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VALORACIÓN DEL SISTEMA ANTIOXIDANTE Y DEL ÍNDICE GLUTATIÓN REDUCIDOGLUTATIÓN OXIDADO EN REGIONES CEREBRALES DE RATAS HIPOTIROIDEAS.
SIP 20070318
Resumen
Las hormonas tiroideas juegan un papel muy importante en el mantenimiento de procesos bioquímicos y
fisiológicos como el desarrollo, la diferenciación celular y el mantenimiento de la homeostasis del
metabolismo de todas las células. A nivel cerebral, la disminución de hormonas tiroideas provoca eventos
de estrés oxidativo que se relacionan con la pérdida de cuerpos neuronales en la región hipocampal CA3.
Es posible que el aumento de marcadores oxidativos en el encéfalo de ratas hipotiroideas se asocie con
alteraciones del sistema antioxidante. Por lo que el objetivo de este trabajo fue evaluar temporalmente el
ambiente REDOX, así como la actividad y expresión que sufren los principales sistemas antioxidantes
enzimáticos. Se emplearon ratas macho adultas (n=48) de la cepa Wistar. Se dividieron en dos grupos
experimentales: grupo control (n=24) y grupo hipotiroideo (n=24). A los animales del segundo grupo se
les administró metimazol a una dosis de 60 mg/kg/día solubilizado en el agua de beber, durante cuatro
semanas. Durante este tiempo, se tomaron medidas físicas como el peso corporal, temperatura colonal y
consumo de agua, para seguir el tratamiento. Por semana se sacrificaron 6 ratas de cada grupo por
decapitación y se obtuvieron las regiones cerebrales del hipocampo, amígdala, cerebelo, cuerpo estriado y
corteza cerebral. Se obtuvieron muestras de sangre para determinar la concentración sérica de T3 y T4.
Posteriormente, se determinó el índice glutatión reducido-glutatión oxidado (GSH/GSSG), actividad y
expresión de catalasa, isoformas de la superóxido dismutasa (SOD) (Mn-SOD y Cu/Zn-SOD) y glutatión
peroxidasa (GPX). Los animales hipotiroideos presentaron una disminución en el peso corporal,
temperatura colonal y concentración sérica de hormonas tiroideas. En cuanto a las evaluaciones del
sistema antioxidante, en el hipocampo disminuyó el índice GSH/GSSG en la segunda y cuarta semana en
un 33% y 22% respectivamente. Además, presentó menores actividades de catalasa y GPX, mientras que
en amígdala, las actividades de catalasa y GPX aumentaron entre la segunda y cuarta semana. En el
cerebelo se detectó un aumento del 107% en el índice GSH/GSSG durante la segunda semana de
tratamiento, además, se incrementó en un 69% la actividad de la SOD total en la primera semana, por
aumento en la actividad de sus dos isoformas, incluso en la cuarta semana se presentó sólo un aumento del
40% de la actividad de la Cu/Zn-SOD. En corteza cerebral aumentó el GSH y GSSG a partir de la tercera
semana. El cuerpo estriado no presentó cambios en las variables evaluadas. Finalmente, la expresión de la
catalasa se incrementó en hipocampo y amígdala durante la segunda semana de tratamiento, mientras que
la Cu/Zn-SOD aumenta en el cerebelo durante la primera semana. Se concluye que el hipotiroidismo
provoca cambios en el sistema enzimático antioxidante y en el sistema regulador GSH/GSSG dependiendo
de la región cerebral involucrada. Esto sugiere que las estrategias de protección antioxidantes que
desencadenen las células de cada una de las regiones ante la deficiencia de hormonas tiroideas, son las
responsables de la supervivencia de las mismas.
I.- INTRODUCCIÓN
1.- Regulación del ambiente óxido-reducción
Los organismos aeróbicos que utilizan el oxígeno como último aceptor de electrones mantienen un estricto
ambiente óxido-reducción (REDOX), el cual es de vital importancia para la fisiología celular. Dicha
variable se mantiene regulada preservando la producción de compuestos pro-oxidantes, que se generan del
metabolismo celular y los elementos del sistema antioxidante. En condiciones fisiopatológicas, el
ambiente REDOX puede modificarse provocando un estado de estrés oxidativo el cual provoca diversas
cascadas de señalización que eventualmente podrían desencadenar en daño celular.
v
1.1.- Sistema oxidante
Los elementos del sistema oxidante son radicales libres que son moléculas o fragmentos moleculares que
contienen uno o más electrones desapareados en sus orbitales atómicos o moleculares. El que una
molécula posea electrones desapareados le confiere la característica de ser muy reactiva con los centros
nucleofílicos de varios compuestos [41]. Existen dos grupos de compuestos que se consideran oxidantes:
los compuestos derivados del oxígeno y los que derivan del nitrógeno. De tal forma que los primeros son
comúnmente llamadas especies reactivas de oxígeno (ROS) y los segundos se conocen como especies
reactivas del nitrógeno (RNS). En condiciones fisiológicas, la presencia de ROS y RNS es necesaria para
diversas vías de señalización [92].
La presencia de un electrón en el oxígeno molecular (O2) forma el radical anión superóxido
(O2•-). En la
figura 1, se observa que el O2•- puede generarse a partir de varias rutas metabólicas dentro de la célula.
Una de las principales surge en la cadena respiratoria mitocondrial. Se sabe que en los complejos I
(NADH:ubiquinina óxido-reductasa) y III (citocromo C óxido-reductasa) se forma entre el 1 y el 4% de
O2•- por una reducción incompleta del O2 total consumido.
vi
vii
Figura 1. Vías de formación de ROS y peroxidación lipídica así como el papel del glutatión reducido
(GSH) y otros antioxidantes (ácido lipoico, vitamina C y E). Reacción 1: el O2•- se forma por el
proceso de reducción del O2 mediado por la NAD(P)H oxidasa y el complejo xantina oxidasa o por
vías no enzimáticas como las que involucra a la semi-ubiquinona en la cadena respiratoria
mitocondrial. Reacción 2: el O2•- se dismuta por la superóxido dismutasa (SOD) a H2O2. Reacción 3:
el H2O2 es neutralizado por la glutatión peroxidasa (GPX) empleando GSH como cofactor. Reacción
4: el glutatión oxidado (GSSG) es reducido a GSH por la glutatión reductasa (GR) empleando
NADPH. Reacción 5: metales como el Fe+2 y Cu+ rompen al H2O2 en •OH. Reacción 6: el •OH toma
un electrón de los lípidos poli-insaturados (LH) formando radicales lipídicos (L•). Reacción 7: el L•
reacciona con el O2 formando radical peroxilo o hidroperóxido (LOO•). Si el LOO• no es
neutralizado por el sistema antioxidante se provoca el proceso de peroxidación de lípidos
(reacciones 15-23). Reacción 8: el LOO• se puede reducir por la vitamina E (T-OH) formando un
hidroperóxido de fosfolípido (LOOH) y el radical de la vitamina E (T-O•). Reacción 9: el T-O• se
regenera a T-OH por el sistema ascorbato (AscH-) radical ascorbilo (Asc-). Reacción 10: La
regeneración del Asc- a AscH- e incluso la del T-O• a T-OH se encuentra mediada por la oxidación
de GSH a GSSG. Reacción 11: el Asc- y el GSSG se reducen a AscH- y GSH por la conversión del
ácido dihidrolipoico (DHLA) a ácido α-lipoico (ALA). Reacción 12: Se reduce de DHLA a ALA
empleando NADPH. Reacción 13: Los LOOH se reducen a alcohol enzimaticamente por la GPX.
Reacción 14: Los LOOH reacciona rápidamente Fe+2 para formar radical alcohoxilo (LO•), en
menor grado el LOOH reacciona con el Fe+3 para formar radicales peroxilo (LOO•). Modificado de
Valko y colaboradores [92].
Por otro lado, complejos enzimáticos como el de la xantina oxidasa (clasificación enzimática (EC)
1.1.3.22) y los citocromos P450, así como la sintasa del óxido nítrico (NOS) o la monoamina oxidasa (EC
1.4.3.10), entre otras, promueven la producción de O2•-, al que se le considera como especie reactiva de
oxígeno primaria, la cual puede interactuar con otras moléculas para generar especies ROS secundarias o
especies RNS [92].
Como se observa en la figura 2, el O2•- promueve la formación de peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical
hidroxilo (•OH) por diversas rutas químicas. Igualmente, el radical anión superóxido favorece la
formación del peroxinitrito (ONOO-). El O2•- además de inducir la formación de ROS y RNS puede
inactivar a enzimas que participan en el sistema antioxidante, rutas metabólicas y de señalización, tales
como: la catalasa (EC 1.11.1.6), la
glutatión peroxidasa (EC 1.11.1.19), la gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa (EC 1.2.1.12), la ornitina descarboxilasa (EC 2.1.3.3.) y la adenilato ciclasa (EC 4.6.1.1),
por mencionar algunas [38, 41].
viii
Figura 2. Formación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno a partir del radical anión
superóxido. (A) representa la dismutación del O2•- la cual puede ser espontánea o catalizada por la
SOD. (B) muestra la reacción de Haber-Weiss. (C) simboliza la reducción del Fe+3 a Fe+2. (D)
representa la reacción de Fenton. (E) muestra la formación de peroxinitrito (ONOO-).
Con respecto al H2O2, éste se forma por acción de la dismutación espontánea o catalizada por la
superóxido dismutasa (SOD; EC 1.15.1.1). Dicho compuesto casi no presenta acciones oxidativas sobre
las biomoléculas, sin embargo, el principal papel que desempeña dentro del proceso de estrés oxidativo es
la generación del •OH, pues el H2O2 atraviesa las membranas y llega a compartimentos que contienen
metales de transición como Fe+2 ó Cu+, de tal forma que los puede oxidar e inducir la formación del
radical hidroxilo. En ese sentido, el •OH puede ser formado por vías dependientes de O2•- o H2O2 [41, 92,
99].
La forma neutra del ión hidróxido (OH-) es el •OH quien posee una alta reactividad (107-1010 M-1 s-1) con
una vida media muy corta (10-9 s) [76]. De esta forma, cuando se produce in vivo el •OH reacciona cerca
del sitio donde se formó y resulta muy tóxico cuando un metal catalizador se encuentra localizado sobre
biomoléculas como DNA, fosfolípidos membranales o proteínas.
El óxido nítrico (NO) es una molécula que contiene un electrón desapareado en el orbital 2πy*, por lo que
se considera un radical. El NO es un gas generado por la sintasa del óxido nítrico (NOS; EC 1.14.13.39),
la cual metaboliza la conversión de la L-arginina a la L-citrulina con la formación de dicho radical [10].
En condiciones fisiológicas, el óxido nítrico participa en procesos como: neurotransmisión, regulación de
la presión arterial, mecanismos de defensa en contra de patógenos y regulación de la respuesta inmune,
entre otras [92]. El NO tiene una vida media corta en medio acuoso, sin embargo, en un medio hipóxico
presenta mayor estabilidad y su vida media puede ser mayor de los 15 s [15]. La sobre-producción del
radical óxido nítrico induce la formación de especies reactivas del nitrógeno secundarias como el
peroxinitrito (ONOO-) el cual tiene una constante de reacción muy alta (7x109 M-1s-1). De tal forma que el
ix
efecto tóxico del NO se encuentra estrechamente relacionado con la formación del ONOO- [92]. Además,
se considera al radical nitrito (•NO2) como una RNS secundaria. El •NO2 y el radical carbónico (•CO2)
surgen de la reacción entre el ONOO- y el CO2. Dichos radicales median la nitrotirosilación de proteínas,
debido a que al reaccionar con el grupo hidroxilo del aminoácido tirosina (TyrOH) de las proteínas se
forma un radical libre tirosilo (TyrO•) el cual puede ser neutralizado por otro •NO2 [98].
