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CISTEÍNA PROTEASAS
REVISIÓN
ENFERMEDADES DEL ADN MITOCONDRIAL
DOENÇAS DO DNA MITOCONDRIAL
Resumen. Introducción. Desde hace más de 30 años se conocen
diversas anomalías del metabolismo mitocondrial que producen enfermedades humanas. Entre ellas se encuentran los defectos en el
sistema de fosforilación oxidativa (sistema OXPHOS), la ruta final
del metabolismo energético mitocondrial que conduce a la síntesis
de ATP. Desarrollo. Este sistema presenta la particularidad de que
una parte de las subunidades proteicas que lo componen están codificadas en el ADN mitocondrial. En los últimos 12 años se han
descrito una serie de mutaciones (puntuales o deleciones) en el
ADN mitocondrial que se han asociado con síndromes clínicos bien
definidos originados por defectos en el sistema OXPHOS. Los caracteres clínicos de estas enfermedades son muy heterogéneos y, excepto en algún caso, afectan a gran variedad de órganos y tejidos.
Conclusiones. El diagnóstico preciso de este grupo de trastornos
requiere la obtención de datos clínicos, morfológicos, bioquímicos
y genéticos. La utilización de técnicas sencillas de genética molecular permite la detección rápida de mutaciones, incluso antes de que
puedan realizarse otros tipos de análisis. [REV NEUROL 2000; 31:
324-33] [http://www.revneurol.com/3104/j040324.pdf]
Palabras clave. ADN mitocondrial. Enfermedades mitocondriales.
Resumo. Introdução. Desde há mais de 30 anos que se conhecem
diversas anomalias do metabolismo mitocondrial que dão origem
a doenças humanas. Entre estas, encontram-se os defeitos no sistema de fosforilação oxidativa (sistema OXPHOS), o percurso
final do metabolismo energético mitocondrial, que conduz à síntese de ATP. Desenvolvimento. Este sistema apresenta a particularidade de parte das subunidades protéicas que o compõem estarem codificadas no ADN mitocondrial. Nos últimos 12 anos
foram descritas uma série de mutações (pontuais ou delecções)
no ADN mitocondrial associadas a síndromas clínicos bem definidos originados por defeitos no sistema OXPHOS. As manifestações clínicas destas doenças são muito heterogéneos e, excepto
em alguns casos, afectam uma variedade de órgãos e tecidos. Conclusões. O diagnóstico preciso deste grupo de perturbações requer
a obtenção de dados clínicos, morfológicos, bioquímicos e genéticos. A utilização de técnicas simples de genética molecular permite
a detecção rápida de mutações, inclusive antes de se poderem realizar outros tipos de análise. [REV NEUROL 2000; 31: 324-33]
[http://www.revneurol.com/3104/j040324.pdf]
Palavras chave. ADN mitocondrial. Doenças mitocondriais.
Cisteína proteasas y neurodegeneración
J. Jordán, M.ªF. Galindo, V. Ceña, C. González-García
CYSTEINE PROTEASES AND NEURODEGENERATION
Summary. Objective. This is a review of the part played by the cysteine proteases in different physiological and pathological
processes. Development. Apoptotic processes have a crucial function in control of the number of cells in multicellular organisms,
both during development and throughout life. Alterations in these are closely related to different pathological processes, from
cancer (with fewer apoptotic processes) to the degenerative disorders in which apoptosis is increased. Although the stimuli which
may induce apoptosis are very varied, the apoptotic phenotypes are similar. Different metabolic routes are involved in apoptosis
and in these changes, both in transcription and postranscription. The latter form the basis of this paper. We review the role of
the cysteine protease family, in which the caspases and calpains are the best representatives, which have been related to different
degenerative models. In this review we describe the stimuli and cascades of intracellular signalling which occur on activation.
Conclusion. These proteases are involved in many situations involving the development and maintenance of the number of cells
in the tissues, both physiological and pathological. They may be considered to be possible therapeutic targets in neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease, amyotrophic lateral sclerosis, Parkinson’s disease and Huntington’s chorea. [REV
NEUROL 2000; 31: 333-40] [http://www.revneurol.com/3104/j040333.pdf]
Key words. Apoptosis. Calpains. Caspases. Mitochondria. Neurodegeneration. Proteases.
INTRODUCCIÓN
La disminución del número de neuronas en el sistema nervioso,
tanto periférico como central, es un proceso fisiológico que ocurre
durante algunos estadios del desarrollo, en los que se ha descrito
una pérdida de casi un 50% en algunas poblaciones neuronales
[1,2]. Esta disminución neuronal también sucede en situaciones
patológicas, como la esclerosis lateral amiotrófica y las enfermedades de Alzheimer, Parkinson y corea de Huntington [3-5]. Tanto en situaciones fisiológicas como patológicas, los procesos de
muerte celular pueden agruparse en dos bloques: apoptóticos y
necróticos. Estos últimos englobarían los procesos degenerativos
Recibido: 16.06.00. Aceptado tras revisión externa sin modificaciones:
27.06.00.
Instituto de Neurociencias. Facultad de Medicina. Universidad Miguel
Hernández. Alicante, España.
Correspondencia: Dra. Carmen González-García. Instituto de Neurociencias.
