ
MÉXICO, D.F.
ÍNDICE.
Página
RESUMEN.
1
ABSTRACT.
3
CAPÍTULO 1. ANTECEDENTES.
5
1.1. Ganglios basales.
5
1.2. Papel funcional del Globo pálido.
6
1.3. Modificaciones en la actividad de las neuronas del Globo
pálido por alteraciones en la vía estriado-palidal.
9
1.4. Papel de la serotonina en la actividad de las neuronas del
Globo pálido.
10
1.5. Receptor 5-HT1B en el Globo pálido.
11
1.6. Presencia de otros receptores serotonérgicos en el Globo pálido.
13
1.7. Implicación del receptor 5-HT1B en algunas patologías.
16
CAPÍTULO 2. HIPÓTESIS.
17
CAPÍTULO 3. OBJETIVO GENERAL.
17
CAPÍTULO 4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
17
CAPÍTULO 5. MATERIAL Y MÉTODO.
19
5.1. Sujetos experimentales.
19
5.2. Registro extracelular del Globo pálido bajo estimulación estriatal.
19
5.2.1. Preparación quirúrgica.
19
5.2.2. Adquisición de datos y análisis.
20
5.3. Registro extracelular del Globo pálido.
21
5.3.1. Preparación quirúrgica.
21
5.3.2. Adquisición de datos y análisis.
22
5.4. Lesión del estriado.
22
5.4.1. Preparación quirúrgica.
22
5.4.2. Prueba conductual.
23
5.4.3. Registro extracelular del Globo pálido en ratas
con lesión estriatal.
23
5.5. Pruebas histológicas.
23
5.6. Drogas utilizadas.
24
CAPÍTULO 6. RESULTADOS.
6.1. Representación esquemática de la difusión intrapalidal de drogas.
26
26
6.2. Respuestas de las neuronas del Globo pálido evocadas por la
estimulación química o eléctrica del estriado.
27
6.2.1. Efecto palidal evocado por la estimulación química
estriatal.
27
6.2.2. Efecto palidal evocado la estimulación eléctrica
del estriatal.
30
6.2.3. Efecto del bloqueo local de los receptores AMPA/kainato
sobre el disparo palidal bajo la estimulación eléctrica estriatal.
30
6.3. Respuesta de las neuronas del Globo pálido evocada por la
infusión local de fluoxetina.
33
6.4. Respuesta de las neuronas del Globo pálido evocada por la
infusión local de serotonina.
35
6.5. Respuesta de las neuronas del Globo pálido evocada por la
infusión local de agonistas y antagonistas selectivos de receptores
serotonérgicos.
37
6.5.1. Efecto de la infusión local de 8-OH-DPAT y WAY-100635
sobre la frecuencia de disparo de las neuronas del Globo pálido. 37
6.5.2. Efecto de la infusión local de L-694,247 sobre la
frecuencia de disparo de las neuronas del Globo pálido.
39
6.5.3. Efecto de la infusión local de methiothepina sobre
la frecuencia de disparo de las neuronas del Globo pálido.
42
6.5.4. Efecto de la infusión local de methiothepina sobre
la respuesta excitatoria de disparo evocada por L-694,247
en las neuronas del Globo pálido.
42
6.6. Respuesta de las neuronas del Globo pálido evocada por la
infusión local de serotonina en ratas con lesión estriatal unilateral.
6.6.1. Conducta de giro en ratas con lesión estriatal unilateral.
44
44
6.6.2. Efecto de la infusión local de serotonina sobre la
frecuencia de disparo de las neuronas del Globo pálido
en ratas con lesión estriatal unilateral.
44
CAPÍTULO 7. DISCUSIÓN.
46
CAPÍTULO 8. CONCLUSIONES.
57
CAPÍTULO 9. BIBLIOGRAFÍA.
58
CAPÍTULO 10. ANEXO.
74
RESUMEN
En el presente trabajo analizamos el efecto regulador de la serotonina en la
actividad de la vía estriado-palidal en el disparo espontáneo de las neuronas del
GP registradas in vivo en la rata. Las conexiones reciprocas entre el globo pálido
(GP) y otros núcleos que conforman a los ganglios basales señalan que el GP es
un núcleo fundamental en la actividad neuronal de los ganglios basales. La
actividad de las neuronas del GP está determinada por aferencias que involucran
al cuerpo estriado. Se estudió la contribución de la activación química o eléctrica
de la transmisión GABAérgica estriatal en la actividad de disparo de las neuronas
del GP. Tanto la estimulación química o eléctrica del cuerpo estriado causó una
significativa disminución de la frecuencia de disparo en neuronas del GP. Sin
embargo, la estimulación química del estriado produjo una completa inhibición del
disparo en la mayor parte de las neuronas del GP, algo no observado con la
estimulación eléctrica. Además, la estimulación química del estriado con NMDA
evocó un incremento en la frecuencia de disparo después de la inhibición; un
efecto que no fue observado bajo la infusión de glutamato o estimulación eléctrica.
Sin embargo, el bloqueo intrapalidal selectivo de los receptores glutamatérgicos
AMPA/kainato facilita el efecto inhibitorio de la estimulación eléctrica intraestriatal.
Por otra parte, varios trabajos han mostrado que el GP tiene la más alta densidad
de receptores 5-HT1B en el telencéfalo. Sin embargo, el papel de estos receptores
en el disparo de las neuronas del GP in vivo es desconocido. En el presente
trabajo, se realizaron registros extracelulares unitarios en la rata anestesiada para
analizar cambios en la frecuencia de disparo de las neuronas del GP evocadas por
la activación y el bloqueo local de los receptores 5-HT1B. La administración
intrapalidal de la serotonina, o el inhibidor de la recaptura de serotonina, la
fluoxetina produjo predominantemente un efecto excitatorio en la frecuencia de
disparo basal de las neuronas del GP. El agonista de las receptores 5-HT1B, el L694,247 causó un efecto excitatorio dosis-respuesta en muchas neuronas
palidales registradas. El bloqueo de los receptores 5-HT1B por la aplicación
intrapalidal de methiothepina causó inhibición en la frecuencia de disparo de las
1
neuronas del GP. Sin embargo, la methiothepina disminuyó el efecto excitatorio
evocado por L-694,247. Además, la serotonina local no evocó cambios
significativos en la frecuencia de disparo basal de neuronas del GP en ratas de
lesión estriatal unilateral. Estos resultados sugieren que los receptores
serotonégicos 5-HT1B contribuyen con el control del disparo de las neuronas del
GP y están probablemente localizados en la vía estriado-palidal.
2
ABSTRACT
In the present thesis, it was analized the effect of the serotonin in the regulation of
the striato-pallidal pathway in the spiking of the neurons of the globus pallidus
recording in vivo in the rat brain. The reciprocal connections between the GP and
other basal ganglia nuclei indicate that the GP plays a significant role in controlling
the neuronal activity of the entire basal ganglia; in turn, the activity of GP neurons
is controlled by several major inputs that involve the striatum. Here, we determined
the relative contributions of the selective (chemical) or massive (electrical)
activation of the striatal GABAergic transmission to the GP spiking activity. Both
chemical and electrical stimulation of the striatum caused a significant GP spike
rate reduction; however, chemical stimulation of the striatum produced a complete
firing arrest on most GP neurons, something not seen with electrical stimulation. In
addition, chemical stimulation of the striatum with NMDA evoked a significant longlasting post-inhibitory spike rate increase, an effect that was not seen under
glutamate infusion or electrical stimulation. Furthermore, the selective intrapalidal
blockade of AMPA/kainate glutamate receptors facilitates the inhibitory effect of
intrastriatal electrical stimulation. Our results suggest a differential effect of
electrical or chemical stimulation of the striatum on the spiking activity of GP
neurons, which involves the activation of intrapallidal AMPA/kainate receptors and
striatal en passant fibers. On the other hand, several works have shown that the
GB contains the highest density of 5-HT1B receptors within the encephalon.
However, the role of these receptors in the spiking of GP neurons in vivo is
unknown. In the present work, we use single-unit extracellular recordings in the
anesthetized rat to analyze changes in the firing rate of GP neurons evoked by
local activation and blockade of 5-HT1B receptors. Intrapallidal administration of
serotonin, or the serotonin uptake inhibitor fluoxetine, predominantly produced an
excitatory effect in the basal firing rate of GP neurons. The 5-HT1B receptor
agonist, L-694,247, caused a dose-dependent excitatory effect on most palidal
neurons tested. Blockade of 5-HT1B receptors by intrapalidal application of
methiothepina predominantly caused inhibition in GP neurons firing rate. Moreover,
3
methiothepin diminished the excitatory effect evoked by L-694,247. Furthermore,
local serotonin did not evoke significant changes in the basal firing rate of GP
neurons in unilateral striatal lesioned rats. Taken all together, these results suggest
that serotonin 5-HT1B receptors significantly contribute to the control of spiking of
the rat GP neurons, and that the 5-HT1B receptors exerting this control are most
likely localized in the striato-pallidal pathway.
4
1. ANTECEDENTES.
1.1. GANGLIOS BASALES.
Los ganglios basales son un conjunto de núcleos subcorticales que han sido
intensamente estudiados en las últimas décadas por su relación con el control del
movimiento
(Albin
et
al.,
1989).
Estas
estructuras
encefálicas
están
interconectadas y son las siguientes: estriado, globo pálido (GP), núcleo
subtalámico (NST) y sustancia nigra (Figura 1). Reciben proyecciones primarias
de la corteza cerebral y envían sus eferencias vía el tálamo a la corteza prefrontal,
premotora y motora (Alexander y Crutcher 1990).
Figura 1. Diagrama esquemático de un corte coronal del encéfalo que muestra a
5
los ganglios basales (Adaptado de Kandell et al., 2000).
Las anomalías en los ganglios basales pueden originar disminución del
movimiento, como en la enfermedad de Parkinson (Blandini et al., 2000) o
provocar movimientos excesivos, como en la enfermedad de Huntington (Enna et
al., 1976; Chesselet y Delfs, 1996). Es bien sabido que la más consistente
neuropatología encontrada en la enfermedad de Parkinson es la degeneración de
las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra compacta (SNc) (Filion y
Tremblay, 1991), a pesar de que también se ha encontrado que existe una
disminución en el número de neuronas serotonérgicas en los núcleos del rafe
(Halliday et al., 1990). Por otro lado, los cambios neuropatológicos más marcados
en la enfermedad de Huntington ocurren en estriado y GP. Las alteraciones más
notables en estas áreas son la pérdida de neuronas GABAérgicas (Bird et al.,
1973; Bird y Iversen, 1974).
1.2. PAPEL FUNCIONAL DEL GLOBO PÁLIDO.
El GP en roedores (o globo pálido externo en primates), compuesto de una red de
neuronas de proyección que usan principalmente GABA como neurotransmisor
(Fonum et al., 1978), es considerado como el integrador central de la
neurotransmisión de los ganglios basales (Parent y Hazrati, 1995b). Es un núcleo
clave involucrado en el procesamiento de información en el circuito de los ganglios
basales (DeLong y Crutcher, 1985). A través de fibras GABAérgicas de proyección
(Kita y Kitai, 1994; Bevan et al., 1998), las neuronas del GP modulan la actividad
en todos los núcleos de este sistema motor (Kita, 1994).
Existe una diversidad de receptores a nivel del GP cuya activación modifica la
actividad eléctrica de sus neuronas. Destacan los receptores GABA(A) y GABA(B)
(Richards et al., 1987; Chen et al., 2002; Chen et al., 2004; Kita et al., 2006),
AMPA/kainato (Paquet y Smith, 1996; Jin et al., 2006), NMDA (Bernard and
Bolam, 1998), y glutamatérgicos metabotrópicos del grupo I, ll y III (Matsui y Kita,
2003; Poisik et al., 2005).
6
La actividad eléctrica de las neuronas del GP depende en gran medida de las
conexiones que tiene con otros núcleos. A continuación enumeraremos las
principales aferencias y eferencias:
Aferencias:
1. Una de las principales proyecciones aferentes al GP proviene del estriado. La
mayor población celular del estriado (90-95%) está compuesta por neuronas
espinosas medianas de proyección que usan GABA como neurotransmisor (Kita y
Kitai, 1988). Dentro de estas neuronas de proyección, además de liberar GABA,
se liberan encefalinas (Alexander y Crutcher, 1990). El estriado es la principal
estructura de entrada de información al circuito de los ganglios basales. La mayor
aferencia al estriado es excitadora y está dada por las proyecciones
glutamatérgicas de casi todas las áreas corticales (McGeorge y Faull, 1989).
2. Otra de las principales proyecciones aferentes al GP provienen del NST. Las
neuronas del NST son glutamatérgicas y son las únicas proyecciones excitadoras
de los ganglios basales descritas hasta ahora (Smith y Parent, 1988; Parent et al.,
2000).
3. El GP recibe proyecciones dopaminérgicas de la sustancia nigra compacta
(Smith y Kieval, 2000).
4. Se ha encontrado que el GP recibe una alta inervación serotonérgica que
proviene del núcleo rafe dorsal (NRD) (Palkovits et al., 1974; Parent et al., 1995).
Eferencias:
1. El GP envía una proyección masiva GABAérgica a todo el NST (Carpenter et
al., 1981; Smith et al., 1998).
2. Las neuronas del GP proyectan a los núcleos de salida de los ganglios basales,
la sustancia nigra reticular y el globo pálido interno (núcleo entopeduncular)
(Parent et al., 2000).
3. El GP proyecta también a sí mismo por medio de colaterales recurrentes
GABAérgicas (Ogura y Kita, 2000; Kita et al., 2006).
7
4. Algunas neuronas palidales envían colaterales al estriado (Kita y Kita, 2001).
Por otra parte, debido a las propiedades de membrana las neuronas del GP
producen espontáneamente potenciales de acción tanto in vivo como in vitro
(DeLong, 1971; Nakanishi et al., 1985; Cooper y Stanford, 2000).
Registros extracelulares unitarios de neuronas palidales en ratas anestesiadas,
han caracterizado dos tipos de neuronas en base a sus distintas formas de ondas
extracelulares bifásicas: 1). Neuronas tipo l, su primera deflexión es hacia abajo y
la segunda es hacia arriba (onda negativa/positiva). 2). Neuronas tipo II, cuya
primera
deflexión
es
hacia
arriba
y
la
segunda
hacia
abajo
(onda
positiva/negativa). Las diferentes formas de ondas extracelulares son productos
complejos dependientes de varios factores, incluyendo el tamaño y la forma de las
neuronas individuales, geometría celular y la localización, la orientación y las
propiedades eléctricas del electrodo de registro, como su resistencia (Kelland et
al., 1995).
Se ha propuesto que la conexión reciproca GP-NST podría actuar como un
marcapaso central de los ganglios basales (Plenz y Kital, 1999).