1.2.- Sistema antioxidante
En organismos aerobios, son necesarias e indispensables concentraciones bajas de oxidantes en diversos
procesos como crecimiento, diferenciación celular, apoptosis y respuesta inmune. Cuando existe un
aumento del sistema oxidante se genera un estado de estrés oxidativo que puede provocar el mal
funcionamiento de la célula e inclusive la puede llevar a la muerte. En ese sentido, existe un sistema
antioxidante que puede neutralizar a ROS y RNS.
El sistema antioxidante se encuentra dividido en dos subsistemas, el enzimático y el no enzimático. Dentro
del sistema antioxidante no enzimático se encuentran compuestos orgánicos como el ácido ascórbico, αtocoferol, carotenoides, flavonoides y glutatión reducido (GSH), por mencionar algunos. Mientras que
enzimas como catalasa (EC 1.11.1.6), glutatión peroxidasa (GPX; EC 1.11.1.19) y superóxido dismutasa,
son consideradas la primera línea de defensa antioxidante enzimática. Sin embargo, existen otras enzimas
que participan en el sistema antioxidante como la glutatión reductasa (GR; EC 1.6.4.2), glutatión Stransferasa (GST; EC 2.5.1.18) y tioredoxina reductasa (EC 1.6.4.5) [29, 41, 92, 99].
1.2.1- Sistema antioxidante no enzimático
Dentro de la célula existen diversos compuestos orgánicos nucleofílicos que cumplen la función de
neutralizar a las especies reactivas. Entre los compuestos más importantes se tienen a la vitamina A,
vitamina E, ácido ascórbico y ácido dihidrolipoico.
El α-tocoferol es la forma más activa dentro del grupo de los tocoferoles o comúnmente llamada vitamina
E. En la figura 3 se observa la estructura de la vitamina E, la cual tiene un anillo de cromano el que es
responsable de la actividad antioxidante, mientras que la cadena carbonada de fitilo mantiene a la
molécula anclada a las membranas celulares. Se considera que el α-tocoferol es el antioxidante lipídico
más potentes in vitro que inhibe la propagación de la peroxidación lípidica y el más importante de los que
se encuentran en la circulación sanguínea.
x
Figura 3. Estructura del α-tocoferol (2R,4’R,8’R-tocoferol) tomada de Van Acker y colaboradores
[93].
La vitamina C o ácido ascórbico es imprescindible para la síntesis de diversas proteínas como colágeno,
oxitocina y vasopresina. Su capacidad antioxidante radica en la reducción del radical tocoferilo anclado a
las membranas celulares debido a su carácter hidrosoluble (ver reacciones 8-12 de la figura 1). Aunado a
lo anterior, el ácido ascórbico puede reducir los nitritos e inhibir la formación de nitrosaminas [31].
El ácido dihidrolipoico (DHLA) o ácido 6-8 dimercapto-octanoico es un compuesto orgánico que funge
como
cofactor
de
varias
enzimas.
La
alta
densidad
electrónica
en
los
dos
grupos
–SH le confiere la característica de ser un nucleófilo, lo que favorece la formación del anillo
1-2-diotiolano del ácido α-lipoico (LA) al interaccionar con especies reactivas. Inclusive,
por sus grupos -SH es mucho más fácil oxidar al DHLA que a otros monotioles ya que el sistema
LA/DHLA tiene un potencial REDOX de -32 mV. El DHLA a una concentración de 0.05-1 nM neutraliza
las especies •OH, LOO•, ONOO- y ácido hipocloroso, incluso se ha observado que dicho antioxidante
puede formar complejos estables con el Mn+2, Cu+2, Zn+2 y Fe+2 evitando el daño a biomoléculas.
Finalmente, otras de las funciones antioxidantes del sistema LA/DHLA es la regeneración de
antioxidantes como el ácido ascórbico, ya que reduce el radical dihidroascorbato y semidihidroascorbilo
[67].
Sin embargo, uno de los compuestos orgánicos antioxidantes más importantes es el GSH ya que de él
depende en su mayoría el ambiente REDOX de la célula.
1.2.2- Sistema glutatión reducido-glutatión oxidado (GSH/GSSG) y ambiente óxido reducción
En organismos aerobios, la vida depende de los procesos de oxidación que favorecen la movilización de
electrones de moléculas orgánicas al oxígeno, ya que de ellos depende la producción de energía que es
necesaria para el mantenimiento de los procesos celulares. En general, el flujo electrónico depende de los
pares REDOX, sin embargo, el movimiento de electrones para proveer a la célula de energía sería
imposible si no existiera un ambiente reductor. En ese sentido, se define al ambiente REDOX como la
xi
suma de todos los estados REDOX de los pares óxido-reducción que se encuentran dentro de la célula
(ambiente REDOX intracelular) o en el líquido extracelular (ambiente REDOX extracelular).
Históricamente, se ha usado el término estado REDOX para definir al ambiente REDOX, sin embargo,
según Schafer y Buettner [86], con base en estudios fisicoquímicos definen el estado REDOX como el
potencial de reducción de una pareja REDOX.
Debido a que el ambiente REDOX involucra la transferencia de electrones, Schafer y Buettner [86],
empleando la ecuación de Nernst, mostraron la participación de diversas parejas REDOX en el ambiente
óxido-reducción. Ellos llegaron a la conclusión de que existen dos sistemas amortiguadores intracelulares
de los cuales depende fundamentalmente el ambiente REDOX. Esas parejas REDOX son el GSSG/2GSH
y el NADP+/NADPH.
Por otro lado, la síntesis del glutatión reducido o γ-L-glutamil-cisteinil-glicina involucra dos pasos
enzimáticos dependientes de ATP que se llevan a cabo en el citoplasma celular. En la figura 4 se observa
el ciclo del GSH.
Figura 4.
Ciclo
del glutatión (GSH). Donde GR es glutatión reductasa; GST, glutatión S-transferasa y GSSG,
glutatión oxidado.
La síntesis del GSH inicia con el ingreso de glutamato y cisteína a la célula. Gracias a la γglutamilcisteinil sintetasa (γ-GCS) se forma el γ-glutamilcisteinil. Este primer paso es el más importante
en la formación de GSH ya que la γ-GCS es la enzima limitante de la síntesis del GSH. La actividad de la
γ-GCS
depende
fundamentalmente
de
los
sustratos
y
es
inhibida
por
el GSH. Incluso, la actividad de la γ-GCS se encuentra bajo el control de cinasas como la protein-cinasa A
(PKA) y PKC [37]. El segundo paso en la formación de GSH involucra la formación del enlace peptídico
entre el γ-glutamilcisteinil y la glicina, este paso se encuentra mediado por la GSH sintetasa [97].
xii
A nivel cerebral se tiene una concentración del GSH de 12 mM. Las células con mayor cantidad de GSH
son las gliales [6]. La concentración mitocondrial de GSH es aproximadamente de 11-15 mM. El ingreso
de GSH a la mitocondría depende de los transportadores electroneutrales como el de los ácidos
tricarboxílicos o el de los dicarboxílicos [58]. En general, el índice GSH/GSSG es mayor de 10 para las
células y organelos como mitocondria y núcleo, mientras que, el retículo endoplásmico posee el índice
GSH/GSSG más bajo de (1-3) [86].
Como se mencionó al inicio de esta sección, el GSH es el tiol más importante pues provee un ambiente
REDOX, aunado a eso, el GSH participa activamente en el sistema antioxidante. En primer lugar, el GSH
puede reaccionar espontáneamente con ROS o RNS ante un cambio del potencial REDOX, aunque su
mayor eficacia antioxidante se muestra cuando funciona como sustrato de las enzimas antioxidantes GPX,
GR y GST. En segundo lugar, la función del GSH no se limita al mantenimiento del ambiente REDOX,
pues participa en la captación y síntesis tanto del glutamato como del ácido γ-aminobutírico (GABA),
funge como almacén no tóxico de cisteina, es un modulador alostérico de la síntesis de eicosanoides y
participa como activador de factores transcripcionales [19].
Finalmente, el estado óxido-reducción del par GSSG/2GSH es de vital importancia porque los cambios en
él, dentro de una célula, promueven procesos como proliferación (E entre -300 a 250 mV), diferenciación
(E entre -250 a -180 mV), apoptosis (E entre -180 y -160 mV) o necrosis (E<-160mv) [86].
1.2.3- Sistema antioxidante enzimático
La superóxido dismutasa (SOD; EC 1.15.1.1) es una enzima que se considera la primera línea de defensa
antioxidante
hidrógeno
ya
(figura
que
cataliza
2-A).
En
la
dismutación
mamíferos
se
del
ha
O2•-
para
demostrado
formar
la
peróxido
existencia
de
de
tres
isoformas, las características de dichas enzimas se presentan en la tabla 1.
El gene de la Cu/Zn-SOD se localiza en el cromosoma 21 (región 21q22), presenta cinco exones y cuatro
intrones. Los estímulos que incrementan la expresión del mRNA de la Cu/Zn-SOD son: la presencia de
metales pesados, H2O2, óxido nítrico. De hecho, se ha observado que el NFκB es uno de los factores
transcripcionales que controla la producción del mRNA de dicha isoenzima. En el caso de la Mn-SOD, se
ha demostrado que las ratas presentan dos genes que expresan el mismo mRNA y que los estímulos que
aumentan la trascripción de los genes de la Mn-SOD son la presencia de interleucinas (IL-1, IL-4, IL-6 e
interferón γ).
xiii
Tabla 1. Características de las isoformas de la superóxido dismutasa
Nombre
SOD citoplásmica o SOD-1
SOD mitocondrial o SOD-2
SOD extracelular o SOD-3
Peso molecular
Homodímero
de 64 KDa
Homotetrámero
de 96 KDa
Homotetrámero
de 135 KDa
Metal
Cu/Zn
Localización
Citoplasma
Referencia
[12, 18]
Mn
Mitocondria
[65]
Cu/Zn
Extracelular
[63]
Finalmente, el gene de la SOD-3 se ha encontrado en el cromosoma 6 y aunque diversas citocinas inducen
el aumento del mRNA no se ha observado que incremente su expresión [104]. Sin embargo, el NO
provoca la sobre-expresión de la SOD-3 en células del músculo liso.
La actividad destoxificadora de la SOD se ha relacionado con procesos como la muerte celular, ya que
existen reportes que indican que aumentos en la actividad y expresión de la Mn-SOD inhiben el proceso
apoptósico [50].
Por otro lado, las enzimas encargadas de neutralizar el peróxido de hidrógeno son llamadas peroxidasas.