Facultad de Medicina. Campus de San Juan. Ctra. de Valencia N-332, km 87.
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agudos como los implicados en traumatismos y focos isquémicos,
entre otros [5].
Bajo el concepto de apoptosis se agrupan procesos de muerte
neuronal que necesitan de la participación de diferentes rutas
metabólicas, que incluyen tanto la activación de cascadas transcripcionales [6,7] (hecho por el que también se conoce como muerte
celular programada) como postranscripcionales. El papel de los
mecanismos postranscripcionales ha adquirido mayor importancia a partir de estudios que ponen de manifiesto cómo algunos
modelos apoptóticos no requieren la síntesis de novo de ARN y/o
de proteínas. Entre las modificaciones postranscripcionales desE-03550 San Juan, Alicante. Fax: +34 96591 9490. E-mail [email protected]
Agradecimientos. Este trabajo ha sido financiado, en parte, gracias a las
ayudas SAF98-0140 y 2FD97-0647 de CICYT a la Dra. Carmen González
García y SAF96-0169, 1FD97-0500 y Fundación Navarro Trípodi al
Dr. Valentín Ceña.
 2000, REVISTA DE NEUROLOGÍA
333
J. JORDÁN, ET AL
critas en algunas enfermedades neurodegenerativas destacan cambios ‘reversibles’
en los estados de fosforilación de las proteínas, translocaciones de proteínas desde
unos compartimentos a otros y cambios
‘irreversibles’ como hidrólisis controlada
de proteínas mediante la activación de determinadas proteasas.
El papel de las proteasas en la muerte
celular se puso de manifiesto en un principio gracias al uso de fármacos inhibidores
de proteasas no específicos. Sin embargo,
no se ha descrito una degradación global
de todas las proteínas, por lo que se postula que sólo un número determinado de proteasas está implicado en la apoptosis. Estas enzimas hidrolizarían bien proteínas
reguladoras de procesos anti-apoptóticos,
bien enzimas que promueven la muerte
celular.
Aunque los estímulos que desencadenan los procesos de muerte neuronal pueden
ser de naturaleza muy distinta,losfenotipos
apoptóticos son bastante similares, lo que
indica que la mayoría de los mecanismos y
rutas metabólicas de la fase efectora están
probablemente muy conservados. Esta teoría está refrendada por el hecho de que, independientemente de la naturaleza de los
estímulos inductores, los procesos apoptóticos pueden ser bloqueados por la inhibición
de diferentes familias de proteasas, entre las
que cabe destacar, y son el eje de esta revisión, las cisteína proteasas.
Figura 1. Mecanismo de activación de caspasas en respuesta al calcio o al factor de necrosis tumoral
(TNF). ERO: especies reactivas de oxígeno.
Tabla I. Clasificación de las caspasas.
Caspasa
Otras
denominaciones
Locus
Posición de hidrólisis
de la procaspasa
Centro
activo
Secuencia de
reconocimiento
Caspasa-1
ICE
11q2
Asp-103, Asp-119,
Asp-297, Asp-316
WFKD
WEHD
LA FAMILIA DE LAS CISTEÍNA
PROTEASAS
Caspasa-2
ICH-1, Need 2
7q35
Asp-152, Asp-316,
Asp-330
DQQD
DEHD
La familia de las cisteína proteasas engloba
a todas aquellas proteasas que presentan un
residuo de cisteína en su centro catalítico.
Los miembros de esta familia que desempeñan un papel importante en los procesos
apoptóticos en el sistema nervioso son las
caspasas y las calpaínas.
Caspasa-3
CPP32, YAMA,
apopain
4q35
Asp-9/Asp-28,
Asp-175
IETD
DEVD
Caspasa-4
ICErel-II, TX,
ICH-2
11q2
Asp-104, Asp-270,
Asp-289
WVRD
W/LEHD
Caspasa-5
ICErel-III, TY
11q2
Asp-121, Asp-311,
Asp-330
WVRD
W/LHD
Caspasa-6
Mch2
4q25
Asp-23, Asp-179,
Asp-193
TEVD
VEHD
Caspasa-7
Mch3, ICE-LAP3,
CMH-1
10q2
Asp-23, Asp-198
IQAD
DEVD
Caspasa-8
FLICE, MACH,
Mch5
2q33
Asp-210, Asp-216,
Asp-374, Asp-384
VETD
LETD
Caspasa-9
ICE-LAP6, Mch6
1q36
Asp-130, Asp-315,
Asp-330
PEPD
LEHD
Caspasa-10
Mch4, FLICE2
2q33
Asp-219, Asp-372
IEAD
LEAD
Caspasa-11
ICE-3
Las caspasas
Las caspasas son una familia de cisteína
proteasas que han sido reconocidas como
los homólogos en mamíferos del producto
del gen ced-3, descrito inicialmente en el
nematodo Caenorhabditis elegans como
gen proapoptótico implicado en los procesos de muerte celular que tienen lugar durante su desarrollo embrionario.