El hecho de que la administración intrapalidal de un antagonista GABA(A)
aumente el disparo neuronal, sugiere que las células palidales están bajo un tono
GABAérgico constante (Querejeta et al., 2001).
Una de las funciones del NST es retransmitir la actividad cortical a otras
estructuras de los ganglios basales. Registros extracelulares in vivo han
comprobado el papel de las aferencias glutamatergicas corticales descendentes
ya que su activación favoreció la generación de disparos rítmicos en las neuronas
del NST y GP. La actividad rítmica en las neuronas del NST y GP se pierde
cuando la corteza se inactiva. Estos datos indican el papel de las aferencias
glutamatérgicas corticales en la generación de los disparos rítmicos en la red GP8
NST (Kita et al., 2004).
Mediante registros intracelulares in vitro en rebanadas palidales de ratones se
mostró que las neuronas del GP presentaron actividad espontánea, a pesar de
que la aferencia sináptica excitatoria del NST no estaba presente en la
preparación. Los canales catiónicos no selectivos activables por hiperpolarización
y por nucleótido cíclico (HCN) hacen una importante contribución a este proceso:
su bloqueo con ZD7288 significativamente disminuyó la frecuencia de descarga y
decrementó su regularidad. La activación transitoria de la entrada GABAérgica
estriatal a las neuronas palidales conduce a un reiniciamiento de la actividad
marcapaso que es dependiente de corrientes HCN. Estos estudios muestran que
los canales HCN en neuronas GABAérgicas palidales son determinantes clave de
la regularidad y la frecuencia del marcapaso tan bien como, el reiniciamiento
estriatal de esta actividad (Chan et al., 2004).
1.3. MODIFICACIONES EN LA ACTIVIDAD DE LAS NEURONAS DEL GP POR
ALTERACIONES EN LA VÍA ESTRIADO-PALIDAL.
Se ha reportado que la actividad de la vía estriado-palidal está alterada en
condiciones patológicas (Robertson et al., 1991), y por lo tanto la actividad de las
neuronas palidales está también modificada (Filion y Tremblay, 1991; Querejeta et
al., 2005).
La perdida de la inervación dopaminérgica estriatal en la enfermedad de
Parkinson, conduce a la subsecuente sobreactividad de la vía estriado-palidal,
dado que se ha mostrado un incremento en la liberación de GABA en el GP de
primates tratados con MPTP (Robertson et al., 1991).
La depleción de dopamina por lesión unilateral de la vía nigroestriatal con 6hidroxidopamina en ratas disminuye la frecuencia de disparo de las neuronas del
GP (Pan y Walters, 1988).
9
1.4. PAPEL DE LA SEROTONINA EN LA ACTIVIDAD DE LAS NEURONAS
DEL GP.
La serotonina es una monoamina que se forma en los sistemas biológicos a partir
del aminoácido L-triptófano. A nivel del SNC, las neuronas serotonérgicas se han
encontrado únicamente en los núcleos del rafe (Dahlströn y Fuxe, 1964). Dichos
núcleos están localizados en el tallo cerebral y son el dorsal (NRD), el lineal
caudal, el mediano (NRMn), el magno, el pálido y el oscuro. En particular el NRD,
contiene el más alto número de las neuronas serotonérgicas (50-60%) del cerebro
(Wiklund et al., 1981) y además, contiene la más alta concentración de serotonina
(Aghajanian et al., 1973; Palkovits et al., 1974; Steinbusch y Nieuwenhuys, 1983).
Los núcleos del rafe proyectan a diferentes estructuras. El GP es uno de los más
grandes blancos del NRD (Azmitia y Segal 1978) (Figura 2).
Figura 2. Diagrama esquemático del SNC que muestra las proyecciones de los
núcleos del rafe a diferentes estructuras. Véase la proyección del NRD al GP
(Adaptado de Baumgarten y Göthert, 2000).
10
Con respecto al papel de la serotonina en el GP enumeraremos los siguientes
datos:
a) Existen pocos estudios de la función de la serotonina en el GP, a pesar de que
se ha mostrado que el GP, además de tener una alta densidad de terminales
nerviosas serotonérgicas (Aghajanian et al., 1973) contiene una alta concentración
de serotonina (Palkovits et al., 1974).
b) En registros extracelulares unitarios realizados en ratas anestesiadas para
analizar la respuesta neuronal del GP a la administración sistémica de agentes
serotonérgicos mostraron que la administración intravenosa de un inhibidor de la
recaptura de 5-HT, fluoxetina, produce una amplia gama de respuestas
(Bergstrom y Walters, 1981).
c) Estudios de lesión de las neuronas 5-HT inducida por la administración del
neurotóxico
5,7-dihidroxitriptamina
(5,7DHT)
en
el
NRD,
muestran
una
disminución en los niveles de serotonina en el GP (Di Cara et al., 2003).
1.5. RECEPTOR 5-HT1B EN EL GP.
Estudios de autoradiografía muestran que la más alta densidad de receptores 5HT1B en el telencéfalo se presenta en el GP (Figura 3A) (Pazos y Palacios 1985;
Waeber et al., 1989; Sari et al., 1997; Sari et al., 1999; Riad et al., 2000; Varnas et
al., 2004).
El receptor 5-HT1B se expresa en roedores pero no en otras especies de
mamíferos (Waeber et al., 1989). En cambio, el receptor 5-HT1D está expresado
en primates pero está ausente en roedores (Waeber et al., 1989). Sin embargo,
diferentes estudios han determinado que los receptores 5HT1D y 5HT1B son
homólogos y que tienen funciones similares en especies (Hoyer y Middlemiss,
1989; Waeber et al., 1989; Adham et al 1991).
En el GP la inmunoreactividad del receptor 5-HT1B se asocia con terminales
11
axónicas (Sari et al., 1999; Riad et al., 2000). Por otra parte, el más alto nivel de
expresión de mRNA del receptor 5-HT1B se encuentra en las neuronas
GABAérgicas estriatales de proyección (Figura 4) (Boscher et al., 1994; Bruinvels
et al., 1994; Bonaventure et al., 1998). Dado que no se han mostrado niveles de
expresión de mRNA del receptor 5-HT1B en neuronas del GP (Figura 4), y que la
destrucción de las neuronas estriatales espinosas medianas con ácido kaínico
reduce la densidad de receptores 5-HT1B palidales (Figura 3B), se infiere que el
receptor 5-HT1B está localizado presinápticamente en la terminal estriado-palidal
(Bruinvels et al., 1994; Sari et al., 1997; Sari et al., 1999).
Figura 3. Marcaje autoradiográfico de los receptores 5-HT1B en un corte coronal
del encéfalo. A) Muestra la alta densidad de receptores 5-HT1B en el GP; B)
Muestra la disminución del marcaje de los receptores 5-HT1B en el GP en una
rata que se ha abatido el cuerpo estriado selectivamente con ácido kaínico
(Adaptado de Sari et al., 1999).
12
Figura 4. Autoradiograma obtenido por hibridización in situ de la localización del
mRNA de los receptores 5-HT1B en un corte coronal del encéfalo. Muestra la alta
expresión de mRNA de los receptores 5-HT1B en el estriado. Además, se puede
observar la ausencia de mRNA de los receptores 5-HT1B en el GP (Adaptado de
Bruinvels et al., 1994).
1.6.
PRESENCIA DE OTROS RECEPTORES SEROTONÉRGICOS EN EL
GLOBO PÁLIDO
Estudios de lesión estriatal con ácido kaínico mostraron una disminución en la
densidad de receptores 5-HT4 en estriado y en el GP. Estos hallazgos expresan,
que los receptores 5-HT4 están presentes en los cuerpos celulares de las
neuronas estriatales de proyección y en las terminales estriado-palidales (Compan
et al., 1996). Sin embargo, también se ha encontrado que la inyección de kainato
en el estriado no modifica el marcaje de receptores 5-HT4 en el GP (Patel et al.,
1995). No obstante, la densidad de receptores 5-HT4 en el GP es baja (Waeber et
al., 1994).
13
Además se han detectado receptores 5-HT7: la caracterización y distribución
anatómica del receptor 5-HT7 ha sido limitada por la carencia de un radioligando
específico (Chen et al., 2008). El 8-OH-DPAT un agonista selectivo de los
receptores 5-HT1A también tiene selectividad para receptores 5-HT7 (Hjorth et al.,
1982). Estudios autoradiográficos en ratones ausentes de receptores 5-HT1A/1B
mostraron una baja densidad de receptores 5-HT7 en el GP (Bonaventure et al.,
2002).
Considerando la ubicación presináptica de los receptores 5-HT1B en las
terminales estriado-palidales a nivel del GP, estudios de liberación en
microdisecciones de GP incubadas con [3H]-GABA en ratas, examinaron si la
activación de los receptores 5-HT1B palidales podría modificar la liberación de
GABA evocada por KCl in vitro. El agonista del receptor 5-HT1B, CP-93129
produjo una inhibición de la liberación de [3H]-GABA evocada por KCl. En ratas
pretratadas con reserpina (s.c.) la aplicación unilateral en el GP del CP 93129
provocó giro contralateral. El pretratamiento intrapalidal de isamoltane inhibió la
conducta de giro inducida por CP-93129. Estos datos sugieren que al menos
algunos receptores 5-HT1B funcionan como heteroreceptores en el GP,
reduciendo la liberación de GABA de las neuronas estriado-palidal. Además la
activación mediada por CP-93129 de estos receptores en el GP, revierte la
acinesia en las ratas tratadas con reserpina, un modelo de enfermedad de
Parkinson (Chadha et al., 2000).
Apoyando estas observaciones, a nivel de la SNc se ha demostrado que la
activación de receptores 5-HT1B en terminales gabaérgicas disminuye la
liberación de GABA (Johnson et al., 1992).
Vale señalar que el receptor 5-HT1B también tiene función del autorreceptor en
neuronas serotonérgicas (Adell et al., 2001 y 2002).
En base a estas referencias, el receptor 5-HT1B funciona como un autoreceptor
14
de 5-HT en una terminal serotonérgica (Bühlen et al., 1996) y como heteroreceptor
en una terminal no serotonérgica (Hoyer et al., 2002).
En las terminales gabaérgicas las evidencias muestran que ocurre una
disminución en la liberación de GABA durante la activación de receptores 5-HT1B.
Los mecanismos implicados pueden ser los siguientes: Registros intracelulares
han sido realizados en células glioma para estudiar el acoplamiento entre los
receptores 5-HT1B y las corrientes salientes hiperpolarizantes de K+ (Ik). El
agonista de receptores 5-HT1B, sumatriptan incrementó la Ik. Este incremento fue
modificado por la aplicación de un análogo de cAMP permeable a la membrana, el
dibutyryl cAMP como por un potente activador de la adenilil ciclasa, el forskolin.
Además, el incremento en la Ik inducido por sumatriptan, fue prevenido por un
bloqueador del canal de K+ activado por Ca2+, la iberiotoxina y por un bloqueador
no especifico del canal de K+ activado por Ca2+, tetraetilamonio (TEA),
confirmando el involucramiento de canales de K+ activados por Ca2+. Estos
resultados sugieren que el mayor componente de la Ik evocada por sumatriptan es
una corriente de K activada por Ca2+ y es regulada negativamente por cAMP. La
activación de corrientes de K+ disminuye la excitabilidad neuronal, y se produce
una hiperpolarización de membrana. La habilidad de los receptores 5-HT1B para
activar corrientes de K+ dependientes de Ca2+ indica que estos receptores actúan
presinapticamente para inhibir la liberación de neurotransmisores (Le Grand et al.,
1998).
Los receptores 5-HT1B son miembros de la familia de receptores acoplados a
proteínas G (Weinshank et al., 1992). Los receptores 5-HT1B están acoplados
negativamente a la adenilil ciclasa (Zgombick et al., 1993; 1998) y modifican la
actividad de canales tipo N, P/Q de alto voltaje y a canales tipo T (Sun y Dale,
1997; Ravichandra y Joshi, 1999). Por otra parte, los receptores 5-HT1B están
acoplados positivamente a canales de K+ dependientes de Ca2+, a través de
proteínas Gi/o (Zgombick et al., 1993; 1998; Le Grand et al., 1998).
15
1.7. IMPLICACIÓN DEL RECEPTOR 5-HTIB EN ALGUNAS PATOLOGIAS.
Se ha mostrado que la densidad de receptores 5-HT1B es diferente en cada
desorden degenerativo del movimiento: tanto en la enfermedad de Huntington
como en la enfermedad de Parkinson la densidad de los receptores 5-HT1B en el
GP disminuye. Esto significa que la serotonina juega un papel significante en el
control de la actividad palidal en condiciones normales y patológicas (Castro et al.,
1998).
16
2. HIPÓTESIS
Los receptores 5-HT1B del GP contribuyen con el disparo de las neuronas
palidales.
3. OBJETIVO GENERAL
Elucidar el papel de los receptores 5-HT1B palidales sobre la actividad eléctrica de
las neuronas del GP.
4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Registrar la actividad espontánea de neuronas del GP en ratas anestesiadas con
hidrato de cloral.
Determinar la contribución de la vía estriado-palidal en la frecuencia de disparo
espontáneo de las neuronas del GP.
Determinar la presencia de una descarga tónica serotonérgica en el GP y su papel
en el disparo espontáneo de las neuronas palidales.
Determinar el efecto de la serotonina sobre la frecuencia de disparo espontáneo
de las neuronas del GP.
Determinar la participación de los receptores 5-HT1A en las respuestas a
serotonina sobre la frecuencia de disparo de las neuronas del GP.
Estudiar el efecto del bloqueo de los receptores 5-HT1A sobre la frecuencia de
disparo de las neuronas palidales.
Determinar la participación de los receptores 5-HT1B en las respuestas a
17
serotonina sobre la frecuencia de disparo de las neuronas del GP.
Estudiar el efecto del bloqueo de los receptores 5-HT1B sobre la frecuencia de
disparo de las neuronas palidales.
Dilucidar la actividad eléctrica basal de las neuronas del GP en condiciones en las
que previamente se ha abatido el cuerpo estriado ispilateral al sitio de registro.
Determinar el efecto de la serotonina sobre la frecuencia de disparo de las
neuronas del GP en ratas con lesión estriatal unilateral.
18
5. MATERIAL Y MÉTODO.
5.1. SUJETOS EXPERIMENTALES.
Los experimentos fueron realizados en ratas macho de la cepa wistar con peso de
180-230 g. Los animales fueron cuidados y manejados de acuerdo a las normas
aprobadas por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Escuela Superior de
Medicina-IPN. Así mismo se mantuvieron en un medio bajo control de temperatura
con un ciclo luz / oscuridad de 12 horas y libre acceso a alimento y agua.