Existen dos grupos de peroxidasas muy importantes en la célula, la catalasa (EC 1.11.1.16) y la glutatión
peroxidasa (GPX, EC 1.11.1.19). La catalasa es una enzima homotetramérica de 240 KDa que contiene un
solo grupo de ferriprotoporfirina por subunidad [64]. Dicha enzima presenta una constante de reacción
aproximada de 1x107 M-1s-1 con una baja energía de activación (2500-7100 kJ/mol), lo que favorece una
rápida hidrólisis del H2O2. En condiciones experimentales se ha demostrado que la catalasa sufre una
rápida inactivación por el sustrato a una concentración de 0.1 M [2]. Además, el incremento de la
expresión y el aumento de actividad de la catalasa se relacionan con proliferación celular en cáncer,
debido a que inhibe el proceso apoptósico por disminuir la concentración intracelular de H2O2 [50]. Por
otro lado, la GPX es una selenoenzima capaz de neutralizar al peróxido de hidrógeno empleando dos
moléculas de GSH que eventualmente se oxidan a GSSG. La GPX contiene una sóla selenocisteina en
cada una de las cuatro subunidades idénticas de 21 KDa. Hasta el 2005, se han descrito 6 isoformas de la
GPX. Todas las isoformas neutralizan al peróxido de hidrógeno, sin embargo la GPX-4 es la única capaz
de neutralizar los hidroperóxidos de fosfolípidos productos de la peroxidación lipídica [5].
1.3- Estrés oxidativo
En condiciones fisiológicas, los organismos aerobios presentan un estricto balance en su ambiente
REDOX celular, lo que implica que siempre existe la producción de pro-oxidantes que son contrarrestados
xiv
por el sistema antioxidante. Sin embargo, existen circunstancias que provocan un desbalance en el
ambiente REDOX que se caracterizan por aumentos de los elementos del sistema oxidante o disminución
del sistema antioxidante, lo que ocasiona un estado de estrés oxidativo. El estrés oxidativo puede alterar la
estructura de las biomoléculas lo que se traduce en pérdida de la función. Así, eventos de estrés oxidativo
pueden terminar en muerte celular [29, 41].
Entre los marcadores que se han empleado para evaluar los efectos del estrés oxidativo, se encuentran los
productos terminales de peroxidación lipídica (malondialdehido, bases de Schiff y 4-hidroxinonenal),
productos del daño al DNA (8-hidroxi-20-desoxiguanosina), productos de carbonilación (2-pirrolidona,
semialdehido glutámico, ácido 2-amino-3-cetobutírico) o nitración proteica (nitrotirosina), por mencionar
algunos [21].
2.- Hormonas tiroideas
2.1.- Glándula tiroidea
La glándula tiroides se deriva del endodermo, tiene forma de mariposa y se localiza en la parte anterior del
cuello, abrazando a la tráquea e inmediatamente por debajo del cartílago cricoides. En los mamíferos, la
glándula tiroides consiste de dos lóbulos mantenidos en su posición por la cápsula tiroidea, que es una
extensión de la aponeurosis cervical. Dicha glándula posee tres ligamentos; uno medio, que se extiende de
la laringe a la parte media de la tiroides, y otros laterales, que van de los lóbulos laterales de la tráquea al
cartílago cricoides. También es sostenida por los vasos tiroideos, conjuntamente con sus vainas
conjuntivas. La estructura funcional de la glándula tiroides es el folículo tiroideo formado por células
epiteliales cúbicas. La morfología de las células foliculares puede variar de planas hasta cilíndricas
dependiendo de la actividad que presenten, la que a su vez se encuentra en función de la hormona
tirotrofina (TSH) (figura 5) [39].
Célula
parafolicular
Membrana basal
B
Célula epitelial
folicular
Coloide
A
Lagunas de
reabsorción
C
Microvellosidad
Figura 5. Esquema histológico de la tiroides, el cual muestra los folículos tiroideos. A: estado en
reposos. B: estructura normal. C: en condiciones de una gran actividad. Tomada de Cuellar-García
[20].
xv
2.2.- Estructura y características fisicoquímicas de las hormonas tiroideas
La estructura química y el modelo molecular correspondiente de las hormonas tiroideas se presentan en la
figura 6. Las principales hormonas secretadas por la glándula tiroides son la 3, 5, 3´, 5´-tetrayodotironina
(T4) y la 3, 5, 3´-triyodotironina (T3) con un peso molecular de 777 Da y 651 Da, respectivamente. Sin
embargo, se ha mencionado que los subproductos de la degradación metabólica de la T3, como son la 3,
3´,5´,-triyoditironina o triyodotironina reversa (rT3) y la 3, 5-diyodotironina (T2) pueden tener cierto grado
de actividad biológica, como se abordará después [47].
Los grupos amino, carboxilo y fenólico de las hormonas tiroideas pueden ionizarse dadas sus
características químicas. En el caso de los grupos fenólicos, se encuentran disociados en un 50% a un pH
de 10, además
conforme aumentan los átomos de yodo en la tironinas el pK del grupo fenólico
disminuye, por ejemplo para el caso de T3 el pK es de 8.45, mientras que para T4 es de 6.73 [34].
Figura 6. Estructura química de las cuatro hormonas tiroideas biológicamente activas. Tiroxina
(T4), 3´,3,5-triyodotironina (T3), 3´,5´,5-triyodotironina (rT3) y 3, 5-diyodotironina (T2) . Tomada de
Hulbert [47].
A pH fisiológico, aproximadamente el 80% de T4 y el 10% de T3 tienen su grupo enólico ionizable, esta
gran
diferencia
promueve
los
diferentes
grados
de
hidrofobicidad
de
cada hormona [55]. El límite de solubilidad de T4 en solución acuosa depende del pH, por ejemplo, se
puede solubilizar 2.3 μM de la hormona a un pH de 7.0; 4.5 μM a un pH de 9.0 y 260 μM a un pH de 11.0
[87]. Por otro lado, el coeficiente de partición entre fosfolípidos, principalmente fosfatidilcolina, y un
ambiente acuoso es de 12000 para T4 y de 22000 para la T3 a un pH fisiológico [44].
2.3.- Sistema transportador de hormonas tiroideas
Para que las hormonas tiroideas (HT) sean tranportadas desde el lugar de síntesis hasta el sitio de acción
es necesario un sistema que se encuentra compuesto por tres proteínas plasmáticas, globulina de unión a
tiroxina (TBG), transtirretina (TTR) y albúmina (ALB). De las tres proteínas, la TBG es quien presenta la
mayor afinidad por la T4, ya que tiene una constante de afinidad de 1x10-10 M, mientras que la TTR
xvi
presenta una constante de afinidad de 7x10-7 M. Por otro lado, la albúmina es quien posee la menor
afinidad para la T4, pues tiene una constante de afinidad de 7x10-5 M. Las proteínas transportadoras tienen
menor afinidad para T3 [47].
En la revisión elaborada por Schreiber y Richardson [87] se menciona que la ALB es la primera proteína
que aparece en la escala evolutiva. Mientras que la TTR (proteína secretada por el plexo coroideo) es la
encargada de transportar las HT a las células del sistema nervioso central (SNC). En el caso de la TBG, se
ha demostrado que es la principal responsable de la concentración sérica total de T4 en el humano.
Finalmente, para que las HT induzcan sus efectos en sus células blanco, las hormonas que llegan hasta la
periferia de la célula deben de ser ingresadas al citoplasma; para ello existen dos mecanismos, el pasivo y
el activo. En el caso del mecanismo pasivo, simplemente existe una difusión siguiendo un gradiente de
concentración debido a que las HT son lipofílicas [56]. En cuanto al mecanismo activo, las HT pueden ser
introducidas por endocitosis de las proteínas transportadoras o por activación de acarreadores específicos
dependientes de ATP y/o algunos que dependen del gradiente de otros iones, como por ejemplo el sodio.
Entre los transportadores de HT localizados en membrana celular externa se encuentran el cotransportador de taurocolato/Na+ (SLC10A1), polipéptidos transportadores de aniones orgánicos
independiente de sodio P1 y P2 (SLC21P1 y SLC21P2), y el acarreador de soluto de familia 7
independiente de Na+ perteneciente al sistema de transporte de L-aminoácidos LAT1 y LAT2. Así mismo,
se cree que la disulfuro isomerasa (PDI) y dos proteínas membranales, aún desconocidas, de pesos
moleculares de 52 KDa y 27 KDa, podrían participar en el transporte activo de las HT [43].
2.4.- Regulación de la concentración sérica de las hormonas tiroideas. Eje hipotálamo-hipófisisglándula tiroides
La concentración sérica de HT se regula, por las hormonas provenientes del eje hipotálamo-hipófisis
(figura 7). El modulador más importante de las HT es la TSH o tirotrofina. La síntesis y secreción de la
TSH en la adenohipófisis se estimula por la hormona liberadora de tirotrofina (TRH) que es secretada por
el hipotálamo y es transportada hasta la adenohipófisis por el sistema porta hipofisiario. La secreción de
TRH y TSH se controla por las HT mediante un mecanismo de retroalimentación negativa [71]. La TSH
es una glicoproteina de 211 aminoácidos y un peso molecular de 28 KDa, además presenta una vida media
de una hora en circulación. La TSH está formada de dos subunidades, α y β, esta última es quien confiere
la especificidad biológica a la TSH. El receptor de membrana a TSH se encuentra acoplado a proteína Gs y
Gq que estimula la actividad de la adenilato ciclasa y la fosfolipasa C, respectivamente. La primera activa
a la vía de la PKA, mientras que la fosfolipasa C estimula la hidrólisis de fosfatidilinositoles a IP3
(trifosfato de inositol) y diacilgilcerol (DAG), a su vez el IP3 aumenta la concentración de Ca2+ mientras
que el DAG activa a la proteín-cinasa C. Los mecanismos antes descritos inducen la transcripción y
xvii
traducción de proteínas como la tiroglobulina y peroxidasa tiroidea. Por otro lado, la activación de los
receptores a TSH induce la captura de yodo. Con respecto a la TRH, se sabe que es un tripéptido secretado
por las células del núcleo paraventricular del hipotálamo, el cual estimula la liberación de TSH a nivel de
la adenohipófisis mediante la activación DAG e IP3 a partir del acople TRH- Gq [39, 47, 71].
Figura 7. Regulación de la síntesis y secreción de las HT ejercida por el eje hipotálamo-hipófisisglándula tiroides. Modificado de Nussey y Whitehead [71].
2.5.- Síntesis y metabolismo de hormonas tiroideas
El principal producto de la glándula tiroides es la T4 y presenta baja afinidad por receptores nucleares a
HT. A nivel sistémico una proporción de T4 es convertida en T3 por desyodación, esta última es
considerada la hormona biológicamente activa por tener la mayor afinidad por sus receptores nucleares,
mientras que la T4 se considera una prohormona. La vía principal del metabolismo de dicha hormona se
muestra en la figura 8, y como se puede observar se realiza por desyodación progresiva de la molécula de
T4. La desyodación se logra gracias a las desyodasas (EC 1.97.1.11) las cuales son selenoproteínas que
presentan en su centro activo una selenocisteína, la que por su capacidad nucleofílica, favorece la
eliminación del yoduro del grupo tirosilo de las hormonas tiroideas. La activación de las hormonas
tiroideas inicia con la desyodación de la T4 por dos isoenzimas, la 5'-desyodasa tipo I y II (DI y DII), para
xviii
formar T3 ó rT3, según se pierda el átomo de yodo de la posición 5' del anillo externo (5'-desyodación) o
del anillo interno (5-desyodación) respectivamente. Además, la DII puede desyodar a la rT3 para formar
T2. Por otro lado, la DIII favorece la inactivación de T3 y T4 por formar T2 y rT3 [53].