El término ‘caspasa’ se basa en un sistema de nomenclatura consensuada [8]. De
esta manera, comienza por ‘c’ por contener
un residuo de cisteína en su centro activo,
termina en ‘asa’ por tratarse de una enzima
y se intercala ‘asp’ debido a su especifici-
334
MAED
Caspasa-12
ATAD/ ADTD
Caspasa-13
ERICE
Caspasa-14
MICE
WVSD
19q1
LGGD
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CISTEÍNA PROTEASAS
cuales darán lugar a la posterior activación
en cadena de otros miembros de la familia.
Caspasa
Estímulo
Modelo
Quizás por ello, se ha propuesto un papel
para las caspasas en muchos modelos de
Caspasa-1
Mutaciones en SOD
Animales transgénicos
muerte apoptótica (Tabla II).
Hipoxia
Cultivos neuronales
Isquemia/reperfusión
Retina
La activación de las caspasas por estímulos
extracelulares se ha relacionado con
Caspasa-2
Retirada de NGF
Células PC-12, células simpáticas
algunas proteínas de membrana, como la
de ganglio cervical superior
β-amiloide
Neuronas de hipocampo
familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés Tumor NeCaspasa-3
β-amiloide (25-35)
Neuronas de hipocampo
crosis Factor), el receptor del factor de
NMDA
Neuronas de hipocampo
Radiaciones gamma
crecimiento nervioso (NGF, del inglés
Colchicina
Células granulares
Nerve Growth Factor) y el receptor del
6-OHDA
Neuronas de cerebelo
Enfermedad de Parkinson
Neuronas dopaminérgicas
Fas (FasR), también conocido como Apo-1
Malonato
o CD-95.
Isquemia
La activación de FasR se produce en
NP-3
la trimerización del receptor que recluta
Caspasa-6
N-metil-N-nitosurea
Fotorreceptores
tanto la molécula adaptadora FADD (Fas
Associated Death Domain) como la proCaspasa-8
N-metil-N-nitosurea
Fotorreceptores
FAS
Motoneuronas
caspasa-8 que se activa y forma un comβ-amiloide
plejo multimérico conocido como DISC
(Death-Inducing Signal Complex). La
Caspasa-9
↑[Ca2+], ↑[Pb2+]
Retina
caspasa-8, así formada, puede a su vez
Caspasa-12
β-amiloide
Neuronas corticales
activar a otras caspasas bien de una forma directa, como ocurre con la procaspasa-3, o indirecta mediante la hidrolizadad en realizar proteólisis tras un residuo de aspartato. Las caspa- ción de bid, producto de un oncogén proapoptótico de la familia
sas se nombran por el orden cronológico de su descubrimiento: de los bcl-2 que induce la liberación de citocromo c desde la
caspasa-1, caspasa-2, etc., y la enzima convertidora de la interleu- mitocondria, lo cual es requerido para la posterior activación de
cina (ICE) se denomina caspasa-1; en la actualidad, se han descrito la procaspasa-9 (Fig. 1).
La activación de las caspasas vía receptor está implicada en
14 caspasas (Tabla I).
Las caspasas pueden dividirse en tres grandes grupos: a) cas- diferentes modelos apoptóticos como el que tiene lugar en las mopasas implicadas en la producción de citocinas (caspasas 1, 4, 5 y toneuronas espinales tras establecer el contacto con su órgano diana.
13); b) caspasas de señalización o de activación de otras caspasas Dichas neuronas expresan el receptor de Fas y su ligando FasL en
(caspasas 2, 8, 9 y 10), y c) caspasas efectoras de muerte o eje- el período en el cual los procesos de muerte neuronal programada
comienzan a aparecer. La presencia de Fas-Fc, agente que bloquea
cutoras (caspasas 3, 6 y 7) que hidrolizan sustratos selectivos.
Los diferentes miembros de la familia de las caspasas compar- las interacciones entre FasR y FasL, o del tetrapéptido IETD (un
ten similitudes en sus secuencias aminoacídicas, estructuras y inhibidor de la caspasa-8), confiere neuroprotección a los cultivos
especificidad por los sustratos. Todos ellos son sintetizados como de motoneuronas de pollo [11]. La sobreexpresión de una forma
precursores inactivos o cimógenos. Las caspasas presentan nor- mutada, afuncional, del receptor FADD protege a cultivos neuronamalmente una localización citosólica, aunque se han observado en les frente a la toxicidad inducida por un péptido amiloide [12].
Entre los estímulos intracelulares capaces de activar las caspael interior de mitocondrias y del retículo endoplasmático, así como
en el núcleo. Algunas caspasas poseen la capacidad de translocar- sas destacan los mediados por orgánulos como es el caso de la
se desde un compartimento intracelular a otro tras un estímulo mitocondria. La integridad funcional de la mitocondria parece
apoptótico. Como ejemplo citaremos las caspasas 2 y 9 que se estar comprometida durante algunos procesos de apoptosis. La
translocan desde la mitocondria al citosol, mientras que la caspa- disminución del potencial transmembrana mitocondrial, la perturbación de la cadena transportadora de electrones con la consecuensa-7 lo hace desde el citosol a la mitocondria [9,10].