5.2. REGISTRO EXTRACELULAR DEL GP BAJO ESTIMULACIÓN ESTRIATAL.
5.2.1. Preparación quirúrgica.
Las
ratas
fueron
anestesiadas
con
clorhidrato
de
ketamina
mediante
administración intraperitoneal (i.p.) (dosis inicial 150 mg/kg) además, durante el
tiempo del registro se aplicaron dosis suplementarias de 50 mg/kg i.p. (de acuerdo
al reflejo corneal). Una vez anestesiada, se coloca cuidadosamente en un aparato
estereotáxico (David Kopf). Se colocó y fijó termómetro rectal para monitorear la
temperatura corporal, la cual fue mantenida en 37-38ºC mediante una almohadilla
térmica.
Se realizaron dos trépanos en el cráneo para lograr acceso al cuerpo estriado y al
GP bajo coordenadas de acuerdo a Paxinos y Watson (1998).
Para la estimulación estriatal, se colocó en el estriado un electrodo monopolar de
tungsteno o una cánula de inyección según fuera el caso, en un ángulo de 20º
relativamente al plano coronal, usando las siguientes coordenadas: 4.7 mm
anterior a bregma; 2 mm lateral y 5 mm ventral a duramadre.
La micropipeta de registro fue colocada en el GP en la siguiente posición: 0 mm
19
anteroposterior, 3.2 mm lateral a bregma y 4.5 mm ventral a la superficie del
cerebro. Aun más, se colocó una cánula intrapalidal en las siguientes
coordenadas: 0.8 mm anterior, 5.8 mm lateral y 4.9 mm ventral a la superficie del
cerebro, con un ángulo de 30º con respecto a la micropipeta de registro.
La punta del electrodo de estimulación o la cánula según fuera el caso, estuvieron
separadas de 1.5-2.0 mm de la micropipeta de registro. La distancia entre la
micropipeta de registro y la cánula intrapalidal fue de 150-200 µm.
La aplicación local de sustancias se realizó mediante una bomba de infusión
conectada a la cánula de inyección. La velocidad de aplicación de las sustancias
en el GP fue de 50 nl/15 segundo.
5.2.2. Adquisición de datos y análisis.
Las micropipetas de registro se hicieron de capilares de borosilicato y se llenaron
con una solución de NaCl 2 M; en seguida se midió la resistencia y seleccionamos
las que tuvieron una resistencia eléctrica de 3-6 MΩ.
La señal de la micropipeta de registro fue amplificada 10,000 veces y filtrada entre
300-3000 Hz con un amplificador diferencial (WPI, DAM-80, USA), monitoreada
con un osciloscopio digital (HP 5400B, USA) y almacenada en un dispositivo de
audio. La actividad de disparo palidal fue transferida simultáneamente a una PC a
través de un discriminador de ventana (WPI, WP-121, USA) para el análisis de
datos.
Para los experimentos de estimulación eléctrica, se realizó la supresión del
artefacto simultáneamente con un supresor de artefactos (FHC 40-75-6, ME, USA)
así, la duración del artefacto permaneció menos tiempo que el curso de los
potenciales de acción; cuando el tiempo de supresión del artefacto fue mayor que
el intervalo interespiga sin estimulación eléctrica, o mayor que el intervalo
20
interestímulo, nuestro método fue considerado no satisfactorio y el experimento
fue descartado.
La estimulación eléctrica del estriado (10, 20, 30, 40 y 50 µA, pulsos cuadrados
con una duración de 0.2 ms en 20 Hz de frecuencia por 15 segundos) o
química (100 nl en 30 segundos de glutamato o NMDA 1x10
-9
la
mol en solución
salina) se aplicó después de, por lo menos, 5 minutos de registro basal estable.
Sólo las células cuya frecuencia de disparo espontáneo disminuyó, por lo menos
20%, durante la estimulación fueron seleccionadas para los experimentos.
Se analizaron las respuestas de las células palidales comparando su frecuencia
de disparo durante y después de cada tipo de estimulo con respecto a su actividad
basal. Las comparaciones estadísticas fueron determinadas con la prueba “t” de
Student o ANOVA (con prueba de Newman-Keuls post hoc test) usando un
software comercial estándar (Prism 4.0, GraphPad, USA).
5.3. REGISTRO EXTRACELULAR DEL GP.
5.3.1. Preparación quirúrgica.
Para llevar a cabo estos registros, las ratas fueron anestesiadas con hidrato de
cloral (300 mg/kg i.p.). Se aplicaron dosis suplementarias dependiendo de la
profundidad de la anestesia, estimada por la presencia del reflejo corneal. Una vez
anestesiada, la rata fue colocada cuidadosamente en un aparato estereotáxico
(David Kopf). Un sistema de almohadilla térmica y termómetro rectal fue colocado
y empleado para mantener y monitorear la temperatura corporal entre 36-38ºC. Se
realizó un trepano de 4 mm de diámetro en el cráneo para permitir la guía
estereotáxica de la micropipeta de registro y del sistema cánula doble en el GP
derecho.
La micropipeta de registro fue colocada en la siguiente posición: 0.2 mm posterior
21
a bregma, 3.0–3.3 mm lateral a bregma y de 4-6 mm ventral a la superficie del
cerebro. El sistema cánula doble fue colocado con un ángulo de 70º en dirección
latero-medial, en las siguientes coordenadas: 1.1 mm posterior a bregma, 5.7 mm
lateral y 5.6 mm ventral a la superficie del cerebro (Paxinos y Watson, 1998).
5.3.2. Adquisición de datos y análisis.
La actividad unitaria se aisló mediante un discriminador de ventana (WPI-121), los
tiempos del disparo se preprocesaron simultáneamente y aun más se analizaron
después usando el programa de registro INF386 (Soto y Vega, 1987).
Para la aplicación de drogas, solamente se eligieron neuronas con disparo basal
estable de 8 minutos. Un cambio del 20% de la frecuencia de disparo basal,
durante el minuto próximo a la infusión de la droga fue considerado significativo. El
análisis estadístico se realizó con la prueba “t” de Student y ANOVA (con prueba
de Newman-Keuls post-hoc test) por medio del software Graph Pad Prism.
5.4. LESIÓN DEL ESTRIADO.
5.4.1. Preparación quirúrgica.
Se usaron dos grupos de ratas Wistar macho, uno con lesión del cuerpo estriado y
otro sin lesión (control). Las lesiones estereotáxicas unilaterales del estriado
fueron hechas en ratas Wistar machos (160-170 g de peso) anestesiadas con
hidrato de cloral (300 mg/kg i.p.). Una vez anestesiadas fueron colocadas en un
aparato estereotáxico (David Kopf). Se realizó un trepano de 2 mm de diámetro
para permitir la guía estereotáxica de una cánula de inyección de calibre 30 en el
estriado derecho. Las coordenadas estereotáxicas para el estriado fueron: 1.30
mm anterior a bregma, 3.00 mm lateral a la línea media y 4.80 mm ventral a
duramadre (Paxinos y Watson, 1998). Se conectó cánula de inyección a una
jeringa Hamilton manual de 5µl, a través de una micomanguera de polietileno. Se
22
infundió un total de 1µl (120 nmol) de ácido quinolínico en un tiempo de 4 minutos.
Al final de la infusión manual la cánula, fue dejada en el lugar por 5 minutos más,
para perfeccionar la liberación de la solución y, finalmente, se suturó la incisión. El
ácido quinolínico se disolvió primeramente en NaOH 4M y subsecuentemente se
tituló con HCl 1N hasta un pH 7.4. El grupo control se preparó usando el mismo
procedimiento pero sin lesión. Para lo cual se infundió un total de 1µl de solución
salina 0.9% en el estriado derecho. Las ratas se dejaron recuperar por 7-10 días,
posteriores a los cuales se efectuaron las pruebas conductuales.
5.4.2. Prueba conductual.
Con la finalidad de evaluar conductualmente el efecto de la lesión estriatal, 10 días
después de la infusión intraestriatal de ácido quinolínico, se realizó conducta de
giro. Para lo cual, se administró D-amfetamina (1mg/kg i.p.), y se cuantificó el
número de giros ipsilaterales de 360º. Sólo las ratas que mostraron más de 15
giros/10 minutos se consideraron como ratas lesionadas y aun más fueron
utilizadas para los registros extracelulares del GP unilateral. El grupo control se
trató de la misma manera.
5.4.3. Registro extracelular del GP en ratas con lesión estriatal.
Los registros extracelulares de neuronas del GP ipsilaterales de tanto las ratas
lesionadas y como del grupo control, se realizaron 7 días después del análisis de
conducta de giro. Los registros extracelulares del GP se realizaron como
previamente se describió.
5.5. PRUEBAS HISTOLÓGICAS.
Al final de cada sesión de registro extracelular, se marcó el área de registro
mediante inyección de azul cielo de pontamina, contenida en el electrodo, usando
una corriente constante negativa de 10 µA durante 20 minutos. En seguida, las
23
ratas se sacrificaron mediante una sobredosis de pentobarbital; a continuación se
perfundieron con solución de formaldehido 4%, se removió el cerebro y dejó fijar
por toda la noche. Para verificar las posiciones del electrodo de registro y las
cánulas de inyección los cerebros fueron rebanados, utilizando un vibratomo.
Cuando el electrodo de registro o las cánulas de inyección no estuvieron
posicionados en el GP, los experimentos se descartaron. Al mismo tiempo, se
evaluó la lesión estriatal mediante la comparación del área del ventrículo lateral
derecho respecto al área del ventrículo lateral izquierdo.
5.6. DROGAS UTILIZADAS.
Todas las soluciones se prepararon previa e inmediatamente a su empleo. Se usó:
5-HT, 5-Hydroxytryptamine: Agonista no selectivo (Sigma-RBI). Disuelto en salina
0.9%. Volumen inyectado 100nl.
L-694247: Agonista selectivo 5-HT1B (Sigma-RBI). Disuelto en salina 0.9%.
Volumen inyectado 100nl.
8-OH-DPAT: Agonista de receptores 5-HT1A/7 (Research Biochemicals). Disuelto
en solución salina 0.9%. Volumen inyectado 100nl.
WAY100635: Antagonista selectivo de receptores 5-HT1A (Sigma-RBI). Disuelto
en solución salina 0.9%. Volumen inyectado 100nl.
Methiothepin Mesylate: Antagonista de receptores 5-HT1 (Sigma-RBI). Disuelto en
solución salina 0.9%. Volumen inyectado 100nl.
Fluoxetina HCl: Inhibidor de recaptura de 5-HT (Psicofarma S. A., México).
Disuelto en solución salina 0.9%. Volumen inyectado 100nl.
24
Ácido quinolínico (2,3-Pyridinedicarboxylic acid): Agonista Glu: (Aldrich Chem.
Co.) 0.25 M. Disuelto en NaOH 4M y ajustado a pH 7.4. Volumen inyectado 1 µl.
NMDA: Agonista selectivo de receptores NMDA (Sigma-RBI). Disuelto en solución
salina 0.9%. Volumen inyectado 100nl.
Glutamato: Agonista no selectivo de receptores glutamatérgicos (Sigma-RBI).
Disuelto en solución salina 0.9%. Volumen inyectado 100nl.
DNQX: Antagonista selectivo de receptores AMPA/kainato (Sigma-RBI). Disuelto
en solución salina 0.9%. Volumen inyectado 100nl.
25
6. RESULTADOS.
6.1.
REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA DIFUSIÓN INTRAPALIDAL
DE DROGAS.
Habitualmente, la superficie intrapalidal calculada para la difusión de drogas es de
aproximadamente 0.95 ± 0.03 mm de diámetro. Por lo tanto, solamente las
neuronas registradas dentro de un radio de 470 ± 30 µm tomando como centro de
referencia la punta de las cánulas de inyección, fueron consideradas para el
análisis (Figura 5A y B).
A
B
Figura 5. Esquema que muestra localización del registro del GP y la difusión
intrapalidal de la droga. (A) Área de difusión máxima corte transversal (en gris
claro) de una inyección intrapalidal de 100 nl de solución. (B) Verificación
histológica de los sitios de registro del GP. Las líneas vertical y la angulada 70º en
A y B representan las trayectorias del electrodo de registro y de las cánulas de
infusión, respectivamente.
26
Todas las neuronas registradas fueron tipo II como refiere Kelland et al. (1995),
con una frecuencia de disparo promedio de 23.9 ± 1.7 potenciales de
acción/segundo (rango 3-63 Hz) y una amplitud promedio de la espiga de 754.03 ±
128.13 µV.
6.2.
RESPUESTAS DE LAS NEURONAS DEL GP EVOCADAS POR LA
ESTIMULACIÓN QUÍMICA O ELÉCTRICA DEL ESTRIADO.
6.2.1.
EFECTO PALIDAL EVOCADO POR LA ESTIMULACIÓN QUÍMICA
ESTRIATAL.
Para determinar la importancia de la vía estriado-palidal en la actividad eléctrica
del GP, en primer lugar se estudió el efecto de la activación química de esta vía en
la frecuencia de disparo de las neuronas palidales mediante la infusión
intraestriatal de glutamato (1nmol).
Estos resultados muestran que 10 de 11 neuronas examinadas (83%), mostraron
una disminución en la frecuencia de disparo; es decir 95 ± 3.06% con respecto a
la basal, durante y después de la infusión intraestriatal de glutamato (Fig. 6A, C). 7
de esas 10 neuronas (70%) mostraron un cese completo de la actividad de
disparo y las 3 neuronas restantes mostraron una inhibición del 83 ± 6.88%,
ambas respecto a la basal.
Asi mismo, la infusión intraestriatal de NMDA (1nmol) produjo una inhibición del
96.83 ± 2.92% en 9 de 11 neuronas palidales examinadas (82%) (Figura 6B y C).
Además, 7 de 9 de esas neuronas (78%) presentaron una inhibición total del
disparo; la inhibición en las 2 neuronas restantes no presentó un cese completo de
la actividad (78.5 ± 5.25% de la basal).
27
Al comparar estos efectos no se observa diferencias significativas entre el efecto
inhibitorio de glutamato y NMDA (Figura 6C); sin embargo, la duración de esta
inhibición palidal si fue estadísticamente diferente (Figura 6D). Esto es mientras
que la infusión estriatal de glutamato causó una inhibición que duró 18.66 ± 3.78
segundos, la inhibición evocada por NMDA fue de 49 ± 8.18 segundos (P<0.05).
Otra diferencia significativa observada fue la recuperación de la frecuencia de
disparo basal después de la inhibición. Las neuronas bajo el efecto de la infusión
estriatal de NMDA incrementaron su frecuencia de disparo por 136.75 ± 14% de la
basal después de la infusión de la droga (Figura 6B), donde las células con
inhibición inducida por glutamato recuperaron un 97.5 ± 0.5% con respecto al
disparo basal antes de la infusión de glutamato (Figura 6A). La infusión estriatal de
salina (n=5) no tuvo efecto en la frecuencia de disparo espontáneo de las
neuronas del GP.