Figura 8. Desyodación de la T4 para convertirse en la hormona activa T3. Tomado de Bianco y Kim
[7].
Varios tejidos pueden metabolizar las yodotironinas por diferentes vías. En la figura 9 se muestran las
diferentes reacciones que se pueden llevar a cabo para eliminar a las hormonas tiroideas. En el hígado y
riñón, la T3 puede ser conjugada con donadores de grupo sulfato como el 3´-fosfatoadenosina o el 5´fosfosulfato. Mientras que la T4 es glucuronidada sólo en el riñón. La glucuronidación es un proceso
enzimático que se cataliza por la uridina difosfato-glucuronosiltransferasa. En general, los sulfatoconjugados son excretados por la bilis, mientras que los glucurón-conjugados son eliminados por la orina.
Además, existen vías alternas para degradar a las tironinas como: desaminación, descarboxilación y
ruptura del enlace éter. Aproximadamente el 80% de la T4 se metaboliza a través de la desyodación (40%
hacia T3 y el otro 40% hacia rT3); el 20% restante se metaboliza por las otras vías produciendo metabolitos
con poca o nula actividad biológica [7, 101]
Figura 9. Metabolismo de las hormonas tiroideas. DIT: diyodotironina; tetrac: ácido
tetrayodotiroacético; tetram: tetrayodotironamina. Modificado de Wu y cols. [101].
xix
2.6.- Mecanismo de acción genómico de las hormonas tiroideas
Debido a la existencia de receptores nucleares para hormonas tiroideas, durante mucho tiempo se creyó
que las HT sólo inducían sus efectos por vía genómica, sin embargo, desde finales de la década de los
ochentas se ha propuesto que las HT pueden inducir efectos independiente a la maquinaria genética, ya
que afectan la composición de lípidos membranales o la activación de enzimas [60].
Los receptores para hormonas tiroideas (RT) son proteínas que fungen como factores transcripcionales
que pertenecen a la superfamilia de receptores nucleares donde están incluidos los esteroides, vitamina D,
ácido retinoico, ácidos grasos, prostaglandinas y receptores huérfanos [105]. Los RT tienen regiones como
el dominio de unión a DNA (DBD), dominio de unión a ligando (LBD), región bisagra (HR) y dominio
amino terminal (A/B) [83].
Las HT atraviesan la membrana lipídica debido a su naturaleza hidrofóbica, en el citoplasma pueden
unirse a los RT recién sintetizados, sin embargo, la mayoría de las HT se unen a receptores nucleares. Los
RT unidos a las HT pueden regular el proceso de transcripción modificando la estructura de la cromatina,
permitiendo que otros factores ejerzan su acción sobre elementos respuesta de las HT (TREs). Además,
los RT interactúan, directamente o indirectamente a través de moléculas puente o coactivadoras, con la
maquinaria del proceso transcripcional. Un aspecto crítico en la regulación del proceso de transcripción
por los RT, es el cambio conformacional que la T3 ejerce sobre el propio receptor. La T3 disminuye la
capacidad hidrofóbica de los RT y puede modificar el modo por el cual los RT, ya sea en forma de dímero
o heterodímero, se unen al DNA. El modelo actual del mecanismo de acción de las hormonas tiroideas
establece que los RT se unen al TREs para regular la transcripción, en forma de monómero, homodímero,
heterodímero o heteromultímero. La unión de la hormona tiroidea al RT provoca cambios en la estructura
de estos complejos modulando así la interacción con otros elementos del aparato transcripcional que
determinará el tipo de respuesta: estimuladora o inhibidora [47].
Existen dos isoformas que inducen la transactivación de los RT, los cuales están codificados por los genes
α y β. La traducción del mRNA del gen TRα genera tres proteínas TRα-1, TRα-2 y TRα-3 (c-erbAα-2 ó
TRv1), de las cuales la segunda es incapaz de unirse a la T3 debido a que contiene un aminoácido carboxiterminal en la posición 122, el cual reemplaza la región de unión a T3 crítica para unir HT, sin embargo,
puede unirse débilmente a los TREs, pero sin transactivar genes respuesta a HT, por ello se cree que es un
controlador negativo de la acción de las HT [47].
2.7.- Mecanismo de acción extragenómico de las hormonas tiroideas
Existen diversas rutas por las cuales las HT pueden inducir sus efectos sobre los sistemas biológicos,
independiente de la vía de los receptores nucleares y afectan principalmente a las membranas lipídicas y la
actividad de diversas enzimas.
xx
Desde hace tiempo, se ha evaluado la influencia de las HT sobre la composición de las membranas
lipídicas. Se ha observado que las membranas de los glóbulos rojos de ratas hipotiroideas presentan mayor
concentración de fosfolípidos y colesterol respecto de sus controles [28].
La disminución de HT induce el incremento de
fosfolípidos 18:2 y una disminución de los 20:4,
posiblemente por una reducción de la actividad de la desaturasa Δ6 y la Δ5, que provoca el acúmulo de
lípidos 18:2 como precursores de síntesis de cadenas largas, debido al bloqueo en las vías de formación de
especies n-6 [45, 47]. Incluso, se ha observado que la acil-composición de las membranas se modifica
porque las HT afectan el ciclo de acilación/reacilación, específicamente, la T4 modifica la acilación de la
lisofosfatidiletanolamina en corazón de rata [47].
Por otro lado, la hipótesis acerca del control de la actividad enzimática por HT se comprobó con el
experimento de Davis y colaboradores [25] al evaluar la actividad de la Ca2+-ATPasa de eritrocitos
maduros de humanos con alteraciones tiroideas. Se demostró que la concentración de hormonas tiroideas
correlacionaba con la actividad enzimática independientemente de los mecanismos genéticos. Aunado a la
evidencia anterior, Lawrence y su grupo de trabajo [59] encontraron un aumento de la actividad de la PKC
al adicionar T3 ó T4 a glóbulos rojos. Respecto al aumento de actividades enzimáticas por efecto de las
HT, se observa en la figura 10 que, principalmente la T4, interactúan con receptores membranales del tipo
integrina. La integrina es un heterodímero que al ser activado favorece la estimulación de la vía de las
MAPK por activación de PLC y PKC. En ese sentido, es posible la activación de enzimas como proteínas
transportadoras. Incluso, se cree que la fosforilación de receptores membranales por la vía de las MAPK
es necesaria para su traslocación al núcleo [26].
xxi
Figura 10. Activación de receptores membranales para hormonas tiroideos. Modificada de Davis y
colaboradores [26].
2.8.- Efectos de las hormonas tiroideas
Durante mucho tiempo se ha establecido que T3 es la única hormona activa, mientras que T4 es sólo una
pro-hormona y que las otras tironinas son sólo subproductos del metabolismo de T4 y T3, por lo que se
dice que presentan muy baja o nula actividad biológica. Sin embargo, existen evidencias de que cada una
de la tironinas juegan un papel importante en diversas funciones celulares, por ejemplo existen genes
específicos como los que codifican para la enzima málica y la cadena β de la TSH, los cuales sólo se
activan cuando T4 se encuentra unida a los receptores nucleares [8]. Con respecto a los efectos no
genómicos de T4, se ha observado que dicha tironina es necesaria para la correcta polimerización de la
actina F durante el desarrollo neuronal [32]. Con respecto a la T2 existen evidencias que la relacionan con
el proceso calorigénico [46, 57, 61]. El metabolismo basal, así como la termogénesis, son dos procesos
que involucran a la mitocondria, los cuales son estrictamente controlados por las hormonas tiroideas.
Inicialmente se propuso a T3 como la única tironina controladora de los procesos antes mencionados,
sugiriendo que la acción se debía a la activación de genes nucleares y a la expresión del genoma
mitocondrial, sin embargo, hay estudios que muestran que T2 también participa en el metabolismo basal y
la termogénesis [35, 57, 61]. En relación con los efectos a corto plazo de las HT sobre la mitocondria, se
ha encontrado que T2 afecta a la citocromo c oxidasa y de esta manera activa la cadena respiratoria. Así
xxii
mismo, T3 induce la estimulación del acarreador de la adenina nucleótido translocasa (ANT) [89] y la
activación de la sintasa de la cardiolipina, la cual afecta a diversos sistemas de acarreadores y enzimas
[75]. Se ha propuesto que las HT también ejercen sus efectos a nivel del genoma mitocondrial, debido a
que se han encontrado proteínas en la membrana interna, las cuales tienen mucha similitud con los TR
nucleares, una de ellas es la proteína de 28 KDa, la cual sirve de unión a T3, a dicha biomolécula también
se le ha denominado proteína de Stearling o p28. La p28 (no encontrada en núcleo) parece ser un receptor
c-erbAα−1 truncado, que aparentemente puede afectar la síntesis de los componentes de la cadena
respiratoria, como las proteínas desacoplantes (UCPs) y la ANT. Además, se ha encontrado otro cerbAα−1 truncado en mitocondria, al cual se le denominó p43. Dicha proteína sirve de anclaje para el
DBD e incrementa la transcripción y síntesis de proteínas a nivel mitocondrial [100].
Las HT también afectan la fisiología de tejidos excitables como el muscular y el nervioso. A nivel de
músculo liso se ha observado que las HT participan en la regulación y síntesis de la isoforma G4 de la
acetilcolinesterasa. Además, las HT afectan el flujo de iones Na+ y Ca2+ debido a que se induce sobreexpresión de canales de Na+ y Ca2+. Incluso, las HT provocan un aumento en la expresión de la Ca2+ATPasa localizada en el retículo sarcoplásmico (SERCA), ya que existen los TREs en los genes que
codifican para la isoforma SERCA1 [47]. A nivel del músculo cardíaco, se ha observado que las HT
inducen cambios en la actividad eléctrica, lo cual se encuentra asociado con los cambios de los
fosfolípidos membranales, antioxidantes membranales y vitamina E [94].
II.- ANTECEDENTES
Las hormonas tiroideas juegan un papel muy importante en el mantenimiento de los procesos bioquímicos
y fisiológicos como el desarrollo, la diferenciación y el mantenimiento de la homeostasis del metabolismo
de todas las células; esto de debe a sus efectos genómicos o extra-genómicos sobre las células, lo que
afecta a moléculas de importancia biológica como DNA, proteínas o lípidos [84].
Uno de los efectos más estudiados de las hormonas tiroideas es la aceleración de la tasa metabólica basal
[33]. Respecto a este punto, se ha sugerido que el hipertiroidismo induce desacople electrónico a nivel de
la cadena respiratoria mitocondrial [95]. Las alteraciones mitocondriales asociadas al hipertiroidismo
favorecen la generación de ROS, lo que induce eventos de estrés oxidativo que pueden llevar a la muerte
celular [94, 95]. Por el contrario, el hipotirodismo se ha relacionado con protección ante estímulos dañinos
que generan estrés oxidativo como la hipoxia [79]. Sin embargo, el grado de hipotiroidismo y el órgano
evaluado, son importantes para establecer las causas del potencial oxidativo, ya que existen evidencias que
demuestran el aumento de marcadores de estrés oxidativo y nitrérgico en órganos como el cerebro a raíz
de la disminución de las hormonas tiroideas [11, 14].
xxiii
A nivel cerebral, se ha observado que la deficiencia sérica de HT promueve la pérdida de cuerpos
neuronales en la región CA3 del hipocampo [3, 4]. El mecanismo por el cual se induce la muerte neuronal
hasta la fecha es desconocido, no obstante, nuestro grupo de investigación ha presentado evidencias de
que el hipotiroidismo inducido con metimazol ocasiona estrés oxidativo selectivo para las regiones del
hipocampo y amígdala, caracterizado por aumento en la peroxidación de lípidos y ROS durante la tercera
semana de tratamiento. Además, sólo en el hipocampo se observó un aumento tanto en la actividad como
en la expresión de la isoenzima nNOS [11].