te caída de los niveles de ácido adeniltrifosfórico (ATP) y la proProcesos de activación de las caspasas
ducción de radicales libres, son eventos característicos de esta
Como se comentó anteriormente, las caspasas sesintetizan enforma alteración. Durante los procesos de muerte celular se produce la
de precursores inactivos los cuales pueden activarse por mecanismos liberación de algunas proteínas del espacio intramembrana mitomuy diversos que engloban desdeestímulosextracelularesmediados condrial al citosol, como es el caso del citocromo c, proteína de la
por la activación de receptores, a estímulos intracelulares entre los que cadena transportadora de electrones requerida como cofactor en la
destacaríamos los mediados por segundos mensajeros (calcio y espe- formación de un complejo, denominado apoptosoma, constituido
cies reactivas a oxígeno), orgánulos (mitocondria y el retículo endo- por tres elementos más: la molécula adaptadora apaf-1 (factor
plasmático), así como por la acción de proteasas de otras familias o por inductor de apoptosis-1 considerado homólogo del gen ced-4descrito en C. elegans), la procaspasa-9 y el dATP. La formación del
acciones autocatalíticas (Fig. 1).
Las procaspasas contienen en su estructura regiones que pue- apoptosoma es requerida para la activación de la caspasa-9 [13].
den ser reconocidas e hidrolizadas por la misma caspasa a la que La capacidad de regular la liberación del citocromo c sitúa a la
dan origen o por otras caspasas. Dependiendo del origen del estí- mitocondria como centro de decisión entre muerte y supervivencia
mulo apoptótico, inicialmente se activan diferentes caspasas, las celular en la cascada apoptótica.
Tabla II. Participación de caspasas en modelos de muerte neurodegenerativa.
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335
J. JORDÁN, ET AL
El calcio libre intracelular se considera Tabla III. Sustratos e inhibidores de las caspasas.
en la actualidad como el segundo mensajeSustrato
Inhibidor
ro más importante en muchos de los procesos neurodegenerativos. Se han descrito Caspasa
Endógeno
Sintético
Endógeno
Sintético
modificaciones en su concentración intra2+
CrmA, p35 Z-VAD-FMK,
celular ([Ca ]i) en procesos de muerte neu- Caspasa-1 ProIL-1β Ac-YVAD-AFC/pNA,
MCA-YVADAPK(DNP)-OH,
Ac-VAD-CHO,
ronal inducida por excitotoxicidad o por el
AC-WEHD-AFC/pNA,
BACMK,
péptido β-amiloide [14].
MCA-YEVDGWK,
Z-YVAD-FMK,
ZVAD-AFC/pNA,
Ac-YVAD-CHO
La mitocondria es un orgánulo que presenta una alta capacidad de amortiguar cam- Caspasa-2 PARP,
XIAP
Z-VDVAD-FMK
bios en la [Ca2+]i y, en su membrana, se
espectrina
Glogin-160
localizan algunos miembros de la familia
bcl-2 conocidos por desempeñar un papel Caspasa-3 PARP,
MCA-DEVDAR[K-DNP]-NH2 ,
p35, XIAP,
Z-VAD-FMK
crítico en la regulación de los procesos de
DNA-PK,
MCA-VDQMDGWK-(DNP)-NH2 ,
DIAP
Ac-VAD-CHO,
SER/B,
Z-DEVD-AFC,
Z-DEVD-FMK/CHO,
muerte celular. Miembros de esta familia
prho-GDI, MCA-DEVDAPK(DNP)-OH,
Ac-DEVD-CHO/CMK,
de oncogenes, como el propio bcl-2, son
PAK2,
Ac-DEVD-pNA
Biotin-X-DEVD-FMK,
presenilinas
Ac-DMQD-CHO,
capaces de regular la apertura del poro de
Z-DQMD-FMK,
transición mitocondrial y desempeñan una
AC-ESMD-CHO
función clave en la regulación de la activaAc-LEVD-AFC,
p35
Z-VAD-FMK,
ción de las caspasas. El bcl-2 es capaz de Caspasa-4
Ac-WEHD-AMC
Ac-VAD-CHO,
impedir la salida del citocromo c desde la
Ac-LEVD-CHO/AFC
mitocondria y bloquear la posterior activaMCA-LEVDGWK-(DNP)-NH2,
Z-VEID-FMK,
ción de las caspasas. Es más, el bcl-2 inhibe Caspasa-5
Ac-LEVD-AFC
la muerte celular en situaciones donde el
citocromo c se encuentra ya en el citoplas- Caspasa-6 Lamin A Ac-WEHD-AFC,
p35
Z-WEHD-FMK,
Ac-VEID-AMC/pNA,
Z-VEID-FMK/-CHO,
ma, como sucede en células en las que se ha
Z-VEID-AFC
VEID-CHO,
microinyectado dicho citocromo [15]. Aunque la translocación del citocromo c desde Caspasa-7 PARP
Ac-DQTD-AMC,
p35, XIAP
Z-VAD-FMK,
Ac-DEVD-AMC,
Ac-VAD-CHO
la mitocondria al citoplasma se ha asociado
MCA-VDQVDGWK-(DNP)-NH2
DVED-CHO
a una caída del potencial mitocondrial, en
algunos modelos estos dos sucesos no se Caspasa-8
Ac-IETD-AMC
CrmA, p35 Z-IETD-FMK/CHO
encuentran directamente relacionados;
Ac-LEHD-AFC
IAP
Z-LEHD-FMK/CHO
como ejemplos, citaremos la retirada del Caspasa-9 PARP
NGF del medio de cultivo de neuronas simpáticas o la exposición de neuronas de hipocampo a estaurosporina [16,17].