28
Figura 6. Efecto de la estimulación química del estriado por glutamato y NMDA
sobre la frecuencia de disparo espontáneo de las neuronas del GP. (A) La
aplicación intraestriatal de glutamato (1 nmol) produce una significativa inhibición
de la frecuencia de disparo palidal. En la gráfica se muestra un registro con dos
aplicaciones intraestriatales de glutamato. (B) La aplicación intraestriatal de NMDA
(1 nmol) causa una inhibición completa en la frecuencia de disparo de las células
palidales. En la gráfica se muestra un registro con dos aplicaciones intraestriatales
de NMDA. Nótese el incremento significativo en la actividad de disparo después
de la inhibición inducida por NMDA. (C) y (D) Muestran la estadística del efecto de
la estimulación química estriatal. (C) Muestra que el efecto inducido por glutamato
y NMDA no es estadísticamente significativo. (D) Muestra que la duración de la
inhibición de las neuronas del GP inducida por NMDA es mayor y
significativamente diferente a la inducida por glutamato. *P < 0.05. El fondo gris
indica un intervalo de confianza.
29
6.2.2.
EFECTO PALIDAL EVOCADO POR LA ESTIMULACIÓN ELÉCTRICA
ESTRIATAL.
Al estudiar el disparo de respuesta de las neuronas del GP a diferentes
intensidades de estimulación eléctrica aplicadas al cuerpo estriado, se encontró
que la frecuencia de disparo espontáneo de todas las neuronas examinadas
disminuyó de una manera dependiente de la intensidad de estimulación (n=11,
Figura 7A). Las intensidades de estimulación eléctrica de 10, 20 y 30 µA,
disminuyeron la frecuencia de disparo de las neuronas del GP 21.3 ± 7.6%, 39.1 ±
8.3% y 68.6 ± 5.1%, respectivamente. Por otra parte, la estimulación con 40 y 50
µA causó una inhibición de 87.0 ± 6.2% y 91.0 ± 3.3%, respectivamente. Cuando
se comparó a las amplitudes de estimulación, la respuesta palidal a la
estimulación eléctrica estriatal con intensidades de 40 y 50 µA fue diferente
estadísticamente de 10, 20 y 30 µA. No obstante, no hubo diferencia
estadísticamente significativa entre las estimulaciones 40 y 50 µA.
Ahora bien, comparados ambos tipos de estimulación estriatal, la estimulación
eléctrica no evocó una completa inhibición de la actividad de las neuronas
palidales (Figura 7A), como la estimulación química. La inhibición palidal evocada
por la estimulación eléctrica duró tan sólo el tiempo de la estimulación.
6.2.3.
EFECTO
DEL
BLOQUEO
LOCAL
DE
LOS
RECEPTORES
AMPA/KAINATO SOBRE EL DISPARO PALIDAL BAJO LA ESTIMULACIÓN
ELÉCTRICA ESTRIATAL.
Dado que en la rata anestesiada con ketamina la actividad tónica de los
receptores NMDA está bloqueada (Kelland y Chiodo, 1994), para analizar la
contribución de las fibras de paso en la frecuencia de disparo de las neuronas del
GP bajo la estimulación eléctrica del estriado, se procedió a bloquear los
receptores no-NMDA en el GP por medio del antagonista para receptores
AMPA/kainato, el DNQX.
30
Se procedió de la siguiente manera: en primer lugar, se determinó la intensidad de
estimulación eléctrica estriatal necesaria para causar una inhibición máxima-media
de la frecuencia de disparo de las células palidales (Figura 7A). A continuación, se
realizó el siguiente protocolo: 1) estimulación eléctrica estriatal como control, 2)
infusión intrapalidal de un antagonista selectivo no-NMDA, DNQX (100 pmol)
como 2o. Control, y 3) la aplicación intrapalidal de DNQX + estimulación eléctrica
estriatal.
Se observó que, la intensidad de estimulación eléctrica estriatal de 25µA produjo
una disminución de la frecuencia de disparo palidal de 59 ± 12% con respecto a la
basal, mientras la aplicación única de DNQX (100 pmol) no causó cambios
significativos en la frecuencia de disparo de las neuronas palidales. Sin embargo,
la misma intensidad de estimulación eléctrica estriatal (25µA) en presencia de
DNQX (100 pmol) causó una inhibición de la frecuencia de disparo del 98.97 ±
1.02% con respecto a la basal (n=4, Figura 7B y C). La duración del bloqueo de
los receptores AMPA/kainato por DNQX fue de 351 ± 29.8 segundos (Figura 7B).
31
Figura 7. Efecto del bloqueo local de los receptores AMPA/kainato sobre el disparo
de las neuronas del GP bajo estimulación eléctrica estriatal. (A) Muestra que la
estimulación eléctrica del estriado disminuye la actividad de disparo espontáneo
de las neuronas del GP de una manera dependiente de la intensidad del estímulo.
Del mismo modo se muestra que las respuestas de las neuronas palidales a las
intensidades de estimulación eléctrica de 10, 20 y 30 µA cuando se compararon a
las estimulaciones de 40 y 50 µA manifestaron diferencia estadísticamente
significativa. *P < 0.01; no así entre 40 y 50 µA. (B) Muestra que la aplicación
intrapalidal de un antagonista de receptores AMPA/kainato, el DNQX, potencia el
efecto inhibitorio palidal evocada por la activación eléctrica de la vía estriadopalidal. El fondo gris indica un intervalo de confianza. (C) Muestra que la infusión
local de DNQX (100 pmol) solo no evocó cambios en la frecuencia de disparo
basal de las neuronas palidales pero, aumentó la inhibición del GP evocada por la
estimulación eléctrica estriatal. Comparados los efectos entre la aplicación de
DNQX y DNQX + estimulación se muestra una diferencia estadísticamente
significativa, lo mismo que con sólo estimulación y DNQX + estimulación. **P <
0.001. *P < 0.01, respectivamente.
32
6.3. RESPUESTA DE LAS NEURONAS DEL GP EVOCADA POR LA INFUSIÓN
LOCAL DE FLUOXETINA.
Para determinar presencia de fibras serotonérgicas activas en el GP y su papel en
el disparo espontáneo de las neuronas palidales, se realizó la infusión local del
inhibidor de la recaptura de 5-HT, la fluoxetina (100 pmol). Los efectos muestran
que la aplicación intrapalidal de fluoxetina incrementó la frecuencia de disparo
espontáneo 60 ± 18% con respecto a la basal en 11 (73%) de 15 neuronas
palidales (Figura 8A). El incremento inició durante la infusión de la droga y duró
de 31 a 74 segundos. Se observó que, no hay relación entre la frecuencia de
disparo espontáneo antes de la aplicación de la droga y la magnitud del
incremento de la frecuencia inducida por fluoxetina. La infusión local del vehículo
no tuvo efecto en la frecuencia de disparo espontáneo en 10 neuronas que
subsecuentemente incrementaron su frecuencia de disparo en presencia de
fluoxetina y esta diferencia en actividad es estadísticamente significativa (Figura
8B). Una neurona palidal (7%) disminuyó su frecuencia de disparo basal (25%)
durante la infusión local de fluoxetina. En 3 neuronas (20%), la infusión intrapalidal
de fluoxetina no tuvo efecto en la frecuencia de disparo basal.
33
Figura 8. Efecto de la infusión intrapalidal de fluoxetina sobre la frecuencia de
disparo espontáneo de las neuronas del GP. (A) Histograma de frecuencia que
ilustra el efecto de fluoxetina (100 pmol). La barra horizontal indica el periodo de
infusión. (B) Estadística del efecto de fluoxetina (100 pmol). Nótese que la infusión
local del vehículo no causó cambios con respecto a la basal. Se observa una
diferencia estadísticamente significativa entre la administración del vehículo
(solución salina) y la fluoxetina. *P < 0.001 (test "t” de Student).
34
6.4. RESPUESTA DE LAS NEURONAS DEL GP EVOCADA POR LA INFUSIÓN
LOCAL DE SEROTONINA.
Para determinar el efecto de la serotonina en la frecuencia de disparo de las
neuronas del GP, se realizó la infusión local de un agonista serotonérgico no
selectivo, la serotonina, para determinar su efecto dosis-respuesta. La infusión
intrapalidal de serotonina (300 pmol) predominantemente produjo excitación en las
neuronas del GP. En 18 (75%) de 24 neuronas, la serotonina incrementó la
frecuencia de disparo espontaneo 61 ± 11% con respecto a la basal (Figura 9A).
La media de la frecuencia de disparo de estas neuronas antes de la aplicación de
serotonina fue de 25.49 ± 5.6 potenciales de acción/segundo (rango: 4.6-63
potenciales de acción/segundo). El incremento inicio durante la infusión y duró de
5.3 a 433 segundos. La media de la duración del efecto excitatorio después de la
aplicación de serotonina fue 132 ± 33.68 segundos. Este efecto excitatorio estuvo
presente en esas neuronas que mostraron la frecuencia de disparo basal arriba de
50 potenciales de acción/segundo. Este efecto fue dosis-respuesta, la dosis de 30
pmol causó un incremento de 33.66 ± 2.21% (n=8) y la dosis de 3 nmol causó un
incremento de 69.35 ± 13.19% en la frecuencia de disparo basal (n=16); el efecto
de ambas dosis manifestó una diferencia estadísticamente significativa con
respecto al disparo basal (P < 0.001) (Figura 9B y C). En tres neuronas palidales
(12.5%), la serotonina (300 pmol) disminuyó la frecuencia de disparo espontaneo
54 ± 17% durante el periodo de infusión. La media de la frecuencia de disparo de
estas neuronas antes de la aplicación de serotonina fue 19.4 ± 3.61
espigas/segundo. La media de la duración del efecto inhibitorio de serotonina fue
53.83 ± 23.61 segundos. No hubo diferencia estadísticamente significativa de la
frecuencia de disparo basal entre las neuronas palidales que fueron inhibidas y las
que fueron excitadas por la infusión local de serotonina. La serotonina no tuvo
efecto en la frecuencia de disparo de 3 neuronas (12.5%) del GP registradas.
35
Figura 9. Efecto de la infusión intrapalidal de serotonina sobre la frecuencia de
disparo espontaneo de las neuronas del GP. (A, B) Histogramas de frecuencia que
muestran el efecto de dos diferentes dosis de serotonina. La barra horizontal
indica el periodo de infusión intrapalidal. (C) Estadística del efecto de la infusión
intrapalidal de serotonina 30 pmol, 300 pmol y 3 nmol. Muestra la clara relación
dosis-respuesta. *P < 0.001 con respecto a la frecuencia de disparo basal
(ANOVA, prueba de Newman-Keuls post-hoc test).
36
6.5. RESPUESTA DE LAS NEURONAS DEL GP EVOCADA POR LA INFUSIÓN
LOCAL DE AGONISTAS Y ANTAGONISTAS SELECTIVOS DE RECEPTORES
SEROTONÉRGICOS.
6.5.1.
EFECTO DE LA INFUSIÓN LOCAL DE 8-OH-DPAT Y WAY100635
SOBRE LA FRECUENCIA DE DISPARO DE LAS NEURONAS DEL GP.
Para determinar la participación de los receptores 5-HT1A en la respuesta a
serotonina sobre la frecuencia de disparo de las neuronas del GP, se realizó la
infusión local del agonista de los receptores 5-HT1A, el 8-OH-DPAT. La infusión
intrapalidal de 8-OH-DPAT (100 pmol) no tuvo efectos diferentes estadísticamente
significativos con respecto a la frecuencia de disparo basal (3 ± 4%) en 8 de 9
neuronas registradas (Figura 10A y B). Solamente una neurona presentó una
inhibición total durante la infusión del agonista.
La infusión local del antagonista selectivo del receptor 5-HT1A, WAY100635 (100
pmol), no tuvo efecto diferente sobre la frecuencia de disparo (7 ± 6%) de 8
neuronas del GP registradas, con respecto a la frecuencia basal (Figura 10B).
37
Figura 10. Efecto de la infusión intrapalidal de R-(+)-8-OH-DPAT y WAY100635
sobre la frecuencia de disparo espontáneo en las neuronas del GP. (A)
Histograma de frecuencia que ilustra el efecto de R-(+)-8-OH-DPAT (100 pmol). La
barra horizontal indica el periodo de infusión. (B) Estadística del efecto de
WAY100635 (100pmol) y R-(+)-8-OH-DPAT (10 y 100 pmol) que muestra que no
existe diferencia estadísticamente significativa entre el efecto de esta aplicación
con respecto a la basal.
38
6.5.2.
EFECTO DE LA INFUSIÓN LOCAL DE L-694,247 SOBRE LA
FRECUENCIA DE DISPARO DE LAS NEURONAS DEL GP.
Para determinar la participación de los receptores 5-HT1B en la respuesta a
serotonina sobre la frecuencia de disparo de las neuronas del GP, se realizó la
infusión local de un agonista selectivo del receptor 5-HT1B, el L-694-247, a
diferentes dosis (2, 20 y 200 pmol).
En 22 (65%) de 34 neuronas la infusión intrapalidal de L-694-247 (20 pmol)
incrementó la frecuencia de disparo 92 ± 6% con respecto a la basal. El
incremento en la frecuencia ocurrió mientras se administraba la droga y el efecto
duró de 8.57 a 53.7 segundos (Figura 11A). La media de la duración del efecto
excitatorio fue 30.8 ± 3.81 segundos. La media de la frecuencia de disparo de
estas neuronas antes de la aplicación de L-694,247 fue 20.59 ± 3.44 potenciales
de acción/segundo. Además, se encontró que 2 neuronas en respuesta a la
infusión local de L-694,247, primero respondieron con un incremento brusco en su
frecuencia de disparo, en seguida exhibieron un repentino e irrecuperable silencio
total; este efecto lo asociamos con un bloqueo por depolarización (amplitud de la
espiga disminuida y frecuencia de disparo incrementada antes de desaparecer la
señal brusca).
La infusión intrapalidal de L-694,247 (2 pmol) incrementó la frecuencia de disparo
basal 78.67 ± 14.91% en las neuronas registradas (n=15); en tanto que la infusión
local de L-694,247 (200 pmol) causó un incremento de 125.5 ± 79.11% (n=16)
arriba de la frecuencia de disparo basal. El efecto de L-694,247 manifiesta una
relación dosis-respuesta (Figura 11B y C). Todas las dosis de L-694,247 utilizadas
muestran un incremento con diferencia estadísticamente significativa con respecto
a la frecuencia de disparo basal (P < 0.001); sin embargo, cuando se comparó el
efecto de 200 pmol con el efecto de las dosis de 2 y 20 pmol de L-694,247,
manifestó diferencia estadísticamente significativa (P < 0.01).
39
Como en el caso de la serotonina y la fluoxetina, no hubo correlación entre la
frecuencia de disparo basal y la magnitud del efecto evocado por la aplicación de
L-694,247.