Es posible que alteraciones en el sistema antioxidante participen en los eventos de estrés oxidativo
observados en el hipocampo y amígdala de ratas hipotiroideas, ya que se ha demostrado que la
disminución de HT modifica variables del sistema antioxidante, aunque depende del modelo anti-tiroideo
empleado, órgano evaluado, duración y dosis del tratamiento. En ese sentido, se ha observado que la
administración de 6-propiltiouracilo (PTU) al 0.05 % durante 30 días provoca una reducción del índice
GSH/GSSG en testículos de rata, debido a la disminución del GSH y al aumento del GSSG [16]. Usando
el mismo fármaco anti-tiroideo, pero a una dosis de 10 mg/kg durante 14 días, Mogulkoc y cols. [66] han
demostrado que los niveles de GSH se reducen tanto en testículo como en riñón. Además, Das y Chainy
[23] empleando PTU 0.05% durante tres semanas, encontraron una reducción del índice de GSH/GSSG en
hepatocitos de ratas hipotiroideas, incluso, el mismo grupo observó que la corteza cerebral de ratas
hipotiroideas presentó un aumento en la concentración de GSSG [22].
En el caso de SOD, se ha demostrado que en homogeneizados de hígado de ratas con deficiencia tiroidea,
se aumenta la actividad de las isoformas Cu/Zn- y Mn-SOD [23], mientras que en el testículo se presenta
una disminución de SOD total [16]. El efecto del hipotiroidismo en corazón es controversial, ya que
Chattopadhyay y Zaidi [13] encontraron aumento de la actividad de la SOD en la fracción mitocondrial,
mientras que Shinohara y cols. [88] no encontraron diferencias. Además, en homogeneizados de cerebro
completo de ratas tratadas con metimazol, no se modifica la actividad de las isoformas de SOD [79], en la
corteza cerebral el tratamiento anti-tiroideo con PTU provocó una disminución de Cu/Zn-SOD y aumento
de Mn-SOD [22].
El sistema de las peroxidasas tampoco presenta un patrón común de actividad debido al estado
hipotiroideo. Hay reportes que indican que el empleo de metimazol como anti-tiroideo favorece el
aumento de las enzimas antioxidantes catalasa y las isoformas de la SOD en el tejido adiposo café de ratas
[77]. Sin embargo, en el mismo modelo de hipotiroidismo, Mano y colaboradores [62] observaron que en
el cerebro de ratas hipotiroideas, los niveles de catalasa no se modifican, mientras que se presenta un
aumento de la actividad de GPX y las isoformas de la SOD. Rastogi y colaboradores [79] corroboraron
que el metimazol no induce cambios en la actividad de la catalasa en el cerebro de ratas. No obstante, en
xxiv
el corazón de ratas tratadas con metimazol se presenta un aumento en la actividad detoxificadora de la
GPX sin cambios en la actividad de la catalasa [62], mientras que en el mismo órgano, la generación de
hipotiroidismo con PTU no modifica la actividad de la catalasa [13], lo que fue reproducido por Venditti y
colaboradores [27, 96] que, además, encontraron incrementos de GPX en músculo esquelético, pero no en
homogeneizados de hígado. Sin embargo, el empleo de PTU como anti-tiroideo indujo una disminución
de la actividad de catalasa en el hígado [23], sin alteraciones en el corazón [13], mientras que en el cerebro
de ratas aumentó la actividad de las dos peroxidasas [22]. Finalmente, con el empleo de modelos no
farmacológicos como el del I131, se ha demostrado que en homogeneizados de riñón, la actividad de la
catalasa no se modifica, mientras que la GPX se incrementa [85]. lo que se relaciona parcialmente con el
modelo de hipotiroidismo promovido por tiroidectomía total con reimplante de glándula paratiroides, ya
que se encontró que el hipotiroidismo no modifica la actividad de enzimas antioxidante [90].
Por todo lo anterior, es necesario realizar estudios en un curso temporal acerca del efecto que tiene la
deficiencia de hormonas tiroideas sobre los eventos de estrés oxidativo en cada uno de los órganos
estudiados. Respecto al sistema nervioso central, fue de nuestro interés evaluar en un curso temporal las
variables de actividad y expresión de las enzimas de la primera línea de defensa antioxidante, así como la
determinación del ambiente REDOX en regiones cerebrales de ratas a las que se les indujo el
hipotiroidismo con metimazol.
xxv
III. OBJETIVO GENERAL
Evaluar los cambios en un curso temporal que sufren el ambiente REDOX y los principales sistemas
antioxidantes enzimáticos, tanto en actividad como en expresión, en regiones cerebrales de ratas
hipotiroideas.
Objetivos particulares
1. Determinar el índice glutatión reducido/glutatión oxidado en hipocampo, amígdala, cerebelo, cuerpo
estriado y corteza cerebral de ratas hipotiroideas.
2. Caracterizar los cambios temporales de actividad y expresión de la catalasa y las isoenzimas Cu/Zn- y
Mn-superóxido dismutasa en hipocampo, amígdala, cerebelo, cuerpo estriado y corteza cerebral de
ratas hipotiroideas.
3. Establecer si se presentan cambios por semana en la actividad destoxificadora de la glutatión
peroxidasa en hipocampo, amígdala, cerebelo, cuerpo estriado y corteza cerebral durante el
tratamiento anti-tiroideo.
xxvi
IV.- MÉTODOS Y MATERIALES
1.- Tratamiento de los animales de experimentación
Se emplearon 48 ratas macho de la cepa Wistar con un peso de 240 a 260 g. las cuales se mantuvieron en
jaulas individuales con alimento y agua ad libitum, en una cámara con temperatura regulada y ciclos de
luz-oscuridad 12:12. Se formaron dos grupos experimentales: grupo control (n=24) y grupo hipotiroideo
(n=24). A los animales pertenecientes al segundo grupo se les administró metimazol a una dosis de 60
mg/kg/día, solubilizado en el agua de la llave, durante cuatro semanas. Durante este tiempo se tomaron
medidas físicas como el peso corporal, temperatura colonal y consumo de agua, para seguir el efecto del
tratamiento anti-tiroideo.
Cada semana se sacrificaron 6 ratas de cada grupo por decapitación se obtuvieron muestras de suero para
determinar la concentración sérica de las hormonas T3 y T4 mediante la técnica de ELISA. y se obtuvo el
encéfalo. Se disecaron las regiones del hipocampo, amígdala, cuerpo estriado, cerebelo y corteza cerebral,
para la determinación del índice GSH/GSSG, actividad y expresión de GPX, catalasa e isoformas de SOD.
2.- Determinación del índice glutatión reducido-glutatión oxidado (GSH/GSSG)
Para obtener el índice GSH/GSSG se cuantificó por separado cada especie química. Para ello, cada
muestra fue homogeneizada en 250 μl de regulador de fosfatos 10 mM pH 7.4. Se tomaron 100 μl del
homogeneizado y las proteínas fueron precipitadas con H3PO4 al 30%. Posteriormente, se centrifugó a
12,000 g por 30 min a 4 ºC. Para la determinación de GSH, se tomaron 30 μl de una dilución 1:10 del
sobrenadante en un volumen final de 1.9 ml de regulador de fosfatos 100 mM con EDTA 5 mM (FEDTA)
y se agregaron 100 μl de o-ftaldialdehído (OPT). La mezcla se leyó en un espectofotómetro de
fluorescencia Perkin-Elmer con longitud de emisión de 420 nm y 350 nm de excitación. Por otro lado,
para determinar la concentración de GSSG se tomaron 75 μl del sobrenadante y se mezclaron con 35 μl de
N-etilmaleimida y consecutivamente se colocaron 60 μl de la mezcla en un volumen final de 1.9 ml de
FEDTA. Finalmente, se agregaron 100 μl de OPT y la muestra se leyó igual que en la determinación de
GSH. Para obtener el índice GSH/GSSG se dividieron los ng de GSH/mg proteína entre los ng de
GSSG/mg de proteína.
3.- Determinación de la actividad de la GPX
Se empleó la técnica de Hafeman y colaboradores [40] la cual consiste en evaluar la actividad
destoxificadora de la GPX reduciendo el H2O2 por la oxidación del GSH. Se colocaron 60 μl del
homogeneizado en 3 ml de regulador de fosfatos 100 mM, el cual contenía EDTA 0.4 mM, NaN3 10 mM
y GSH 2 mM. La mezcla de reacción se preincubó por 5 minutos a 37 ºC, posteriormente se adicionó 1 ml
de H2O2 1.25 mM para iniciar la reacción. Se tomaron dos muestras a los 5 y 10 minutos de iniciada la
xxvii
reacción y se colocaron en 1.2 ml de solución precipitante (NaCl 30 g y ácido metafosfórico 1.6 g en 100
ml). Posteriormente se centrifugaron las muestras a 3000 rpm y se realizó una dilución 1:2 con regulador
de fosfatos 400 mM. Finalmente, se adicionaron 250 μl de ácido 5,5-ditio-bis-2-nitrobenzoico y se leyó la
absorbancia a 412 nm. Los resultados se expresan como μg de GSH oxidado/min/mg de proteínas.
4.- Determinación de la actividad de la catalasa
Para la evaluación de la actividad de la catalasa, se utilizó la técnica de Aebi [2], la cual evalúa la
degradación de H2O2 a 240 nm. Para ello, se colocaron de 60 a 120 μl del homogeneizado en 3 ml de
regulador de fosfatos 10 mM pH 7.4 que contenía 30 mM de H2O2. Se determinó la absorbancia inicial y
se incubó por 10 minutos a 37 ºC, posteriormente se tomó la absorbancia final. Los resultados se expresan
como velocidad de reacción de una cinética de primer orden (k) por mg de proteína.
5.- Determinación de la actividad de la Cu/Zn-, Mn-SOD y SOD total
Para la evaluación de la actividad de la SOD, se utilizó la técnica de Crapo y colaboradores [17]
modificada, la cual evalúa el cambio de absorbancia por minuto del citocromo C a 550 nm. Se colocaron
20 μl del homogeneizado en 2.85 ml de sustrato, el cual contenía EDTA 1 mM, citocromo c reducido 10
μM, azida de sodio 10 μM y xantina 100 μM solubilizados en regulador de carbonatos 10 mM con tritón
X-100 al 0.02% (p/v). La reacción inició al adicionar 50 μl de xantina oxidasa a la muestra. Para
discriminar la Cu/Zn-SOD de Mn-SOD, se realizó una incubación con KCN 1 mM. Se consideró una
unidad de actividad de SOD como la cantidad de enzima que disminuye la proporción de reducción del
citocromo c en un 50 %. Así, los resultados se expresan como U de SOD/mg de proteína.
6.- Expresión de la catalasa, Mn-SOD y Cu/Zn-SOD
Se empleó la técnica Western blot para determinar la expresión de la Cu/Zn-SOD, Mn-SOD y catalasa.