Otros estímulos intracelulares que activan las caspasas son to e hidrólisis de los sustratos por estas enzimas. De hecho, las
las especies reactivas de oxígeno (ERO). Desequilibrios del me- caspasas no hidrolizan todas las proteínas que contienen dicha setabolismo oxidativo y el consecuente estrés oxidativo constitu- cuencia de aminoácidos y, por ello, nunca sucede una degradación
yen un factor común en el origen y en la progresión de procesos aleatoria de proteínas celulares en los procesos de apoptosis. Entre
neurodegenerativos (ver revisión en [18]). Un ejemplo del papel los sustratos descritos para las caspasas destacan numerosos elede las ERO como segundos mensajeros encargados de activar las mentos del citoesqueleto (actina, fodrina, proteína tau y catenina),
caspasas queda reflejado en la muerte celular en cultivos neuro- enzimas encargadas de reparar (PARP) [24] o degradar (ADNasa)
nales inducida por 4-hidroxinonenal (HNE), un producto resul- [25] el ADN celular, factores de transcripción (retinoblastoma,
tante de la peroxidación lipídica. El HNE induce la activación de MDM2) [26], y proteínas reguladoras cinasas y fosfatasas (proteína
diferentes caspasas como la 3, 8 y 9 y fármacos antioxidantes cinasa C, fosfatasas 2A, cinasas de adhesión focal, Akt, raf1), así
como la cisteína, la N-acetil-L-cisteína y el ditiothreitol (DTT) como productos de la familia del oncogén bcl-2 (bid) [27].
Existen inhibidores de caspasas de naturaleza proteica como
bloquean dicha activación, así como la hidrólisis de poli
ADP-ribosa polimerasa (PARP) y la fragmentación del ADN [19]. la crmA (cytokin response modifier enzyme A), p35 y el péptido
Las caspasas también pueden ser activadas por otras protea- inhibidor de apoptosis (IAP, del inglés Inhibitor Apoptosis Pepsas. Por ejemplo, la granzima B, liberada desde las células T, tide), todos ellos de origen vírico [28-32], así como homólogos
puede hidrolizar directamente a procaspasas o activar el producto de esta última proteína en mamíferos, como el péptido inhibidor
del oncogén bid [20]. Por otro lado, las calpaínas y las catepsinas de apoptosis neuronal (NAIP, del inglés Neuronal Inhibitor
se han relacionado también con la activación de las caspasas [21,22]. Apoptosis Peptide) [33-36] (Tabla III).
Existen diversos fármacos de origen sintético capaces de inSustratos e inhibidores de las caspasas
hibir a uno o a varios miembros de la familia de las caspasas. La
Una de las características bioquímicas más notables de las caspasas estructura de estos fármacos contiene la secuencia de aminoácies su alta especificidad por los sustratos que hidrolizan. Las caspa- dos que puede ser reconocida por una o varias caspasas. Muy
sas reconocen secuencias específicas de cuatro aminoácidos que brevemente destacaremos los péptidos Z-VAD-FMK
contienen un residuo aspartato (Tabla I) [23]. Sin embargo, la es- [Z-Val-Ala,Asp(oMet)-CH2 F], un inhibidor irreversible altamentructura ternaria de las proteínas resulta crucial en el reconocimien- te específico para las caspasas 1, 3, 4 y 7, y el Z-DEVD-FMK
336
REV NEUROL 2000; 31 (4): 333-340
CISTEÍNA PROTEASAS
Figura 2. Mecanismos de activación y sustratos de calpaínas.
(Asp-Glu-Val-Asp-FCMK), inhibidor de la caspasa-3. Otros inhibidores se muestran en la tabla III. En la actualidad, se está
trabajando en la búsqueda de nuevos inhibidores de caspasas con
una alta especificidad y capaces de atravesar mejor las membranas
citoplasmáticas.
Las caspasas como diana terapéutica
Como ya se ha mencionado, diferentes miembros de la familia de
las caspasas han sido implicados en procesos neurodegenerativos
de diversa naturaleza (Tabla II). En muchos de ellos, la inhibición farmacológica de las caspasas resulta crucial para mantener la viabilidad de células del sistema nervioso. En esta revisión nos centramos en la caspasa-3 por ser uno de los primeros
miembros descritos y por su localización en un lugar ‘central’
o ‘de reclutamiento’ dentro de la ‘red de las caspasas’.
Sobre la base de datos obtenidos de modelos de muerte celular
en cultivos neuronales y en estudios en animales transgénicos, se
ha propuesto que la activación de la caspasa-3 podría estar implicada en algunas enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson y la corea de Huntington.