En 3 (9%) neuronas, la infusión local de L-694,247 (20 pmol) disminuyó la
frecuencia de disparo 52 ± 7% con respecto a la basal, la media de la duración de
este efecto inhibitorio fue 12.28 ± 2.47 segundos. La frecuencia de disparo de
estas neuronas antes de la aplicación de L-694,247 fue de 38.45 ± 6.6 potenciales
de acción/segundo, un valor significativamente más alto cuando se comparó con la
frecuencia de disparo basal de esas neuronas que mostraron excitación después
de la aplicación de la misma dosis de L-694,247; de hecho, hubo una neurona que
mostró una frecuencia de disparo basal por arriba de 50 potenciales de
acción/segundo.
En 7 (21%) neuronas, el L-694,247 no tuvo efecto sobre la frecuencia de disparo
basal. 2 (5%) neuronas mostraron una respuesta bifásica que fue parte de una
inhibición inicial total en la frecuencia de disparo que inicio durante la infusión del
agonista y duró 15.6 ± 5 segundos, seguido por un incremento en la frecuencia de
disparo de 106 ± 21% que duró más de 5 minutos.
40
Figura 11. Efecto de la aplicación local de L-694,247 sobre la frecuencia de
disparo de las neuronas del GP. (A, B) Histogramas de frecuencia que ilustran el
efecto de L-694,247 20 y 200 pmol. La barra horizontal indica el periodo de la
infusión local. (C) El efecto dosis-respuesta de la infusión intrapalidal de L694,247. +P < 0.01 con respecto a 2 y 20 pmol; **P < 0.001 con respecto a la
frecuencia de disparo basal (ANOVA, prueba de Newman-Keuls post-hoc test).
41
6.5.3. EFECTO DE LA INFUSIÓN LOCAL DE METHIOTHEPINA SOBRE LA
FRECUENCIA DE DISPARO DE LAS NEURONAS DEL GP.
Para determinar los efectos del bloqueo de receptores 5-HT1B sobre la frecuencia
de disparo de las neuronas del GP, se realizó la infusión local del antagonista del
receptor 5-HT1, la methiothepina.
La methiothepina (1nmol) predominantemente causó inhibición en la frecuencia de
disparo espontáneo de las neuronas del GP. En 17 (68%) de 25 neuronas, la
methiothepina disminuyó la frecuencia de disparo espontáneo 51 ± 4% con
respecto a la basal (Fig. 12A y C), el efecto duró 12.9 ± 5.21 segundos. En 5
(20%) neuronas, la methiothepina no tuvo efecto sobre la frecuencia de disparo
basal. En 3 neuronas (12%), la methiothepina incrementó la frecuencia de disparo
basal 39.24 ± 4.74% y, el efecto excitatorio inició en el tiempo de la infusión local y
duró 178 ± 94 segundos. Estas 3 neuronas tuvieron una frecuencia de disparo
basal elevada (47.44 ± 0.31 potenciales de acción/segundo) previamente a la
infusión intrapalidal de methiothepina (1nmol).
La infusión local de methiothepina (100 pmol) disminuyó la frecuencia de disparo
basal en las neuronas registradas (n=11), pero este efecto no manifestó diferencia
estadísticamente significativa cuando se comparó con las respuestas de la dosis
1nmol (Figura 12C).
6.5.4. EFECTO DE LA INFUSION LOCAL DE METHIOTHEPINA SOBRE LA
RESPUESTA EXCITATORIA DE DISPARO EVOCADA POR L-694,247 EN LAS
NEURONAS DEL GP.
Con la finalidad de conocer si el efecto excitatorio de L-694,247 se debe a la
activación de los receptores 5-HT1B, se estudió el efecto del bloqueo de estos
receptores con un antagonista a receptores 5-HT1, la methiothepina. La figura 12B
muestra el efecto de la administación intrapalidal de methiothepina (1nmol) previa
42
a la infusión intrapalidal de L-694,247 (200 pmol). En la cual puede verse que la
methiothepina antagonizó totalmente el efecto excitatorio evocado por L-694-247.
Figura 12. Efecto del bloqueo local de los receptores 5-HT1 sobre la frecuencia de
disparo basal de las neuronas del GP y además sobre el efecto excitatorio de
disparo evocado por la aplicación local de L-694,247. (A) Histograma de
frecuencia que muestra el efecto de la infusión intrapalidal de methiothepina (1
nmol). (B) Histograma de frecuencia de una neurona palidal que muestra que la
infusión local de methiothepina (1 nmol) antagoniza el incremento de la frecuencia
de disparo evocado por la aplicación local de L-694,247 (200 pmol). Las barras
horizontales en A y B indican periodos de infusión local. (C) El análisis estadístico
no muestra diferencia estadísticamente significativa en el efecto inhibitorio de
methiothepina evocado por 100 pmol y 1 nmol. *P < 0.05 con respecto al valor
basal (ANOVA, prueba de Newman-Keuls post-hoc test).
43
6.6. RESPUESTA DE LAS NEURONAS DEL GP EVOCADA POR LA INFUSIÓN
LOCAL DE SEROTONINA EN RATAS CON LESIÓN ESTRIATAL UNILATERAL.
6.6.1.
CONDUCTA
DE
GIRO
EN
RATAS
CON
LESIÓN
ESTRIATAL
UNILATERAL.
Para evaluar la lesión estriatal unilateral, 10 días después de la infusión
intraestriatal de ácido quinolínico, las ratas recibieron la aplicación sistémica de Danfetamina (1 mg/kg, i.p.) y se evaluó conducta de giro. La misma maniobra se
realizó para el grupo control. 5 de 8 ratas lesionadas exhibieron 38.33 ± 11.87
giros/10 minutos, mientras el grupo control mostró 0.66 ± 0.3 giros/10 minutos (n =
6). Esta diferencia fue estadísticamente significativa (P < 0.05) (Figura 13).
6.6.2. EFECTO DE LA INFUSIÓN LOCAL DE SEROTONINA SOBRE LA
FRECUENCIA DE DISPARO DE LAS NEURONAS DEL GP EN RATAS CON
LESIÓN ESTRIATAL UNILATERAL.
7 días después de las pruebas conductuales, se estudiaron los efectos de la
infusión local de serotonina sobre el disparo palidal, tanto en los grupos de ratas
lesionadas como en los controles.
La frecuencia de disparo basal de las neuronas del GP de las ratas lesionadas fue
mayor que la del grupo control (30.51 ± 3.08 potenciales de acción/segundo, n=21
en ratas lesionadas y 18.95 ± 5.06 potenciales de acción/segundo, n=18 en
control;
al
hacer
el
análisis
estadístico,
se
encontró
una
diferencia
estadísticamente significativa; P < 0.05).
La infusión intrapalidal de serotonina (100 pmol) causó un incremento menor sobre
la frecuencia de disparo basal de las neuronas del GP de las ratas lesionadas que
en las del grupo control (8.79 ± 3.94%, n=13, en ratas lesionadas y 51.67 ±
44
19.69%, n=18, en grupo control; al hacer el análisis estadístico, se encontró una
diferencia estadísticamente significativa; P < 0.01) (Figura 13C).
Figura 13. La respuesta de las neuronas del GP a la aplicación local de serotonina
está disminuida en ratas con lesión estriatal. (A) La aplicación intraperitoneal de Damfetamina (1 mg/kg) claramente induce conducta de giro ipsilateral en ratas con
lesión estriatal (*P < 0.05, prueba “t” de student). (B) Se muestra la evidencia de
la magnitud de la lesión estriatal inducida por ácido quinolínico (120 nmol/µl);
destaca el incremento del volumen del ventrículo cerebral derecho. (C) La
aplicación intrapalidal de serotonina (100 pmol) no causa cambios significativos
estadísticamente en la frecuencia de disparo de las neuronas del GP de ratas con
lesión estriatal (*P < 0.01, prueba “t” de Student).
45
7. DISCUSIÓN.
Los resultados mostrados en el presente trabajo señalan el efecto que tiene la vía
estriado-palidal en la actividad de las neuronas del GP y su modulación por la
serotonina a través de los receptores 5-HT1B.
Los resultados muestran un efecto diferencial entre la estimulación química y la
eléctrica de larga duración en el estriado sobre la frecuencia de disparo
espontáneo de las neuronas del GP. En muchos casos, ambas clases de
estimulación disminuyeron la actividad eléctrica de las neuronas registradas,
sugiriendo la fuerte influencia inhibitoria de la vía estriado-palidal sobre la actividad
de disparo del GP.
Aunque las neuronas estriatales no muestran actividad espontánea in vitro,
registros in vivo han mostrado que el 30% de las neuronas estriatales tienen
actividad espontánea de baja frecuencia (Sandstrom y Rebec, 2003). Dado que
hay cerca de 540,000 neuronas palidales y 55 millones de neuronas estriatales de
proyección, cada neurona del GP recibe aferencias de por lo menos 100 neuronas
estriatales diferentes (Wilson, 1990). Por eso, incluso cuando la mayor parte de
aferencias corticales al estriado son silentes, la descarga tónica de las neuronas
estriatales en el GP contribuye a la actividad basal de cada neurona palidal. Más
aun, la destrucción ipsilateral del estriado incrementa la actividad de disparo basal
de las neuronas del GP dos veces más comparado con el control (Querejeta et al.,
2005).
Por otra parte, en la estimulación química estriatal se usaron el glutamato y el
NMDA para activar las neuronas estriado-palidales por las siguientes razones: 1)
el estriado recibe información glutamatérgica de diferentes regiones de la corteza
cerebral y de núcleos talámicos (Parent y Hazrati, 1995a); tanto las aferencias
corticales y talámicas evocan potenciales postsinápticos excitatorios (EPSPs) en
neuronas estriatales (Wilson, 1986); 2) la infusión local de NMDA y glutamato
46
causa disparo repetitivo en neuronas estriatales (Herrling et al., 1983); 3) la
infusión intraestriatal de glutamato disminuye la frecuencia de disparo de las
neuronas que reciben aferencias directas de neuronas GABAérgicas estriatales,
en otras preparaciones similares (Chevalier y Deniau, 1984; Deniau y Chevalier,
1984); y 4) la aplicación iontoforética de antagonistas NMDA disminuye la
actividad eléctrica espontánea de las neuronas estriatales registradas in vivo
(Sandstrom y Rebec, 2003).
Nuestros resultados muestran que la estimulación química del estriado por NMDA
o glutamato produce una inhibición en la mayor parte de las neuronas del GP
registradas y en el 80% de las neuronas que se inhibieron se presentó un
silenciamiento de la actividad. Estas observaciones coinciden con experimentos
similares en otras regiones cerebrales involucrando la estimulación química del
estriado (Chevalier y Deniau, 1984; Deniau y Chevalier, 1984).
Aunque el porcentaje de la inhibición evocada por glutamato o NMDA fue similar,
la duración de la inhibición inducida por NMDA en el GP fue mayor que la inducida
por glutamato.
Además, después de la inhibición ocurrió una recuperación de la actividad palidal
que en el caso de la infusión de NMDA sobrepasa la frecuencia de disparo basal
previo a la aplicación de la sustancia. Este fenómeno tal vez se debió a un
bloqueo por depolarización. El bloqueo por depolarización se reportó inicialmente
en neuronas de la medula espinal (Curtis et al., 1960) y más tarde en neuronas
estriatales (Kiyatkin y Rebec, 1999). Además, se ha reportado que la aplicación
local de NMDA causa excitación seguida por un bloqueo por depolarización en
neuronas del GP (Araujo-Álvarez et al., 2008).
Por otro lado, la estimulación eléctrica del estriado ha sido extensamente utilizada
para analizar la influencia de la actividad de la vía estriado-palidal en el disparo de
las neuronas palidales, tanto en rebanadas cerebrales de rata (Nakanishi et al.,
47
1985; Nambu y Llinas, 1994) como en preparaciones in vivo de primates (Kita et
al., 2006). Sin embargo, la duración de la estimulación estriatal usada en esos
trabajos fue relativamente corta comparada con la estimulación de larga duración
que fue empleada en este trabajo. En este contexto, han sido caracterizadas las
respuestas de las neuronas del GP a la corta estimulación eléctrica estriatal y
cortical (Kita et al., 2004; Kita et al., 2006). Se sabe que la estimulación eléctrica
estriatal de larga duración in vivo aumenta los niveles de GABA pero no los de
glutamato en ratas con libre movimiento (Hiller et al., 2007) debido a la activación
de colaterales GABAérgicas espinosas de tamaño mediano e interneuronas
GABAérgicas (Ogura y Kita, 2000). Esta activación implica la modificación de la
descarga tónica de las fibras de proyección estriatal, alterando la actividad de
disparo de las neuronas del GP en la rata anestesiada (Querejeta et al., 2001).
Los datos de este trabajo muestran que la estimulación eléctrica disminuye la
frecuencia de disparo espontáneo de las neuronas del GP en una manera
dependiente de la intensidad del estimulo. Sin embargo, la estimulación eléctrica
máxima que se usó en el protocolo nunca causó una completa inhibición del
disparo de las neuronas del GP. Los resultados sugieren una importante influencia
de la activación de las fibras de paso en la actividad de disparo de las neuronas
del GP durante la estimulación eléctrica del estriado.
Los datos también sugieren que la coactivación de las fibras aferentes
glutamatérgicas durante la estimulación eléctrica encubren el efecto inhibitorio de
la vía estriado-palidal en las neuronas del GP, efecto que es revelado por el
bloqueo intrapalidal de receptores AMPA/kainato que potencia la inhibición
evocada por la estimulación eléctrica del estriado. En apoyo a esta hipótesis, se
ha reportado que las fibras eferentes corticales que proyectan al NST pasan a
través del estriado (Miyachi et al., 2006), aun más, las neuronas del NST
proyectan al estriado (Takada et al., 1988), por lo tanto, es razonable considerar
que la estimulación eléctrica estriatal activa tanto neuronas estriatales y fibras
corticales de paso que proyectan al NST como también a fibras del NST.
48
Tanto la estimulación eléctrica y química del estriado tiene ventajas y desventajas.
Por ejemplo, la estimulación química evita la activación de fibras de paso y la
coactivación de numerosas fibras eferentes corticales (Ohye et al., 1976), entre
otras aferencias estriatales (Mink, 1996). Pero dependiendo del volumen de
distribución, la droga puede difundir a núcleos vecinos causando efectos directos;
sin embargo, como se demostró en nuestro trabajo, optimizando el volumen de
infusión y la colocación de la cánula se puede reducir esta desventaja. En este
contexto, trabajos previos reportan que un volumen de 100 nl difunde 1 mm3 en el
estriado (Chevalier y Deniau, 1984). Por lo tanto, en nuestros experimentos, los
efectos no se debieron a la difusión de las sustancias del estriado hasta el GP
porque la punta del electrodo de registro se encontraba a 1.5 mm de la cánula
estriatal.