Primeramente se colocaron 30 μg de proteína del homogeneizado en un gel de poliacrilamida
desnaturalizante (conteniendo sulfato dodecil de sodio al 10%) al 12%. Posteriormente, las proteínas se
separaron por electroforesis a 160 V por 42 minutos y se transfirieron a una membrana de PVDF a 110
mA por 1 h. La membrana de PVDF que contenía las proteínas se bloqueó con leche descremada al 5%
solubilizada en PBS-tween 0.05% durante 1 h. Inmediatamente, se incubaron las membranas con los
anticuerpos primarios durante toda la noche. Para detectar la actina se empleó un anticuerpo policlonal de
ratón a una dilución de 1:500, mientras que para la Mn-SOD, Cu/Zn-SOD y catalasa (Santa Cruz, Inc.) se
usó un anticuerpo policlonal de cabra a una dilución 1:300. Después de la incubación con el anticuerpo
primario, las membranas se lavaron tres sesiones de 15 min con PBS 1X-Tween 0.05%. Se prosiguió con
la incubación del anticuerpo secundario específico acoplado a peroxidasa (Zymed) por 1 h. Finalizada la
incubación, las membranas se lavaron por 45 min en PBS 1X-Tween 0.05%. La detección del
xxviii
inmunocomplejo se puso de manifiesto por quimioluminiscencia y se obtuvo el revelado en placas XOMAT (Kodak). Las imágenes fueron digitalizadas para realizar el análisis densitométrico empleando el
programa Image J [1, 78]. Los resultados se presentan como el índice de expresión de la enzima
antioxidante evaluada sobre la expresión de la β-actina.
7.- Cuantificación de proteínas
La cuantificación de proteínas se realizó por la técnica de Bradford, la cual se basa en la reacción de los
aminoácidos aromáticos de las proteínas con el azul brillante de Coomasie G-250 [9].
8.- Análisis estadístico
Todos los resultados se presentan como la media ± el error estándar de la media. En el caso de las
variables físicas (peso y temperatura) se empleó la prueba de análisis de variancia (ANDEVA) bifactorial
de medidas repetidas. Para la cuantificación de hormonas, determinación de GSH, GSSG, GSH/GSSG,
actividad y expresión de SOD, catalasa y GPX se aplicó la prueba de ANDEVA bifactorial. Los análisis
de variancia fueron seguidos de la prueba de Tukey. En los análisis bifactoriales, se estudió el tiempo y el
tratamiento. Los valores que se consideraron estadísticamente significativos fueron los que presentaron
una P <0.05.
xxix
V.- RESULTADOS
1.- Valoración del estado tiroideo de los animales
En la figura 11 se muestran las variables evaluadas para determinar el estado tiroideo de los animales
empleados en este trabajo. El panel A muestra que a la cuarta semana de tratamiento anti-tiroideo, el
grupo hipotiroideo presenta un menor peso corporal con respecto al grupo control. Además, en el panel B
se observa que las ratas hipotiroideas a partir de la segunda semana presentan menor temperatura colonal
comparadas con los animales control.
313
293
*
273
253
Tem peratura colonal (°C)
Peso corporal (g)
333
233
C
38.20
37.95
37.70
37.45
*
37.20
36.95
36.70
* *
D
T 4 sérica (nm oles/l)
2.10
T 3 sér i ca ( nm ol es/l )
Control
Hipotiroideo
B
A
2.05
2.00
1.95
*
1.90
*
1.85
0
1
2
3
Semanas de tratamiento
*
4
220
170
120
* * *
70
20
0
1
2
3
4
Semanas de tratamiento
Figura 11. Efecto del hipotiroidismo sobre el peso corporal (A), temperatura colonal (B), niveles
séricos de T3 (C) y T4 (D). Los valores representan el promedio de 6-24 evaluaciones independientes
± el error estándar. (*) P<0.05 contra grupo eutiroideo al mismo tiempo.
La cuantificación de las hormonas tiroideas reveló que los animales tratados con metimazol presentaron
una reducción entre el 4 y 5% de la concentración sérica de T3 (Panel C) en la primera, segunda y cuarta
semana de tratamiento. Además, el grupo hipotiroideo presentó una disminución de la concentración
xxx
sérica de T4 (Panel D) entre el 60 y 76% a partir de la segunda semana y hasta el fin del tratamiento antitiroideo.
2.- Determinación del ambiente REDOX por el sistema GSH/GSSG en las regiones cerebrales
En la figura 12 se presentan los resultados de las variables que determinan el ambiente REDOX, es decir
la concentración de GSSG (columna de A-M), concentración de GSH (columna de B-N) e índice
GSH/GSSG (columna C-O).
En relación con los resultados de la amígdala (A-C) y el cuerpo estriado (D-F), se demostró que no existen
modificaciones de las variables dependiendo del estado tiroideo. Por otro lado, la corteza cerebral presenta
un aumento en la concentración de GSSG (panel G) en la tercera y cuarta semana del 169 y 220%,
respectivamente. En dicha región se incrementó la concentración de GSH (panel H) a partir de la segunda
semana y hasta la cuarta entre el 147 y el 168%, respectivamente. De tal forma que durante la cuarta
semana, en la corteza cerebral de ratas hipotiroideas, el índice GSH/GSSG (panel I) disminuye un 26%
respecto al control. Otra región que mostró alteraciones del ambiente REDOX por el estado tiroideo es el
cerebelo, ya que presentó aumentos de la concentración de GSH (panel K). También, en el cerebelo de
ratas hipotiroideas aumenta la concentración de GSSG en la primera semana (panel J). Por lo anterior, el
índice GSH/GSSG (panel L) de dicha región de las ratas hipotiroideas solo se alteró en la segunda
semana. Finalmente, el hipocampo de ratas hipotiroideas presentó alteraciones del ambiente REDOX
debido a que se presentó un aumento en la concentración de GSSG (panel M) en la cuarta semana respecto
de los controles. Incluso, se redujo la concentración de GSH (panel N) en un 50% durante la segunda
semana respecto a las semanas de tratamiento. Con los cambios en la concentración de GSH y GSSG, el
índice GSH/GSSH en el hipocampo de ratas hipotiroideas disminuyó entre el 33 y 22% en la segunda y
cuarta semana, respectivamente.
xxxi
GSSG (nmoles/mg proteínas)
Hipocampo
5
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
6
*
5
4
*
3
2
1
6
*
5
4
3
2.3
*
2.1
1.9
1.7
1.5
1.3
1.1
1
2
3
Semanas de tratamiento
4
70
65
60
55
50
55
M
Índice GSH/GSSG
6
GSH (nmoles/mg de proteínas)
7
1
2
70
60
65
*
30
1
3
H
100
90
80
*
*
50
40
45
Semanas de tratamiento
2
3
Índice GSH/GSSG
D
GSH (nmoles/mg de proteínas)
Amígdala
GSSG (nmoles/mg proteínas)
8
*
35
*
Índice GSH/GSSG
G
GSH (nmoles/mg de proteínas)
Cuerpo estriado
GSSG (nmoles/mg proteínas)
9
70
60
50
40
Índice GSH/GSSG
J
GSH (nmoles/mg de proteínas)
GSSG (nmoles/mg proteínas)
Corteza cerebral
A
GSH (nmoles/mg proteínas)
GSSG (nmoles/mg proteínas)
Cerebelo
10
80
70
60
50
Índice GSH/GSSG
B
C
40
75
E
45
*
30
15
K
L
25
N
80
**
4
Control
Hipotiroideo
90
13
11
9
7
5
4
F
65
60
55
50
45
40
35
I
30
25
20
*
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
*
55
O
45
35
25
*
1
2
*
Semanas de tratamiento
xxxii
3
4
Figura 12. Efecto del hipotiroidismo sobre la concentración de glutatión oxidado (columna de A-M),
glutatión reducido (columna de B-N) e índice GSH/GSSG (columna C-O) en las regiones de la
amígdala (A-C), cuerpo estriado (D-F), corteza cerebral (G-I), cerebelo (J-L) e hipocampo (M-O).
Los valores representan el promedio de 5-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*)
P<0.05 contra grupo eutiroideo al mismo tiempo, (**) P<0.05 contra grupo hipotiroideo semana 1,
3 y 4.
3.- Determinación de la actividad de la GPX en las regiones cerebrales
En la tabla 2 se presentan los resultados de la actividad destoxificante de la GPX en las regiones del
cerebelo, corteza cerebral y cuerpo estriado. Se puede observar que el hipotiroidismo no modifica la
actividad de la GPX en dichas regiones.
Tabla 2. Actividad de la GPX en las regiones del cerebelo, corteza cerebral y cuerpo estriado.
Cerebelo
(μg GSH oxidado/mg
proteínas/min)
Semanas
de
tratamiento
Control
1
0.021 ± 0.008
2
0.029 ± 0.006
3
0.046 ± 0.019
4
0.010 ± 0.009 0.042 ±0.017
Hipotiroideo
0.030 ±
0.013
0.067 ±
0.019
0.015 ±
0.008
Corteza cerebral
(μg GSH oxidado/mg
proteínas/min)
Control
0.731 ±
0.30
0.786 ±
0.22
0.838 ±
0.43
0.745 ±
0.18
Hipotiroideo
Cuerpo estriado
(μg GSH oxidado/mg
proteínas/min)
Control
0.607 ± 0.35 0.484 ± 0.241
0.360 ± 0.15 0.667 ± 0.224
0.651 ± 0.16 0.691 ± 0.301
1.220 ± 0.236 0.632 ± 0.170
Hipotiroideo
0.683 ±
0.253
0.412 ±
0.200
1.120 ±
0.139
0.713 ±
0.078
Los valores representan el promedio de 5-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.
Sin embargo, la disminución sérica de las hormonas tiroideas promueve alteraciones de la actividad de
GPX en homogeneizados de hipocampo y amígdala. En el panel A de la figura 13, se observa que en la
amígdala, el hipotiroidismo induce aumentos de la actividad de la GPX durante la tercera y cuarta semana
en un 123 y 127%, respectivamente. Con respecto al hipocampo (panel B), el hipotiroidismo provocó el
aumento de la actividad de GPX en un 108% durante la primera semana y una reducción del 35% durante
la cuarta.
xxxiii
*
4.5
Actividad de GPX
(μg de GSH oxidado/mg de
proteínas/min)
A
Actividad de GPX
(μg de GSH oxidado/mg de
proteínas/min)
Control
Hipotiroideo
B
*
3.5
2.5
1.5
0.5
1
2
3
1.5
*
1.0
0.5
*
0.0
1
4
2
3
4
Semanas de tratamiento
Semanas de tratamiento
Figura 13. Efecto del hipotiroidismo sobre la actividad de la GPX en amígdala (A) e hipocampo (B).
Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*)
P<0.05 contra grupo eutiroideo al mismo tiempo.
4.- Determinación de la actividad de la catalasa en las regiones cerebrales
En la tabla 3 se presentan los resultados de la actividad de la catalasa en las regiones del cerebelo, corteza
cerebral y cuerpo estriado. Se observa que no existe diferencia en la actividad de catalasa debido al estado
tiroideo.