El tratamiento de cultivos neuronales con el fragmento 25-35
del péptido β-amiloide[βA(25-35)] produce una activación de la
caspasa-3. La utilización de inhibidores de caspasas protege a
dichos cultivos de la disminución de la viabilidad celular inducida
por βA(25-35). Algunos inhibidores de caspasas como el péptido
Ac-DEVD-CHO previene la fragmentación del ADN en este
cultivo [37] y el péptido ZVAD-CH2 -DCB, la hidrólisis de la
enzima PARP, a la vez que mantiene la integridad de la membrana
citoplasmática [38]. Por otro lado, la caspasa-3 presenta una mayor
afinidad para degradar formas mutadas de presenilinas presentes
en pacientes con enfermedad de Alzheimer [39].
Mutaciones en la enzima citoplasmática superóxido dismutasa,
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que disminuyen su actividad, han sido relacionadas con la esclerosis lateral amiotrófica. Ratones manipulados genéticamente que
expresan formas mutadas de esta enzima
[SOD1(G93A)] presentan una sobreexpresión de las caspasas-1 y 3 [40]. En estos ratones la administración intracerebroventricular del péptido inhibidor de caspasas
ZVAD-FMK retrasa la aparición de los síntomas y alarga la duración de la vida [41].
Se está comenzando a utilizar con cierto
éxito los inhibidores de caspasas en pacientes con enfermedad de Parkinson. Así, el
péptido inhibidor Ac-YVAD-CMK favorece la viabilidad de los implantes de neuronas
dopaminérgicas y mejora sustancialmente
la recuperación funcional de ratas parkinsonianas [42]. En modelos experimentales de
esta enfermedad, como la pérdida neuronal
dopaminérgica descrita tras la administración intraestrial de 6-hidroxidopamina
(6-OH-DA) [43], el péptido ZVAD-FMK
presenta efectos neuroprotectores. Este inhibidor, junto con Ac-DEVD-CHO, atenúan
los procesos de muerte inducidos por el
1-metil-4-fenilpiridino (MPP+), metabolito
activo del MTPT.
Las caspasas se han convertido en una
nueva diana farmacológica en los intentos por paliar los daños inducidos durante y tras los procesos de isquemia cerebral, donde la
actividad enzimática de la caspasa-3 está progresivamente incrementada [44]. Así, el péptido DEVD-CHO disminuye el número de
células apoptóticas en diversos modelos de neurodegeneración, y se
ha descrito que la combinación de inhibidores de las caspasas con
antagonistas de los receptores glutamatérgicos, como la dizocilpina
(MK-801), proporcionan un efecto neuroprotector sinérgico [45].
El uso de animales modificados genéticamente es una herramienta útil para el estudio de la implicación de determinadas rutas
metabólicas en los procesos apoptóticos. Animales que no expresan las caspasas 3 y 9 presentan graves malformaciones específicas en el cerebro debido a la disminución de los procesos apoptóticos y a hiperplasia del mismo durante el desarrollo [46,47]. Sin
embargo, la deleción de las caspasas 1, 2 u 11 no modifica significativamente el desarrollo del cerebro [48,49], aunque los animales que carecen de caspasas 1 y 11 muestran una tolerancia mayor
frente a estímulos endotóxicos [50].
Las calpaínas
Las calpaínas se engloban dentro de la superfamilia de las cisteína
proteasas conocida como papaínas. Las calpaínas se distinguen de
otros miembros de esta familia porque requieren la presencia de
calcio para su activación. Los niveles de calcio intracelular necesarios para alcanzar la mitad de su actividad enzimática máxima
han servido de base para la clasificación de las calpaínas [51,52].
La µ-calpaína requiere valores comprendidos entre 5-50 µM,mientras que para la m-calpaína el intervalo es de 0,2-1 µM.
La activación de la procalpaína requiere su translocación y
unión a la membrana citoplasmática, seguida de una rápida autólisis. La calpaína es un heterodímero compuesto por una subunidad larga de 80 kDa y otra corta de aproximadamente 30 kDa
(Fig. 2) [53]. La subunidad larga contiene el centro catalítico y es
337
J. JORDÁN, ET AL
Tabla IV. Calpaínas.
Sustratos
Endógenos
Calpaína
p53, bax,
tropioninas,
neurofilamentos,
espectrina,
actina, MAP-2
proteína tau,
p35
Inhibidores
Sintéticos
Endógenos
Suc-Leu-Tyr-AMC
Boc-Val-Leu-Lys-AMC
Calpastatina
única para cada isoenzima, mientras que la subunidad corta se
considera como una subunidad reguladora y es común para algunas calpaínas [54]. La homología de la secuencia de aminoácidos
entre las subunidades largas es de casi un 50%, alcanza valores
cercanos al 75% en el dominio proteasa y al menos de un 50% en
el lugar de unión al calcio [55].
Algunas ERO desempeñan un papel crucial en los procesos de
activación de las calpaínas pues son capaces de alterar la homeostasis de la [Ca2+]i. Este es el caso del óxido nítrico que resulta
tóxico en cultivos neuronales de hipocampo debido a un mecanismo que implica la activación de las calpaínas [56].