En registros de estimulación eléctrica, la propagación de la corriente eléctrica a
través del cerebro es todo un problema. La tarea de determinar la cantidad de
corriente necesaria para activar un elemento dado en una cierta distancia de un
electrodo, es más difícil de lo que parece. En trabajos previos, la curva corrienterespuesta, de la estimulación eléctrica monopolar en el cerebro provocó una
relación intensidad del estimulo-distancia. A este respecto, una intensidad de
estimulación de 50 μA, que fue la que empleamos como estímulo máximo,
activaría elementos dentro de un radio de 700 μm (Ranck, 1975); así,
consideramos que la propagación eléctrica de esta estimulación no fue más allá
del estriado. En este sentido, observamos que las intensidades de estimulación de
más de 100 μA causaron contracción de las extremidades ipsilaterales, una
indicación que la corriente se ha propagado fuera del estriado directamente
estimulando las motoneuronas de la capsula interna. Además, una intensidad de
estimulación de 80 μA causó actividad irregular en todas las neuronas del GP
registradas. En algunos casos esta estimulación aumenta la actividad seguida por
un silencio o viceversa. Esta actividad irregular causada por las altas intensidades
de estimulación puede ser explicada de acuerdo a las observaciones hechas por
Katz y Miledi (1965), quienes determinaron que las corrientes por arriba del umbral
49
para iniciar un potencial de acción no generarían un potencial de acción
propagado. Así, pensamos que en nuestro caso, las corrientes mayores de 80 μA
hiperpolarizan las neuronas estriatales de proyección.
Para evitar la propagación de corriente extra-estriatal y los patrones de actividad
irregular, al analizar las respuestas de estimulación eléctrica, elegimos una
intensidad de estimulación eléctrica máxima de 50 μA. A este respecto, vale
mencionar que el análisis de actividad axonal, estimulación presináptica y la
activación de fibras de paso durante la estimulación eléctrica han recibido poca
atención (McIntyre et al., 2004; Ranck, 1975), aunque se sabe que la estimulación
eléctrica estriatal activa fibras de paso (Ohye et al., 1976).
Una cuestión interesante que surge de nuestros resultados es la ausencia de un
silencio completo de las neuronas del GP durante la estimulación eléctrica del
estriado.
En condiciones normales, la activación de la corteza motora causa respuestas
estereotípicas en las neuronas del GP, consisten en una excitación inicial de
latencia corta seguida por una inhibición y una excitación tardía; esta secuencia de
respuesta se debe a la activación de las vías cortico-NST-palidal y corticoestriado-palidal: la activación cortical de las neuronas del NST que proyectan al
GP causa la primera respuesta excitatoria que es seguida por una respuesta
inhibitoria causada por la activación de las fibras estriado-palidales. Esto es
porque la velocidad de conducción de las fibras cortico-NST-GP es mucho más
rápida que la de las fibras estriado-palidal y porque la inhibición de las neuronas
del GP causa desinhibición de las neuronas del NST, el cual excita otra vez las
neuronas del GP (Kita et al., 2004; Nambu et al., 2000).
De esta manera, la activación de las vías corticales de proyección sería un
prerrequisito para el incremento inicial y tardío en la actividad palidal. Por lo tanto,
solamente la estimulación química del estriado produce un silencio completo en
50
muchas de las neuronas del GP por evitar la activación simultánea de las fibras
cortico-subtalámica y subtalámicas.
En conclusión con respecto a la estimulación estriatal, nuestros resultados
muestran una respuesta diferencial del disparo de las neuronas del GP a la
estimulación química o eléctrica del estriado. La coactivación de las fibras
glutamatérgicas durante la estimulación eléctrica estriatal es un efecto invariable
que enmascara la contribución inhibitoria de las neuronas espinosas medianas en
las neuronas palidales.
Por otro lado, con respecto al papel de la serotonina, la activación del receptor 5HT1B del GP incrementa la actividad espontánea de las neuronas palidales.
Además, se mostró que existe una liberación tónica de serotonina en el GP. Aun
más, nuestros resultados demuestran disminución del efecto a serotonina en la
actividad eléctrica de las neuronas del GP de ratas con lesión estriatal unilateral
con acido quinolínico. Para conocimiento del lector, este es el primer trabajo que
analiza in vivo la actividad eléctrica espontánea de neuronas del GP en
condiciones donde el estriado ha sido selectivamente destruido.
De los datos de este trabajo, es ahora claro que hay descargas tónicas
serotonérgicas en el GP. La aplicación intrapalidal de la fluoxetina causó cambios
significativos en la actividad eléctrica espontánea de las neuronas palidales. Estos
resultados coinciden con trabajos previos que reportan la existencia de actividad
tónica en neuronas serotonérgicas del NRD (Fornal et al., 1999) y con otros
estudios que han demostrado que las fibras serotonérgicas que entran al GP se
originan en neuronas del NRD (Azmitia y Segal, 1978; Vertes, 1991).
El efecto principal de la fluoxetina reportado en este trabajo fue un incremento en
el disparo espontáneo de las neuronas palidales. Este resultado se suma a
observaciones previas, que reportan la misma respuesta de las neuronas del GP,
pero bajo la aplicación sistémica de la fluoxetina (Bergstrom y Walters, 1981). Las
51
observaciones confirman una aferencia serotonérgica tónica al GP y nuestros
datos demuestran que la acción de la fluoxetina toma lugar localmente al nivel del
GP.
Evidencias del presente estudio y de la literatura indican, que los receptores 5HT1B del GP presinápticos modulan la liberación de GABA de la terminal estriadopalidal: 1) la localización de los receptores 5-HT1B en el GP ha sido previamente
demostrada (Palacios et al., 1991; Boschert et al., 1994) y el papel de tanto
autoreceptor y heteroreceptor ha sido asociado a los receptores 5-HT1B en varios
otros núcleos, donde ellos disminuyen la liberación de serotonina (Adell et al.,
2001), GABA (Johnson et al., 1992) y glutamato (Boeijinga y Boddeke, 1996) a
través del acoplamiento de proteína Gi/o (Adham et al., 1991). La vía estriadopalidal es la principal entrada aferente al GP (Nakanishi et al., 1985; Parent y
Hazrati, 1995b) y esta vía descarga tónicamente en el GP, un efecto que es
considerado como un determinante importante de la actividad eléctrica de las
neuronas del GP (Querejeta et al., 2001) y, 2) se ha reportado que la destrucción
del estriado considerablemente reduce el marcaje de los receptores 5-HT1B en el
GP (Sari et al., 1999). Por otro lado, estudios de hibridación in situ, han
encontrado que no hay evidencia de expresión de mRNA para los receptores 5HT1B en el soma del GP, pero que hay niveles significantes de expresión de
mRNA en los cuerpos neuronales del estriado (Boschert et al., 1994).
Finalmente, de nuestros datos en este trabajo, el incremento en la frecuencia de la
actividad eléctrica de las neuronas del GP evocado por la aplicación de fluoxetina
y la disminución significativa de la frecuencia de disparo de las neuronas del GP
causado por la infusión de methiothepina, confirman la presencia de una descarga
tónica serotonérgica en el GP. Estos resultados relevantes se avalan totalmente
de diferentes trabajos en otros núcleos cerebrales, donde in vivo el bloqueo de los
receptores 5-HT1B presinápticos por methiothepina está asociado con un
incremento en la liberación del neurotransmisor (Langer y Moret, 1982; Moret y
Briley, 1996) e in vitro la activación de los receptores 5-HT1B disminuye la
52
liberación de GABA en tanto las terminales mesencefálicas GABAérgicas
(Johnson et al., 1992) y neuronas de la SNr (Stanford y Lacey, 1996).
Los resultados permiten inferir la presencia de un receptor 5-HT1B presináptico
que modula la actividad de neuronas estriado-palidales. Estos receptores 5-HT1B
estarían más probablemente localizados en la terminal estriado-palidal, modulando
la liberación de GABA. Esta idea es totalmente apoyada porque la liberación de
GABA está modulada por diversos neurotransmisores (Maneuf et al., 1994;
Nakanishi et al., 1985) incluyendo serotonina (Stanford y Lacey, 1996; Chadha et
al., 2000; Di Cara et al., 2003); también, otros trabajos han reportado que la
destrucción de las neuronas serotonérgicas del NRD causa cambios pequeños en
los niveles de expresión de la descarboxilasa del ácido glutámico (GAD) en el GP
(Di Cara et al., 2003) un efecto que se correlaciona bien con la observación de
cambios en la actividad neuronal del GP debido a la perdida de la regulación
serotonérgica de la terminal estriado-palidal. De estos resultados, podemos inferir
que la activación tónica de los receptores 5-HT1B contribuye significativamente en
la disminución de la liberación de GABA de la terminal GABAérgica estriadopalidal facilitando el disparo de las neuronas del GP, y por otro lado, el bloqueo de
estos receptores causa una disminución significativa en la frecuencia de disparo
de las neuronas del GP debido al aumento de la liberación de GABA de la terminal
estriado-palidal.
La aplicación de methiothepina incrementó la frecuencia de disparo de algunas de
las neuronas examinadas. En estas neuronas, la frecuencia de disparo basal
estaba por arriba de la frecuencia de disparo promedio de la mayoría de las
neuronas registradas. La explicación para esta observación es que la
methiothepina actúa como un agonista inverso en los receptores 5-HT1B (Moret y
Briley, 1993) potenciando el bloqueo de la liberación de GABA e incrementando la
frecuencia de disparo de esas neuronas que reciben entradas inhibitorias de baja
actividad.
53
La aplicación de la serotonina incrementó la actividad de disparo de las neuronas
del GP en una manera dosis-respuesta. Este resultado es un excelente argumento
con otros reportes que muestran que la vía estriado-palidal descarga tónicamente
en preparaciones experimentales similares a una usada en el presente trabajo
(Querejeta et al., 2001) y en línea con esto, hay evidencia que las vías
serotonérgicas están activas permanentemente (Fornal et al., 1999). Por otro lado,
la serotonina dependientemente de la dosis produjo una mayor excitación que el
L-694,247; esto es probablemente debido a la activación de otros receptores 5-HT,
tales como 5-HT4 (Waeber et al., 1994; Compan et al., 1996) y 5-HT7 (Gustafson
et al., 1996; Bonaventure et al., 2002), que no fueron explorados en este trabajo.
El L-694,247 también tiene afinidad para el receptor 5-HT1D (Beer et al., 1993)
pero la densidad del receptor 5-HT1D expresada en el GP de la rata es
insignificante cuando se comparó con la densidad del receptor 5-HT1B (Bruinvels
et al., 1993). En este sentido, se ha mostrado que los roedores (rata y ratón)
principalmente expresan los receptores 5-HT1B en el SNC, mientras que en otras
especies (cobayos y primates), los receptores 5-HT1D son el mayor subtipo,
compartiendo la misma clase de funciones en núcleos homólogos (Hoyer y
Middlemiss, 1989; Briley et al., 2000). Así, nosotros consideramos que el L694,247 es una herramienta farmacológica aceptable para el estudio de la función
del receptor del receptor 5-HT1B en la rata (Beer et al., 1993).
Los
efectos de la aplicación intrapalidal de L-694,247 y methiothepina,
demuestran que el disparo espontáneo de las neuronas del GP en la rata
anestesiada se modifica por la activación o el bloqueo de los receptores 5-HT1B,
respectivamente.
La
activación
del
receptor
5-HT1B
por
L-694,247
predominantemente causó un incremento significativo en la frecuencia de disparo
de las neuronas del GP de manera dosis-respuesta. Además, la methiothepina
disminuyó la frecuencia de disparo de las neuronas del GP y bloqueó el efecto
excitatorio evocado por L-694,247.
54
La aplicación intrapalidal del agonista y antagonista selectivo del receptor 5-HT1A,
el 8-OHDPAT y el WAY100635 no causaron cambios significativos en la actividad
eléctrica de las neuronas del GP. Es conocido que el 8-OHDPAT tiene alta
afinidad para los receptores 5-HT7. Sin embargo, esta es cinco veces menos afín
que la que presentan los receptores 5-HT1A (Bonaventure et al., 2002). La
presencia de receptores 5-HT7 ha sido descrita en el GP de la rata (Gustafson et
al., 1996; Bonaventure et al., 2002). Las bajas concentraciones de 8-OHDPAT
usadas en este estudio no produjeron cambios significativos en el disparo basal de
todas las neuronas del GP examinadas. Además, la clara ausencia de los efectos
de ambas drogas en el disparo de las neuronas del GP está acorde con otros
estudios que confirman la ausencia de receptores 5-HT1A en el GP (Kia et al.,
1996). Es importante remarcar que el globo pálido ventral tiene funciones límbicas
(Kalivas et al., 1999) a diferencia del GP que está asociado con actividad motora
(Blandini et al., 2000). Ambos, tienen una expresión diferencial de receptores
serotonérgicos (Pazos y Palacios, 1985; Barnes y Sharp, 1999). Por ejemplo, se
ha mostrado que la activación de los receptores 5-HT1A por la aplicación
sistémica de 8-OHDPAT causó cambios en la frecuencia de disparo de neuronas
del globo pálido ventral (Heidenreich y Napier 2000). Por contraste, no
observamos respuestas con la aplicación local del agonista o el antagonista
(WAY100635).
Por último, nuestros experimentos en ratas con lesión estriatal unilateral,
corroboran que los receptores 5-HT1B están localizados en la terminal
GABAérgica estriado-palidal. La aplicación intrapalidal de la serotonina en ratas
con lesión estriatal no causó cambios diferentes estadísticamente significativos en
la frecuencia de disparo de las neuronas del GP, en comparación a las ratas
control. Las neuronas del GP de ratas lesionadas mostraron un aumento
significativo en su frecuencia de disparo basal, en comparación a las ratas control.
Estos resultados, muestran claramente la importancia de la aferencia estriatal
tónica GABAérgica al GP. Basados en estudios previos morfológicos (Boschert et
al., 1994; Sari et al., 1999) y funcionales (Briley et al., 2000) deducimos que la
55
ausencia de respuesta de las neuronas del GP a la infusión de la serotonina en
ratas con lesión estriatal está asociado con una disminución en el número de
receptores 5-HT1B en el GP.
Por lo tanto, es evidente que la interacción de GABA y serotonina juega un papel
importante en la modulación de la actividad eléctrica de las neuronas del GP y que
esta interacción es mediada por receptores 5-HT1B, como se demostró en los
presentes resultados y además, es apoyado por otros estudios conductuales que
mostraron que la activación selectiva de los receptores 5-HT1B bloquea la
liberación de GABA en el GP (Chadha et al., 2000).