Tabla 3. Actividad de la catalasa en las regiones cerebrales del cerebelo, corteza cerebral y cuerpo
estriado
Cerebelo
(x10-6 k/mg de proteínas)
Semanas
de
tratamiento
1
2
3
4
Control
2.33 ± 0.26
3.05 ± 0.51
3.01 ± 0.76
3.24 ± 0.92
Hipotiroideo
2.59 ± 0.26
3.69 ± 0.77
2.93 ± 0.65
3.39 ± 0.82
Corteza cerebral
(x10-6 k/mg de proteínas)
Control
1.89 ± 0.27
1.87 ± 0.24
2.44 ± 0.64
2.28 ± 0.72
Hipotiroideo
1.72 ± 0.87
1.67 ± 0.38
2.27 ± 0.48
2.19 ± 0.14
Cuerpo estriado
(x10-6 k/mg de proteínas)
Control
1.16 ± 0.34
1.16 ± 0.40
0.97 ± 0.20
0.98 ± 0.11
Hipotiroideo
0.92 ± 0.48
1.09 ± 0.24
0.81 ± 0.24
0.33 ± 0.09 *
Los valores representan el promedio de 5-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*)
P<0.05 contra grupo eutiroideo al mismo tiempo.
xxxiv
Por otro lado, en el panel A de la figura 14 se muestra que en la amígdala de ratas hipotiroideas se
incrementó la actividad de la catalasa aproximadamente al doble del control desde la segunda semana. En
el panel B, se observa que en el hipocampo de ratas con deficiencia tiroidea aumentó la actividad de
catalasa en la primera semana y ésta se redujo en la tercera.
7.5×10
6.0×10
-4
*
*
2.5×10 -4
*
k/mg proteína
k/mg proteína
A
-4
Control
Hipotiroideo
B
4.5×10 -4
3.0×10 -4
1.5×10 -4
*
2.0×10 -4
1.5×10 -4
1.0×10 -4
5.0×10 -5
0
*
0
1
2
3
4
1
Semanas de tratamiento
2
3
4
Semanas de tratamiento
Figura 14. Efecto del hipotiroidismo sobre la actividad de la catalasa en amígdala (A) e hipocampo
(B). Los valores representan el promedio de 4-6 evaluaciones independientes ± el error estándar. (*)
P<0.05 contra grupo eutiroideo al mismo tiempo.
5.- Determinación de la actividad de las isoformas de la SOD en regiones cerebrales
En las tablas 4, 5 y 6, se muestran los resultados de la actividad de las isoformas de la SOD de las regiones
de la amígdala, corteza cerebral y cuerpo estriado. Se muestra que el hipotiroidismo no modifica la
actividad de este grupo de enzimas en estas regiones.
Tabla 4. Actividad de las isoformas de la SOD en la amígdala
Mn-SOD
(U/mg proteínas)
Semanas
de
tratamiento
Control
Hipotiroideo
1
15.17 ± 0.79
17.03 ± 2.68
2
17.25 ± 1.44
18.69 ± 1.63
3
15.06 ± 3.68
21.93 ± 2.84
4
20.58 ± 1.62
25.13 ± 8.47
Cu/Zn-SOD
(U/mg proteínas)
Control
17.65 ±
3.61
15.96 ±
8.13
22.41 ±
4.19
19.50 ±
2.14
SOD total
(U/mg proteínas)
Hipotiroideo
Control
Hipotiroideo
21.30 ± 4.55
32.82 ± 4.09
38.33 ± 2.42
23.61 ± 3.18
33.20 ± 4.14
39.16 ± 4.90
24.73 ± 3.83
37.48 ± 9.80
32.40 ± 6.16
40.08 ± 2.04
46.67 ± 6.54
57.53 ±
13.96
Los valores representan el promedio de 5-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.
xxxv
Tabla 5. Actividad de las isoformas de la SOD en la corteza cerebral
Mn-SOD
(U/mg proteínas)
Semanas
de
tratamiento
1
2
3
4
Control
4.07 ± 0.31
4.85 ± 0.67
6.86 ± 0.03
5.73 ± 1.19
Hipotiroideo
6.15 ± 0.94
4.77 ± 0.57
6.99 ± 0.70
8.98 ± 1.55
Cu/Zn-SOD
(U/mg proteínas)
Control
2.20 ± 0.32
2.45 ± 0.61
1.89 ± 0.87
3.08 ± 0.58
Hipotiroideo
2.53 ± 1.13
3.13 ± 1.13
3.62 ± 0.50
5.96 ± 0.89
SOD total
(U/mg proteínas)
Control
Hipotiroideo
7.78 ± 1.58
6.97 ± 0.77
8.57 ± 0.77
8.35 ± 2.07
9.64 ± 0.93 10.21 ± 1.13
11.16 ± 2.64 12.92 ± 2.90
Los valores representan el promedio de 5-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.
Tabla 6. Actividad de las isoformas de la SOD en el cuerpo estriado
Mn-SOD
(U/mg proteínas)
Semanas
de
tratamiento
1
2
3
4
Control
3.07 ± 0.36
4.37 ± 0.33
2.85 ± 0.42
3.53 ± 0.41
Hipotiroideo
3.82 ± 0.31
3.09 ± 0.34
3.47 ± 0.47
4.26 ± 1.28
Cu/Zn-SOD
(U/mg proteínas)
Control
5.62 ± 0.33
4.45 ± 0.24
5.58 ± 0.10
6.00 ± 0.24
Hipotiroideo
5.09 ± 0.29
4.70 ± 0.20
5.90 ± 0.24
6.18 ± 0.93
SOD total
(U/mg proteínas)
Control
8.70 ± 0.66
8.82 ± 0.26
8.42 ± 0.51
9.53 ± 0.42
Hipotiroideo
8.91 ± 0.35
8.69 ± 0.38
9.37 ± 0.70
9.50 ± 0.42
Los valores representan el promedio de 5-6 evaluaciones independientes ± el error estándar.
En la figura 15 se presentan los resultados de la actividad de las isoformas de la SOD de las regiones del
hipocampo y el cerebelo. Se observa que el hipotiroidismo provocó en el hipocampo un aumento del 29%
de la actividad de Mn-SOD (panel A) durante la cuarta semana. Además, la disminución de las hormonas
tiroideas indujo un aumento de la actividad de la SOD total en el cerebelo (panel F) durante la primera y
cuarta semana de tratamiento. Dicho aumento de actividad se debe a que durante la primera semana se
incrementó tanto la actividad de Mn-SOD como la de Cu/Zn-SOD, y sólo en la cuarta semana se indujo un
incremento de la Cu/Zn-SOD.
xxxvi
Control
Hipotiroideo
*
4
3
2
C
9.5
Actividad de SOD total
(U/mg proteína)
Hipocampo
Actividad de Mn-SOD
(U/mg proteína)
5
Actividad de Cu/Zn-SOD
(U/mg proteína)
B
A
8.5
7.5
6.5
5.5
4.5
13.5
12.5
11.5
10.5
9.5
8.5
1
4.5
3.5
2.5
1.5
1
2
3
Semanas de tratamiento
4
7
*
6
*
5
4
3
1
2
3
Semanas de tratamiento
4
Actividad de SOD total
(U/mg proteína)
*
Actividad de Cu/Zn-SOD
(U/mg proteína)
Cerebelo
Actividad de Mn-SOD
(U/mg proteína)
D
5.5
2
3
4
F
E
11.5
10.5
*
*
9.5
8.5
7.5
6.5
5.5
1
2
3
Semanas de tratamiento
Figura 15. Efecto del hipotiroidismo sobre la actividad de Mn-SOD (A y D), Cu/Zn-SOD (B y E) y
SOD total (C y F) en hipocampo (A-C) y cerebelo (D-F). Los valores representan el promedio de 4-6
evaluaciones independientes ± el error estándar. (*) P<0.05 contra grupo eutiroideo al mismo
tiempo.
6.- Expresión de las enzimas antioxidantes: catalasa, Mn-SOD y Cu/Zn-SOD de regiones cerebrales
En la figura 16 se muestran los resultados de la expresión de las enzimas antioxidantes y se observa que en
el cerebelo de ratas hipotiroideas se aumentó la expresión de la Cu/Zn-SOD (panel K) durante la primera
semana. Mientras que la expresión de la catalasa en la amígdala (panel A) e hipocampo (panel M) mostró
un incremento durante la segunda semana por efecto de la disminución de hormonas tiroideas. En el caso
del hipocampo se aumentó en un 57%, mientras que en la amígdala se incrementó sólo el 26%.
xxxvii
4
Catalasa
C2
H2
C3
H3
C4
H1
C2
H2
C3
C4
*
0.55
B
0.45
0.35
2
C3
3
C
0.7
0.6
1
H3
C4
2
Índice de expresión
(catalasa/ β-actina)
H1
C2
H2
C4
H3
C4
1.0
0.8
0.6
H1
0.6
0.5
3
4
1
C2 H2
C3
H3
C4
H1
I
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
1
4
C4
C1
H4
H1
0.75
0.50
3
Índice de expresión
(Cu/Zn-SOD/ β-actina)
Índice de expresión
(catalasa/ β-actina)
K
2
2
C2 H2
1.3
3
4
C2
H2
C3
Índice de expresión
(catalasa/ β-actina)
H3
H3
C4
C4
C1
H4
H4
C1
0.5
C2
H2
3
Semanas de tratamiento
C4
H4
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
1
2
H1
C2
H2
C3
H3
C4
3
4
Semanas de tratamiento
H4
C1
H1
C2
H2
C3
H3
C4
H4
Mn-SOD (23 KDa)
β-actina (43 KDa)
0.8
1.0
0.9
0.8
O
0.7
0.6
0.5
4
H3
1.2
4
β-actina (43 KDa)
N
3
C3
0.6
2
β-actina (43 KDa)
0.3
4
β-actina (43 KDa)
0.7
Cu/Zn-SOD (20 KDa)
0.4
3
Mn-SOD (23 KDa)
L
0.9
catalasa (60 KDa)
0.5
2
H1
Semanas de tratamientos
0.6
1
2
1.3
1
*
0.7
M
C3
H4
Semanas de tratamiento
1.1
4
Índice de expresión
(Cu/Zn-SOD/ β-actina)
H1
1
*
Semanas de tratamientos
C1
C4
β-actina (43 KDa)
1.25
1
H3
Cu/Zn-SOD (20 KDa)
1.50
1.00
C3
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
Semanas de tratamiento
β-actina (43 KDa)
J
C2 H2
Mn-SOD (23 KDa)
Índice de expresión
(Mn-SOD/ β-actina)
H3
4
β-actina (43 KDa)
Índice de expresión
(Mn-SOD/β-actina)
C3
3
H4
1.7
1.6
1.5
Semanas de tratamiento
C2 H2
2
Semanas de tratamiento
Índice de expresión
(Mn-SOD/ β-actina)
Índice de expresión
(Cu/Zn-SOD/ β-actina)
Índice de expresión
(catalasa/ β-actina)
0.8
H1
H4
β-actina (43 KDa)
H
3
C4
Cu/Zn-SOD (20 KDa)
0.9
2
H3
0.7
1.8
1.0
C3
0.4
2
C1
1.1
1
H2
Semanas de tratamiento
catalasa (60 KDa)
Cerebelo
C2
β-actina (43 KDa)
F
1.2
1
C1
4
Mn-SOD (23 KDa)
1.4
4
H4
3
0.8
β-actina (43 KDa)
C1
Hipocampo
H1
1.6
catalasa (60 KDa)
G
2
H4
β-actina (43 KDa)
3
H3
C3
Cu/Zn-SOD (20 KDa)
Semanas de tratamiento
C3
0.75
Semanas de tratamiento
β-actina (43 KDa)
E
C2 H2
0.85
1
catalasa (60 KDa)
0.80
0.75
0.70
H1
0.95
4
C1
0.95
0.90
0.85
2
3
H4
0.65
C1
H4
1.05
Semanas de tratamiento
1.05
1.00
1
C4
0.65
0.5
4
C1
D
H3
β-actina (43 KDa)
0.8
Índice de expresión
(Cu/Zn-SOD/ β-actina)
H2
C3
Mn-SOD (23 KDa)
0.9
Semanas de tratamiento
C2
H2
1.15
0.65
H1
C2
β-actina (43 KDa)
0.25
C1
H1
Cu/Zn-SOD (20 KDa)
Índice de expresión
(Cu/Zn-SOD/ β-actina)
A
C1
H4
β-actina (43 KDa)
1
Corteza cerebral Cuerpo estriado
H3
catalasa (60 KDa)
Índice de expresión
(catalasa/ β-actina)
Amígdala
C1
0.75
Mn-SOD
Cu/Zn-SOD
H4
Índice de expresión
(Mn-SOD/ β-actina)
H1
Índice de expresión
(Mn-SOD/ β-actina)
C1
0.7
0.6
0.5
1
2
3
Semanas de tratamiento
4
1
2
3
Semanas de tratamiento
xxxviii
4
Figura 16. Efecto del hipotiroidismo sobre la expresión de catalasa (columna de A-M), Cu/Zn-SOD
(columna de B-N) y Mn-SOD (columna C-O) en las regiones de la amígdala (A-C), cuerpo estriado
(D-F), corteza cerebral (G-I), cerebelo (J-L) e hipocampo (M-O). Los valores representan el
promedio de 2 evaluaciones independientes ± el error estándar. Arriba de cada gráfica se muestran
los Western blot característicos de la expresión de cada proteína. C=control y H=hipotiroideo, el
número representa la semana de tratamiento. (*) P<0.05 contra grupo eutiroideo al mismo tiempo.