Sustratos e inhibidores de las calpaínas
Las calpaínas proteolizan una amplia variedad de sustratos implicados en los procesos de muerte neuronal como factores de transcripción, oncogenes [57], segundos mensajeros, gran variedad de
enzimas [58-60] y proteínas de membrana y del citoesqueleto
[58,61] (Fig. 2, Tabla IV). La afinidad hacia estos sustratos puede
verse alterada por modificaciones postranscripcionales como el
estado de fosforilación y de glicosilación de las proteínas. La
acción proteolítica sobre estos sustratos confiere a las calpaínas
un papel relevante en fenómenos celulares como las cascadas de
señalización intracelular, el tráfico de vesículas, la modulación de
la estructura celular, el crecimiento de las neuritas y la remodelación de las dendritas, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas [62,63]. Sin embargo, la sobreactivación de las calpaínas en respuesta a procesos excitotóxicos o isquémicos produce
un aumento de la degradación de las proteínas estructurales y
contribuye a los procesos de muerte neuronal [38].
La calpastatina es el único inhibidor endógeno conocido para
las calpaínas. Presenta una inhibición reversible y específica a
la vez que carece de efecto sobre otras cisteína proteasas como
la catepsina B o papaína. La calpastatina presenta en su estructura cinco dominios constituidos por unos 140 aminoácidos,
donde el dominio N-terminal es seguido por cuatro dominios
homólogos que muestran su actividad inhibitoria en presencia
de calcio. La secuencia consenso presente en cada dominio inhibitorio, necesaria y suficiente para inhibir a la calpaína, es
LGXK(R)D(E)XTIPPXYRXLL. La calpastatina es hidrolizada
por las calpaínas en varias regiones interdominio, de manera que
se generan diferentes péptidos inhibidores y se obtiene como
resultado que, a partir de una sola molécula de calpastatina,
puedan inhibirse varias moléculas de calpaína [53].
En la actualidad, disponemos de fármacos de origen sintético
que presentan la capacidad de inhibir la actividad enzimática de las
calpaínas, entre ellos destacamos ALLN (N-acetil-Leu-Leu-NleCHO), ALLM (N-acetil-Leu-Leu-Met-CHO), MDL 28170 (Z-ValPhe-CHO), E-64 y α-mercaptoacrilato(PD150606).
338
Sintéticos
Calpeptin,
N-acetil-Leu-Leu-Nle-CHO (ALLN),
N-acetil-Leu-Leu-Met-CHO (ALLM)
Z-Val-Phe-CHO (MDL 28170),
E-64, PD150606,
Z-Leu-Leu-Tyr-CH 2F,
Mu-Val-HPh-FMK/CH 2F
Las calpaínas en los procesos degenerativos
Se ha relacionado a las calpaínas con procesos degenerativos
tanto en neuronas como en otros tipos celulares (senescencia de
los eritrocitos). Así, el déficit de calpaína-3, específica del tejido
muscular esquelético, se ha asociado a distrofias musculares y la
activación de las m- y las µ-calpaínas con los procesos de neurodegeneración [64]. En el sistema nervioso se ha descrito que
la activación anormal de la calpaína media el daño neuronal en
los procesos de excitotoxicidad en los que se han observado
niveles anormales de la concentración intracelular del ion calcio. Como ejemplo de excitotoxicidad, citaremos la exposición
de cultivos de neuronas de hipocampo a dosis letales de ácido
N-metil-D-aspártico (NMDA) [38], hecho que está específicamente ligado a la entrada de calcio por el receptor de NMDA y
no a un incremento inespecífico de la [Ca 2+]i [65].
En la enfermedad de Alzheimer se ha descrito que la calpaína
I se encuentra sobreactivada en áreas del neocórtex [66]. Una
activación persistente de las calpaínas contribuye al daño de los
neurofilamentos y a un anormal procesamiento y tráfico de la
proteína precursora del amiloide. Otro sustrato de las calpaínas
es la proteína tau, una proteína asociada a los microtúbulos que
desempeña un papel importante en el mantenimiento de la estructura neuronal. La proteína tau se encuentra hidrolizada en
pacientes con enfermedad de Alzheimer, en los cuales aparecen
acúmulos citoplasmáticos de productos de degradación de la
proteína tau que carecen de la capacidad de asociarse con los
microtúbulos [67].
La expresión de m-calpaína se encuentra aumentada en el
mesencéfalo de pacientes con enfermedad de Parkinson, y presenta una localización en las fibras y en los soma de neuronas de la
sustantia nigra, en el área tegmental ventral, en células del grupo
A8 catecolaminérgicas y en el locus coeruleus [68]. También en
los procesos isquémicos se ha descrito una sobreactivación de
µ-calpaína en las áreas isquémicas [69] y se ha observado la proteólisis de la α-espectrina en áreas del hipocampo, tanto en las
fases iniciales como en las zonas de penumbra isquémica [70].
El uso de fármacos inhibidores de las calpaínas ha proporcionado información valiosa sobre su implicación en procesos neurodegenerativos. Como ejemplo, citaremos el fármaco MDL28170
que promueve la recuperación de las respuestas sinápticas en rodajas de hipocampo sometidas a hipoxia y que se muestra eficaz
frente a los procesos de muerte neuronal inducidos por estímulos
tan diferentes como el péptido βA(25-35), la estaurosporina y el
NMDA en cultivos neuronales de hipocampo de rata [71]; los
compuestos ALLnL y ALLnM que protegen líneas celulares frente a estímulos como el NMDA y la glicoproteína del virus del sida
gp120 [72] y, por último, los derivados del α-mercaptoacrilato,
como el PD150606, que confieren protección a cultivos neurona-
REV NEUROL 2000; 31 (4): 333-340
CISTEÍNA PROTEASAS
les cerebro-corticales frente al daño inducido por estímulos hipóxicos/hipoglucémicos [73]. Es de resaltar que los niveles de
calpastatina, inhibidor endógeno, se encuentran también marcadamente reducidos en las capas II-V del neocórtex de pacientes
con enfermedad de Alzheimer [66].