Los presentes resultados demuestran la participación de los receptores 5-HT1B en
la modulación del disparo espontáneo de las neuronas del GP en la rata
anestesiada. Esta modulación probablemente ocurre por una inhibición de la
liberación de GABA de la terminal estriado-palidal. Por lo tanto, los receptores 5HT1B en el GP pueden ser un importante blanco farmacológico en una diversidad
de desordenes motores, donde la actividad basal de las neuronas palidales está
alterada.
El papel de los receptores 5-HT1B en la regulación de la función GABAérgica en el
GP puede ser útil en la búsqueda de la nueva terapéutica para el tratamiento de la
enfermedad de Parkinson.
56
8. CONCLUSIONES.
Existe una respuesta diferencial del disparo de las neuronas del GP a la
estimulación química y eléctrica del estriado.
La coactivación de fibras glutamatérgicas durante la estimulación eléctrica estriatal
es un efecto invariable que oculta la contribución inhibitoria de las neuronas
espinosas de tamaño mediano en las neuronas palidales y se debe a la activación
de fibras de paso; este fenómeno no se presenta durante la estimulación química
estriatal.
Los receptores 5-HT1B contribuyen al control del disparo de las neuronas del GP
en ratas anestesiadas.
Los receptores 5-HT1B modulan el disparo espontáneo de las neuronas del GP
probablemente inhibiendo la liberación de GABA de la terminal estriado-palidal.
57
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G Model
NSR 2868 1–6
Neuroscience Research xxx (2008) xxx–xxx
Contents lists available at ScienceDirect
Neuroscience Research
journal homepage: www.elsevier.com/locate/neures
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Aldo Oviedo a, Alfonso Delgado b, Enrique Querejeta a,*
b
Department of Physiology and Pharmacology, National Polytechnic Institute School of Medicine, México D.F., Mexico
Department of Physiology and Neuroscience, Autonomous University of Chihuahua School of Medicine, Chihuahua Chih, Mexico
A B S T R A C T
Article history:
Received 4 March 2008
Received in revised form 28 August 2008
Accepted 29 August 2008
Available online xxx
The reciprocal connections between the globus pallidus (GP) and other basal ganglia (BG) nuclei indicate
that the GP plays a significant role in controlling the neuronal activity of the entire BG; in turn, the activity
of GP neurons is controlled by several major inputs that involve the striatum. Here, we determined the
relative contributions of the selective (chemical) or massive (electrical) activation of the striatal
GABAergic transmission to the GP spiking activity. In vivo extracelullar single-unit recordings were
performed in the GP of ketamine-anesthetized rats. Both chemical and electrical stimulation of the
striatum caused a significant GP spike rate reduction; however, chemical stimulation of the striatum
produced a complete firing arrest on most GP neurons, something not seen with electrical stimulation. In
addition, chemical stimulation of the striatum with NMDA evoked a significant long-lasting postinhibitory spike rate increase, an effect that was not seen under glutamate infusion or electrical
stimulation. Furthermore, the selective intrapallidal blockade of AMPA/kainate glutamate receptors
facilitates the inhibitory effect of intrastriatal electrical stimulation. Our results suggest a differential
effect of electrical or chemical stimulation of the striatum on the spiking activity of GP neurons, which
involves the activation of intrapallidal AMPA/kainate receptors and striatal en passant fibers.
ß 2008 Published by Elsevier Ireland Ltd and the Japan Neuroscience Society.
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1. Introduction
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The GP plays a key role in the overall BG activity, both in normal
and pathological conditions (Kita, 1994; Morris et al., 2005).
Afferent fibers coming from other nuclei are the major factors that
determine the electrical activity of GP neurons (Kita et al., 2004,
2006; Querejeta et al., 2005; Soltis et al., 1994). In this regard, GP
neurons receive GABAergic inhibitory fibers from the striatum
through the striato-pallidal pathway (Nakanishi et al., 1985;
Nambu and Llinas, 1994; Parent et al., 1989) and excitatory
information coming from the subthalamic nucleus (Windels et al.,
2005); in addition, intrapallidal GABAergic recurrent collaterals
highly contribute to GP neuronal spiking (Ogura and Kita, 2000) On
the other hand, GP sends GABAergic fibers to the subthalamic
nucleus (STN) (Baufreton et al., 2005; Soltis et al., 1994).
The communication between GP and STN acts as a pacemaker of
the global activity of the basal ganglia (Plenz and Kitai, 1999) and
activation of the primary motor cortex and the supplementary
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Keywords:
Globus pallidus
Striatal stimulation
Subthalamic nucleus
Cortico-subthalamic fibers
Pacemaker loop
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Differential inhibition of globus pallidus neurons by electrical or chemical
stimulation of the striatum
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* Corresponding author at: Plan de San Luis y Dı́az Mirón, Col. Casco de Santo
Tomás, C.P. 11340, México D.F., Mexico. Tel.: +52 55 5729 6300x62752;
fax: +52 55 5729 6300x62794.
E-mail address: [email protected] (E. Querejeta).
motor area modify the activity of both nuclei (Kita et al., 2004).
Furthermore, it has been reported that the striato-pallidal pathway
activity is altered in pathological conditions (Goto et al., 1986;
Robertson et al., 1990), and therefore the activity of pallidal
neurons is also modified (Filion and Tremblay, 1991; Querejeta
et al., 2005; Tremblay et al., 1989).
The effect of the short-lasting electrical stimulation of the
cortex and striatum on the electrical activity of GP neurons has
been previously studied (Kita, 1994; Kita et al., 2004, 2006;
Nambu et al., 1990); however, there are not previous reports of
the effect of the long-lasting electrical (train) stimulation of
the striatum on the in vivo GP activity, moreover, previous works
that studied the in vivo firing rate of nuclei that receive fibers
coming from the striatum avoided the train stimulation of
the striatum due to the activation of en passant fibers (Chevalier
and Deniau, 1984; Deniau and Chevalier, 1984). In this context,
it has been suggested that activation of glutamatergic fibers by
electrical stimulation of the striatum would mask the effect of
the striato-pallidal pathway on the GP firing rate (Ohye et al.,
1976), and that AMPA/kainate receptors mediate the glutamatergic responses coming from the STN (Soltis et al., 1994).
Therefore, we hypothesized that there would be a stronger
GP neurons inhibition when selectively activating the striatopallidal pathway through chemical stimulation of the striatum
0168-0102/$ – see front matter ß 2008 Published by Elsevier Ireland Ltd and the Japan Neuroscience Society.
doi:10.1016/j.neures.2008.08.011
Please cite this article in press as: Oviedo, A., et al., Differential inhibition of globus pallidus neurons by electrical or chemical
stimulation of the striatum. Neurosci. Res. (2008), doi:10.1016/j.neures.2008.08.011
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Experiments were performed in male Wistar rats weighing
180–220 g. The animals were maintained and handled according to
the guidelines of ESM-IPN Animal Care and Use Committee,
compliant with the National Institutes of Health Guide for Care and
Use of Laboratory Animals. All efforts were made to minimize
animal suffering and the number of animals used. Animals were
housed in a temperature- and humidity-controlled environment
with a 12 h light/dark cycle and free access to food and water.
Animals were anesthetized with ketamine hydrochloride
(150 mg/kg, i.p. initial dose and supplemented as needed with
50 mg/kg, i.p. according to the corneal reflex) and positioned
gently in a stereotaxic apparatus (Kopf, Tujunga, CA, USA). A rectal
thermometer was used to monitor body temperature, which was
maintained at 37–38 8C with a heating pad. Once the overlying skin
and connective tissue were removed from the skull, two holes were
drilled to gain access to the striatum and the GP. All coordinates
were calculated according to Paxinos and Watson (1998).
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2. Materials and methods
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For striatal stimulation, either a tungsten unipolar electrode or
an injection cannula was aimed at a 208-angle relative to the
coronal plane into the striatum using the following coordinates:
4.7 mm anterior to bregma; 2 mm lateral and 5 mm ventral to
dura. The recording micropipette was placed in the GP at: 0 mm A–
P, 3.2 mm lateral to bregma and 4.5 mm ventral to brain surface.
Further, for intrapallidal drug injection, a cannula was placed at the
following coordinates: 0.8 mm anterior, 5.8 mm lateral and
4.9 mm ventral to brain surface, aimed laterally at a 308-angle
relative to the vertically oriented recording micropipette. The
recording micropipettes were made from standard borosilicate
glass capillaries filled with 2 M NaCl solution and had a 3–6 MV
electrical resistance. The tip of the stimulating electrode or cannula
was kept within 1.5–2.0 mm away from the recording micropipette. In situ drug application was carried out with an infusion pump
connected to the drug injection cannula. The rate of drug
application into the GP was 50 nl/15 s. The distance between
the recording micropipette and the drug injection cannula was
150–200 mm. All drugs were from RBI (Sigma–Aldrich, USA).
The recording micropipette signal was band-pass filtered at
300–3000 Hz, amplified 10,000 with a differential amplifier
(WPI, DAM-80, Saratosa, FL, USA), monitored with a digital
oscilloscope (HP 5400B, USA) and stored in an audiotape device.
The GP single-unit spiking activity was transferred to a PC through
a dual-threshold window discriminator (WPI, WP-121, Saratosa,
FL, USA) for off-line data analysis. For electrical stimulation
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and that this inhibition would be enhanced if we block
the intrapallidal non-NMDA receptors. Accordingly, we used
in vivo extracellular single-unit recordings to first determine the
effects of chemical and electrical train stimulation and then
probe for the enhancing effect of intrapallidal blockade of nonNMDA receptors.
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Fig. 1. Chemical stimulation of striatum by glutamate and NMDA reduces the spontaneous spiking rate of globus pallidus neurons. (A) Application of 1 nmol glutamate
produces a significant firing frequency inhibition. Notice the small reduction in the spiking rate after inhibition. (B) Application of 1 nmol NMDA causes a complete inhibition
in pallidal cells spiking rate. Notice the significant increase in spiking activity after the NMDA-induced inhibition. (C) Statistics of the effect of striatal chemical stimulation. ns,
not significant. (D) The NMDA-induced inhibition of globus pallidus neurons lasts longer than that induced by glutamate. *P < 0.05. The gray background indicates a two-STD
confidence interval. spk/s, spikes per second.
Please cite this article in press as: Oviedo, A., et al., Differential inhibition of globus pallidus neurons by electrical or chemical
stimulation of the striatum. Neurosci. Res. (2008), doi:10.1016/j.neures.2008.08.011
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3.1. Effect of chemical striatal stimulation on GP neurons spontaneous
firing rate
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We set first to determine the effect of striato-pallidal pathway
chemical activation on the spiking rate of pallidal neurons by
striatal infusion of 1 nmol glutamate. Ten out of 12 (83%) of the GP
neurons tested displayed a 95 3.06% spiking rate reduction after
striatal infusion of glutamate (Fig. 1A and C); 7 out of these 10 (70%)
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3.2. Effect of electrical striatal stimulation on GP neurons spontaneous
firing rate
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3. Results
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neurons showed a complete firing arrest and the remaining 3 neurons
displayed an 83 6.88% of inhibition.
On the other hand, striatal application of 1 nmol NMDA
produced a 96.83 2.92% inhibition in 9 out of 11 (82%) neurons
tested (Fig. 1B and C), in addition, 7 out of 9 (78%) of these neurons
presented a total firing inhibition; the inhibition in the remaining 2
neurons that did not present a complete firing arrest was
78.5 5.25% of baseline.
There were no significant differences between the magnitude of
the inhibitory effect of NMDA and glutamate (Fig. 1C). However,
the duration of the inhibition was indeed different (Fig. 1D).
Striatal infusion of glutamate caused an inhibition that lasted
18.66 3.78 s, whereas the inhibition evoked by NMDA lasted
49 8.18 s (P < 0.05). Another significant difference between the
effect of glutamate and NMDA striatal infusions was the recovery to
baseline firing rate values after inhibition. Neurons under the effect of
NMDA striatal infusion increased their spiking rate by 136.75 14%
of baseline after drug infusion (Fig. 1A vs. Fig. 1B), whereas the cells
with glutamate-induced inhibition recovered to a 97.5 0.5% of
control firing rate. The striatal infusion of saline (n = 5) had no effect
on GP neurons spontaneous firing rate (data not shown).
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experiments, artifact removal was performed online with an
artifact suppressor (FHC 40-75-6, ME, USA), its holding time was
adjusted so the artifact duration remained less than the time
course of the action potentials; when the artifact suppression time
width was longer than the average interspike interval without
electrical stimulation or longer than the interstimulus interval, our
method was deemed unsatisfactory and the experiment was
discarded.
Either electrical (10, 20, 30, 40 and 50 mA, 0.2 ms-width square
pulses at 20 Hz for 15 s) or chemical (100 nl in 30 s of a
1 10 9 mol glutamate or NMDA in saline solution) stimulation
of the striatum was applied after at least 5 min of stable baseline
recording. Pallidal cells responses were analyzed by comparing
their firing rate during and after either type of stimulus against an
equal-length recording of their baseline activity. Unless otherwise
stated, statistical comparisons between groups were determined
with Student’s t-test or ANOVA (with Newman–Keuls post hoc
test) using standard commercial software (Prism 4.0, GraphPad,
USA). Data are expressed as the mean standard error of the mean
or as percent of control. Confidence intervals (CIs) were calculated
from the mean instantaneous frequency during the baseline period
(1 ms bin width) of at least 5 min duration.
We analyzed the GP neurons spiking response to various
electrical stimulus intensities applied to the striatum. The
spontaneous spiking rate of all neurons tested decreased in a
stimulus-intensity dependent manner (n = 11, Fig. 2A). Stimulus
intensities of 10, 20 and 30 mA diminished GP neurons firing
frequency by 21.3 7.6%, 39.1 8.3% and 68.6 5.1%, respectively. On the other hand, stimulation with 40 and 50 mA caused an
inhibition of 87.0 6.2% and 91.0 3.3%, respectively. The pallidal
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Fig. 2. Local blockade of AMPA/kainate receptors augments the inhibition of globus pallidus neurons evoked by striatal electrical stimulation. (A) Electrical stimulation of the
striatum diminishes the spontaneous spiking activity of globus pallidus neurons in a stimulus intensity-dependent manner. The responses of pallidal neurons to stimulus
intensities of 10, 20 and 30 mA were statistically different when compared to 40 and 50-mA stimulations. *P < 0.01. (B) DNQX, a selective AMPA/kainate receptors antagonist,
potentiates the effect of electrical activation of the striato-pallidal pathway. The gray background indicates a two-STD confidence interval; spk/s, spikes per second. (C) The
local infusion of 100 pmol DNQX alone did not evoke changes in the basal firing rate of pallidal neurons but augmented the GP inhibition evoked by striatal electrical
stimulation. **P < 0.001, *P < 0.01.
Please cite this article in press as: Oviedo, A., et al., Differential inhibition of globus pallidus neurons by electrical or chemical
stimulation of the striatum. Neurosci. Res. (2008), doi:10.1016/j.neures.2008.08.011
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To analyze the contribution of en passant fibers to the spiking of
the GP neurons under electrical stimulation of the striatum, we
proceeded to block non-NMDA receptors in the GP. We chose
DNQX, an AMPA/kainate antagonist, because in the ketamine
anesthetized rat the tonic activity of NMDA receptors is shutdown
(Kelland and Chiodo, 1994).
First, we determined the striatal stimulus intensity necessary
to cause a half-maximal inhibition of pallidal cells spiking rate
(Fig. 2A). Second, we carried out the following stimulation
protocol: (1) electrical stimulation alone, (2) pallidal infusion of
100 pmol DNQX and (3) electrical stimulation +DNQX application. A stimulus intensity of 25 mA produced a 59 12% pallidal
spike rate reduction, whereas application of 100 pmol DNQX alone
did not cause any significant changes on pallidal neurons discharge
rate. On the other hand, the same stimulus intensity caused a
98.97 1.02% spike frequency inhibition in the presence of
100 pmol DNQX (n = 4, Fig. 2 B and C). The duration of the
blockade of AMPA/kainate receptors by DNQX was 351 29.8 s
(Fig. 2B).
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The GP receives a widespread and robust innervation from
striatal GABAergic projection neurons (Smith et al., 1998). Previous
works have pointed out the inhibition of GP neurons evoked by
short-lasting electrical stimulation of the striatum in brain slices
(Nakanishi et al., 1985; Nambu and Llinas, 1994) and in vivo
preparations (Kita et al., 2006). Moreover, the effect of the chemical
stimulation of the striatum has been analyzed in the spiking of
neurons of the substantia nigra pars reticulata recorded in vivo
(Chevalier and Deniau, 1984; Chevalier et al., 1985; Deniau and
Chevalier, 1984). However, the effect of electric train stimulation
or the chemical stimulation in the striatum on GP spiking activity
in vivo was not previously studied.
Our data show a differential effect between chemical and
electric train stimulation of the striatum on the spontaneous firing
rate of GP neurons. In most cases, both kinds of stimulation
diminished the electrical activity of the recorded neurons,
suggesting the robust inhibitory influence of the striato-pallidal
pathway on the GP spiking activity.
Although striatal neurons do not show spontaneous activity
in vitro, recordings made in vivo showed that 30% of striatal
neurons have low-frequency spontaneous activity (Sandstrom
and Rebec, 2003). Given that there are about 540,000 pallidal
neurons and 55 million striatal projection neurons, each GP
neuron receives inputs from at least 100 different striatal
neurons (Wilson, 1990). Hence, even when cortical afferents to
the striatum are silent, the tonic discharge of striatal neurons
into GP contributes to the basal activity of each pallidal neuron.
Moreover, ipsilateral destruction of the striatum increases the
basal spiking activity of GP neurons twofold as compared with
control (Querejeta et al., 2005).
We choose glutamate and NMDA to activate striato-pallidal
neurons because: (1) the striatum receives glutamatergic information from different regions of the cerebral cortex [including those
not involved in movement control (Cherubini et al., 1988)], and
from thalamic nuclei (Ding et al., 2008; Wilson et al., 1983); both
cortical and thalamic inputs evoke EPPs in striatal neurons
(Wilson, 1986; Wilson et al., 1983); (2) local infusion of NMDA
and glutamate, among other excitatory amino acids, cause
repetitive firing in striatal neurons (Herrling et al., 1983); (3)
intrastriatal infusion of glutamate diminishes the spiking rate of
neurons that receive direct afferents from GABAergic striatal
medium spiny neurons in other similar preparations (Chevalier
and Deniau, 1984; Deniau and Chevalier, 1984); and (4)
iontophoretic application of NMDA antagonists diminishes the
spontaneous electrical activity of 98% of the striatal neurons
recorded in vivo (Sandstrom and Rebec, 2003).
Our results show that chemical stimulation of the striatum by
NMDA or glutamate produces an inhibition on 80% of GP neurons
and a complete arrest of GP activity was seen in most of the
inhibited neurons. These observations are in complete agreement
with similar experiments in other brain regions involving chemical
stimulation of the striatum (Chevalier and Deniau, 1984; Deniau
and Chevalier, 1984).
Although the percentage of inhibition evoked by glutamate or
NMDA is similar, the extent of the NMDA-induced inhibition in the
GP is longer than that induced by glutamate; and the spiking rate
during the recovery to baseline is significantly greater for NMDA
than for equimolar concentrations of glutamate. The increase in
the basal firing rate after the inhibition induced by the striatal
application of NMDA is most likely due to a depolarization block of
the striato-pallidal pathway following its strong excitation, a
phenomenon that is not induced by glutamate. This loss of activity
due to hyperexcitation by excitatory amino acids was initially
reported in spinal cord neurons (Curtis et al., 1960) and later on in
striatal neurons (Kiyatkin and Rebec, 1999). In addition, we have
previously reported that intrapallidal infusion of NMDA causes
excitation followed by a depolarization block, a phenomenon that
is not observed with glutamate infusions (Araujo-Alvarez et al., in
press).
Further, supporting a glutamate-mediated inhibition in the
striatum, glutamate diminishes excitatory responses by activating
metabotropic receptors (mGluR). For example, presynaptic group II
and III mGluRs inhibit glutamatergic cortico-striatal fibers (Pisani
et al., 2000). Moreover, the localization of group III mGluRs on
GABAergic terminals of striatal projection neurons suggests a role
as presynaptic heterroreceptors (Corti et al., 2002). However,
group I mGluRs potentiates NMDA responses in striatal neurons
(Pisani et al., 2001).
On the other hand, studies of kainate receptors in the striatum
are scarce, and the role of presynaptic kainate receptors in the
cortico-striatal neurons is yet to be determined (Kieval et al., 2001).
However, in the nucleus accumbens – the limbic striatum – the
activation of presynaptic kainate receptors diminishes glutamate
release (Casassus and Mulle, 2002; Crowder and Weiner, 2002);
and there is evidence that activation of presynaptic kainate
receptors diminishes glutamate release in the GP (Jin et al., 2006)
and in the hippocampus (Vesikansa et al., 2007).
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4.2. Effect of striatal electrical train stimulation on the spiking rate of
GP neurons
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Electrical stimulation of the striatum has been extensively
employed to analyze the influence of the activity of the GABAergic
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3.3. Blockade of intrapallidal AMPA/kainate receptors potentiates the
inhibition of GP neurons evoked by striatal electrical stimulation
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4.1. Effect of striatal chemical stimulation on the GP spiking rate
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response to striatal stimulation with 40 and 50 mA
stimulus intensities was statistically significantly different when
compared to 10, 20 and 30 mA stimulus amplitudes. There were no
significant differences between 40 and 50 mA stimulations. It is
worth noting that striatal electrical stimulation did not evoke a
complete inhibition of pallidal neurons activity (Fig. 2A) as the
striatal chemical stimulation did. The inhibition evoked by the
electrical stimulation lasted only for as long as the stimulation
was present.
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Please cite this article in press as: Oviedo, A., et al., Differential inhibition of globus pallidus neurons by electrical or chemical
stimulation of the striatum. Neurosci. Res. (2008), doi:10.1016/j.neures.2008.08.011
G Model
NSR 2868 1–6
A. Oviedo et al. / Neuroscience Research xxx (2008) xxx–xxx
Both electrical and chemical stimulation of the striatum have
advantages and disadvantages. For example, chemical stimulation
avoids activation of en passant fibers and coactivation of numerous
cortical efferent fibers (Ohye et al., 1976), as well as dopaminergic
(Freund et al., 1984) and serotonergic fibers (Lavoie and Parent,
1990) among other striatal inputs (Mink, 1996). But depending on
the distribution volume, the drug can diffuse to other nuclei
causing direct effects; however, as evidenced in our work,
optimizing infusion volume and cannula placement can reduce
this drawback. In this context, previous works report that a volume
of 100 nl diffuses 1 mm3 in the striatum (Chevalier and Deniau,
1984), therefore, in our experiments the tip of the recording
electrode was placed 1.5 mm away from the striatal cannula and
the responses to direct GP cell activation due to volume diffusion
were previously identified.
Regarding electrical stimulation, the propagation of electrical
current through the brain can be an issue. The task of trying to
determine how much current is necessary to activate a given
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An interesting issue raised from our results is the lack of a
complete silencing of GP neurons during electrical stimulation of
the striatum. In normal conditions activation of the motor cortex
causes stereotyped GP responses that consist in an initial
excitation followed by an inhibition and a later excitation; this
response sequence could be due to the activation of cortico-STN
and cortico-striatal fibers: the cortical activation of STN neurons
that project to GP causes the first excitatory response that is
followed by the inhibitory response caused by the activation of
striato-pallidal fibers. This is because the conduction velocity of
STN-GP fibers is much higher than that of striato-pallidal fibers and
because the inhibition of GP neurons causes disinhibition of STN
neurons, which in turn excites again GP neurons (Kita et al., 2004;
Nambu et al., 2000).
Thus, the activation of cortical projection pathways would be a
prerequisite for the initial and late increase in pallidal activity.
Therefore, by avoiding the simultaneous activation of corticosubthalamic and subthalamic fibers, only the chemical stimulation
of the striatum produces a complete silencing in most of GP
neurons.
In conclusion, our data show a differential GP neurons spiking
response to chemical or electrical stimulation of the striatum. Coactivation of glutamatergic fibers during striatal electrical stimulation is an invariable effect that masks the inhibitory contribution
of the medium-size spiny neurons onto pallidal neurons.
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Acknowledgement
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This work was supported by grant 20061292 from SIP-IPN to
E.Q. A.D. was partially supported by SEP-promeP.
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4.4. Electrical stimulation of the striatum does not cause a complete
GP firing inhibition
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4.3. Advantages and disadvantages of chemical and electrical
stimulation of the striatum
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element at a given distance from an electrode is more difficult than
it appears. In previous works, the current-response curve from
monopolar electrical stimulus in the brain showed a stimulus
intensity-distance relationship. Thus, a proper stimulus-response
and electrode placement analysis should be carried out. In this
regard, a 50 mA stimulus intensity, as we employed here as
maximal stimulus intensity, would stimulate elements up to
distances of 700 mm (Ranck, 1975); thus, we consider that the
electrical propagation of this stimulus did not reach beyond
striatum. Supporting this idea, we observed that stimulus
intensities of +100 mA caused contraction of the ipsilateral
extremities, an indication that the current has propagated outside
the striatum directly stimulating the motoneurons of the internal
capsule. Further, a stimulus intensity of 80 mA caused irregular
activity in all recorded GP neurons. In some cases this stimulation
augments the activity followed by a silence or vice versa. This
irregular activity caused by large stimulus intensities can be
explained in accordance to the observations made by Katz and
Miledi (1965), whom determined that currents above the threshold for initiating an action potential would fail to generate a
propagated action potential. Thus, we think that in our case,
currents up to 80 mA hyperpolarize striatal projection neurons.
Therefore, to avoid extra-striatal spread of current and irregular
activity patterns when analyzing electrical stimulation responses
we choose a maximal electrical stimulus intensity of 50 mA. In this
regard, it is worth to mention that the analysis of decoupling
somatic and axonal activity, presynaptic stimulation, and activation of en passant fibers during electrical stimulation have received
little attention (McIntyre et al., 2004; Ranck, 1975), even though
striatal electrical stimulation is known to activate en passant fibers
(Ohye et al., 1976).
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striato-pallidal pathway on the spiking rate of pallidal neurons,
both in rat-brain slices (Nakanishi et al., 1985; Nambu and Llinas,
1994) and in vivo preparations (Kita et al., 2006). However, the
duration of striatal stimulation used in previous studies was
relatively short compared with the long stimulation time that we
employed here. In this context, responses of GP neurons to shortterm cortical and striatal electrical stimulation have been
thoroughly characterized (Kita et al., 2004, 2006; Nambu et al.,
1990). Besides, it is known that with in vivo long-lasting electrical
stimulation of the striatum, the levels of GABA but not those of
glutamate are increased in freely moving rats (Hiller et al., 2007),
due to the activation of GABAergic medium-size spiny collaterals
and GABAergic interneurons (Ogura and Kita, 2000). This activation implies the modification of the tonic discharge of striatal
projection fibers, thereby altering the spiking activity of GP
neurons in the anesthetized rat (Querejeta et al., 2001).
Our data show that train stimulation diminishes the spontaneous spiking rate of GP neurons in a stimulus intensity-dependent
manner. However, the maximal electrical stimulation that we used
in our protocols never caused a complete firing arrest. In this
context, our results suggest an important influence of the
activation of en passant fibers in the spiking activity of GP neurons
during electrical stimulation of the striatum.
Our data also suggest that the co-activation of afferent
glutamatergic fibers during electrical stimulation masks the
inhibitory effect of the striato-pallidal pathway on GP neurons,
effect that is disclosed by the intrapallidal blockade of AMPA/
kainate-receptors that potentiates the inhibition evoked by electrical
stimulation of the striatum. Supporting our hypothesis, it has been
reported that cortical efferent fibers projecting to STN pass through
the striatum (Miyachi et al., 2006), furthermore, STN neurons project
to the striatum (Takada et al., 1988), therefore, it is reasonable to
consider that striatal electrical stimulation activates both striatal
neurons and en passant cortical fibers that project to the STN as well
as STN fibers. In addition, there is evidence of an inhibition of the
tonic activation of NMDA receptors in the anesthetized rat (AraujoAlvarez et al., in press; Kelland and Chiodo, 1994). Moreover, in this
kind of preparation, non-NMDA receptors that mediate the activity
of subthalamic-pallidal pathway can be blocked in the GP (Soltis
et al., 1994). In contrast, Kita et al. (2004, 2006) have shown that
NMDA receptors are tonically activity in awake monkeys; this
discrepancy with our work could be due to the use of anesthesia that
modifies the glutamatergic transmission on the BG.
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Please cite this article in press as: Oviedo, A., et al., Differential inhibition of globus pallidus neurons by electrical or chemical
stimulation of the striatum. Neurosci. Res. (2008), doi:10.1016/j.neures.2008.08.011
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NSR 2868 1–6
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408 Araujo-Alvarez, J.M., Trujillo-Ferrara, J., Ponce-Franco, D., Correa-Basurto, J., Delgado, A., Querejeta, E., in press. (+)-(S)-Trujillon, (+)-(S)-4-(2,2-diphenyl-1,3,2409
oxazabolidin-5-oxo-)propionic acid, a novel glutamatergic analog, modifies the
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activity of globus pallidus neurons by selective NMDA receptor activation.
411
Chirality.
412 Q1
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Please cite this article in press as: Oviedo, A., et al., Differential inhibition of globus pallidus neurons by electrical or chemical
stimulation of the striatum. Neurosci. Res. (2008), doi:10.1016/j.neures.2008.08.011