CONCLUSIONES
A lo largo de esta revisión hemos descrito la función de dos familias de cisteína proteasas, las caspasas y las calpaínas, en diferentes modelos de neurodegeneración. La utilización de fármacos
inhibidores de dichas proteasas han puesto de manifiesto su papel
en los procesos de muerte neuronal. En la actualidad, se están
analizando como dianas terapéuticas en algunos procesos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis
lateral amiotrófica y la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, un
hecho que constituye un lastre para la utilización de estos fármacos en la terapéutica es que los procesos de apoptosis están implicados en la homeostasis fisiológica del número de células desde
las etapas del desarrollo hasta las del envejecimiento en los organismos pluricelulares, así como en la retirada de células dañadas
tras un evento patológico. Por lo tanto, una inhibición inespecífica
de los procesos apoptóticos, mediante la utilización de estos fármacos, podría resultar perjudicial, ya que podría degenerar en
hiperplasias, al utilizar los tejidos biológicos los procesos de apoptosis como reguladores de su renovación. Por todo ello, antes de
la utilización clínica de estos fármacos se ha de profundizar en la
búsqueda de inhibidores más específicos de proteasas implicadas
exclusivamente en los procesos de muerte celular en condiciones
patológicas.
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CISTEÍNA PROTEASAS Y NEURODEGENERACIÓN
Resumen. Objetivo. Revisar el papel que desempeñan las cisteína
proteasas en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Desarrollo.
Los procesos apoptóticos tienen una función crucial en el control del
número de células en los organismos pluricelulares, tanto durante su
desarrollo como a lo largo de la vida. Sus alteraciones se encuentran
relacionadas íntimamente con diferentes patologías que englobarían
desde el cáncer, con disminución de los procesos apoptóticos, a las
enfermedades degenerativas, con aumento de dichos procesos. Aunque los estímulos capaces de inducir apoptosis son muy diversos, los
fenotipos apoptóticos son muy similares. Diferentes rutas metabólicas
están implicadas en la apoptosis y en sus alteraciones, tanto a nivel
transcripcional como postranscripcional. Estas últimas constituyen el
eje de este artículo; en concreto, revisamos el papel de la familia de las
cisteína proteasas –con las caspasas y las calpaínas como mejores
representantes– que han sido relacionadas con diferentes modelos
degenerativos. A lo largo de esta revisión se presentan los estímulos
y cascadas de señalización intracelular que conllevan a su activación.
Conclusión. Estas proteasas están implicadas en un gran número de
situaciones fisiológicas (desarrollo y mantenimiento del número de
células de los tejidos) y patológicas, y podrían considerarse posibles
dianas terapéuticas en enfermedades neurodegenerativas tales como
la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson y la corea de Huntington. [REV NEUROL 2000;
31: 333-40] [http://www.revneurol.com/3104/j040333.pdf]
Palabras clave. Apoptosis. Calpaínas. Caspasas. Mitocondria. Neurodegeneración. Proteasas.
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CISTEÍNA PROTEASES E A NEURODEGENERESCÊNCIA
Resumo. Objectivo. Rever o papel desempenhado pelas cisteína proteases em diversos processos fisiológicos e patológicos. Desenvolvimento. Os processos apoptóticos possuem uma função crucial no
controlo do número de células nos organismos pluricelulares, tanto
durante o seu desenvolvimento, como ao longo da sua vida. As suas
alterações estão intimamente relacionadas com diferentes patologias
que englobam desde o cancro, com diminuição dos processos apoptóticos, às doenças degenerativas, com aumento dos referidos processos. Embora os estímulos capazes de induzir a apoptose sejam muito
diversos, os fenotipos apoptóticos são muito semelhantes. Na apoptose e nas suas alterações, estão envolvidas diferentes vias metabólicas,
tanto a nível da transcripção como pós-transcripcional. Estas últimas
constituem o eixo deste artigo; em concreto, revemos o papel da família das cisteína proteases, com as caspases e calpaínas como melhores
representantes, tendo sido relacionadas com diferentes modelos degenerativos. Ao longo desta revisão apresentam-se os estímulos e as
cascatas de sinalização intracelular que sustentam a sua activação.
Conclusão. Estas proteases estão implicadas num grande número de
situações fisiológicas (desenvolvimento e manutenção do número de
células dos tecidos) e patológicas, podendo ser consideradas como
possíveis esquemas na posologia em doenças neurodegenerativas,
tais como a doença de Alzheimer, a esclerose lateral amiotrófica,
doença de Parkinson e Coreia de Huntington. [REV NEUROL 2000;
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Palavras chave. Apoptose. Calpaínas. Caspasa. Mitocôndria. Neurodegenerescência. Proteases.
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