VI.- DISCUSIÓN
Se sabe que la deficiencia de hormonas tiroideas lleva a la disminución del metabolismo basal [47].
Existen modelos experimentales, para estudiar los efectos del hipotiroidismo sobre las variables
relacionadas con éste. En este trabajo se empleó un modelo de hipotiroidismo en rata inducido con
metimazol (mercaptometilinmidazol) a una dosis de 60 mg/kg/día durante cuatro semanas. Se observó que
la administración de dicho fármaco provocó una disminución de la concentración sérica de las hormonas
tiroideas, T4 y T3, así como de la temperatura colonal y el peso corporal, lo que concuerda con lo
reportado en trabajos previos [4, 11, 74].
El mecanismo por el cual el metimazol induce el hipotiroidismo se debe a que inhibe a la peroxidasa
tiroidea (EC 1.11.1.7), evitando la organificación de los residuos de tirosina de la tiroglobulina, lo que se
refleja en una menor síntesis de T4 y T3 [53]. La reducción de la concentración sérica de HT provoca una
menor generación de calor [47]. Gordon en 1981, propuso que el hipotiroidismo altera los sistema de
neurotransmisión a nivel del sistema nervioso central, modificando el punto de regulación de la
temperatura [36].
Por otro lado, los animales hipotiroideos presentan una menor ganancia de peso corporal comparados
contra los eutiroideos, lo que no se correlaciona con la disminución en el metabolismo basal; una
explicación a dicho evento, es que en el tejido adiposo de los animales hipotiroideos aumenta la expresión
de mRNA para leptina [51], favoreciendo una mayor concentración de dicha hormona en plasma [30] y
provocando que dichos animales ingieran menos alimento. Inclusive, el hipotiroidismo podría detener el
crecimiento de los huesos evitando la ganancia de peso [70]. Los datos obtenidos de la valoración del
estado tiroideo confirma el estado hipotiroideo de los animales empleados en este estudio.
Respecto a las modificaciones del sistema antioxidante generadas por la deficiencia de hormonas tiroideas
no se han reportado patrones comunes, pues en la mayoría de los estudios sólo se evalúa un tiempo y se
emplean diversas dosis, modelos y órganos. Por lo que la finalidad del presente proyecto fue evaluar en un
curso temporal el ambiente REDOX y las tres enzimas de la primera línea de defensa antioxidante, de las
regiones cerebrales de ratas que fueron sometidas a un tratamiento anti-tiroideo con metimazol durante
cuatro semanas.
En el cerebelo de ratas hipotiroideas aumentaron las concentraciones de glutatión reducido (GSH) y
glutatión oxidado (GSSG) durante las dos primeras semanas, lo que provocó un alza en el índice
GSH/GSSG en la segunda semana. Aunque no existen estudios acerca de estas variables en el cerebelo de
animales hipotiroideos, es posible que el aumento del GSH sea una estrategia protectora en contra de los
peróxidos [97], ya que el GSH favorece la activación de vías que previenen incrementos de peróxidos
como la neutralización no enzimática de dichos compuestos [19] o la conjugación de los productos
terminales de peroxidación lipídica con el GSH por el grupo de las glutatión-S-transferasas, pues se ha
observado que las hormonas tiroideas fungen como inhibidores de ese grupo de enzimas [49]. En un
trabajo previo se demostró que homogeneizados de cerebelo no se modifican las concentraciones de ROS
ni de peroxidación de lípidos por efecto del hipotiroidismo [11]. Incluso, es posible que el GSH se
incremente para activar el sistema antioxidante no enzimático como el de la vitamina E o el ácido
xxxix
ascórbico, debido a que se han encontrado modificaciones de estas rutas antioxidantes en el corazón de
ratas hipotiroideas [88]. Por otro lado, la acumulación del GSSG durante la primera semana puede deberse
a alteraciones en el ciclo del GSH, sobre todo, por una reducción de la actividad de la glutatión reductasa
(GR) como lo observaron Das y Chainy en homogeneizados de corteza cerebral de ratas hipotiroideas
[22]. Sin embargo, el ambiente REDOX del cerebelo permanece estable y el cambio que sufre durante la
segunda semana es un posible mecanismo de neuroprotección en contra del hipotiroidismo.
Respecto a las enzimas antioxidantes, la disminución de hormonas tiroideas provocó en el cerebelo,
cambios en las isoformas de la SOD. Es probable que el aumento de actividad de las isoformas Cu/ZnSOD y Mn-SOD durante la primera semana, facilite la dismutación del O2•-. El aumento de la actividad de
la Mn-SOD en la primera semana podría estar favoreciendo la supervivencia celular de la región [50],
mientras que la expresión de la Cu/Zn-SOD se induce porque el complejo de HT-RT funge como represor
de su gene [82]. Además, la isoforma SOD extracelular podría estar participando en la cuarta semana,
debido al aumento de la actividad de la Cu/Zn-SOD sin incremento en la expresión de Cu/Zn-SOD [63].
El aumento de la dismutación, el funcionamiento eficiente de las peroxidasas y el mantenimiento del
ambiente REDOX evitarían incrementos de marcadores oxidativos en esta región [11].
El hipotiroidismo indujo en la corteza cerebral modificaciones únicamente en el ambiente REDOX,
producido por el aumento de las concentraciones de GSSG y GSH. Es posible que el GSSG se acumule en
la corteza cerebral, porque el hipotiroidismo provoca menor actividad de la GR [22]. Como el GSSG es
tóxico, las células gliales promoverían la permanencia del GSH por más tiempo, ya que evitan la
degradación del GSH por la γ−glutamil transpeptidasa, como sucede en cultivos primarios de cerebros de
ratas neonatas hipotiroideas [24]. El correcto funcionamiento de los sistemas enzimáticos antioxidantes y
la posible participación de rutas no enzimáticas que dependen del GSH, evitan el aumento de marcadores
oxidativos [11].
El hipocampo es la región que presenta el mayor número de alteraciones en el sistema antioxidante por el
hipotiroidismo, ya que se incrementó la actividad de las peroxidasas con una reducción del índice
GSH/GSSG en la segunda semana. Además, en esta región se presentó al final del tratamiento, un
aumento de la actividad de la Mn-SOD y una disminución de la actividad de las peroxidasas. La reducción
del índice GSH/GSSG durante la segunda semana suscitaría el aumento de las ROS y la peroxidación de
lípidos durante la tercera semana, como se observó en un trabajo previo [11], a pesar del aumento de la
actividad las peroxidasas. Incluso, es posible que la disminución del GSH se asocie a alteraciones en el
sistema de neurotransmisión, principalmente el glutamatérgico, ya que se ha demostrado que las HT
modifican la composición de las membranas lipídicas [45], lo que a su vez perturba los gradientes iónicos
transmembranales [48] y la bomba de Na+/K+-ATPasa [73]. De tal forma que dichas alteraciones
retardarían la recaptura de glutamato. Si el glutamato permanece más tiempo en el espacio sináptico, se
puede inactivar el transporte de cistina al interior de la glía inhibiendo la síntesis de GSH y estimulando la
liberación del GSH por dicha célula [68], lo que generaría estrés oxidativo [11] y muerte celular [3, 4].
Por otro lado, a pesar del incremento en la expresión de la catalasa durante la segunda semana, no se evita
la formación de marcadores oxidativos en la tercera. Es posible que se reduzca la actividad de esta enzima
por inactivación del H2O2 [2, 38], mientras que el aumento de la actividad de la Mn-SOD durante la cuarta
semana evita mayor daño a la región [50].
En general, el hipotiroidismo promueve en el hipocampo de ratas alteraciones del ambiente REDOX y del
sistema de las peroxidasas. El daño oxidativo en esta región podría asociarse a alteraciones en la
neurotransmisión glutamatérgica y a la formación de peróxidos que no pueden ser compensados por
ningún componente del sistema antioxidante.
En la amígdala la deficiencia de HT aumentó las actividades de la catalasa y la GPX y se provocó un
aumento de la expresión de la catalasa en la segunda semana. Este aumento de la actividad evita la
generación de daño oxidativo, pues el ambiente REDOX permanece estable a pesar del aumento de las
ROS y la lipoperoxidación observada anteriormente [11]. Por otro lado, el hipotiroidismo estimula en
cerebro total el ciclo de las pentosas, induciendo el aumento de la 6-glucosa deshidrogenasa (EC 1.1.1.49)
y de su producto, el NADPH [102]. Además, la unión del NADPH con cada homotetrámero de la catalasa
es muy estable [52]. Este evento estabiliza el compuesto I (compuesto oxo-ferril) en la hidrólisis del
xl
peróxido de hidrógeno, provocando un aumento de la actividad [103]. Lo anterior explicaría el aumento de
la actividad de la catalasa sin incremento en su expresión.
En la amígdala de ratas hipotiroideas, las alteraciones del ambiente REDOX se evitan por estimulación del
sistema de las peroxidasas. Sin embargo, faltaría esclarecer si estos eventos son capaces de evitar el daño
celular en esta región.
El cuerpo estriado es una región que no presenta alteraciones del sistema antioxidante debido a un estado
hipotiroideo además, en un trabajo previo se observó que no se incrementan las variables oxidativas [11],
lo que demuestra que el ambiente REDOX no se modifica por efecto del hipotiroidismo en esta región.
Es posible que las alteraciones en el sistema antioxidante en las regiones cerebrales estudiadas, se
provoque por el efecto que tiene el hipotiroidismo sobre lo sistemas de neurotransmisión como; el
opiodérgico [72], el adrenérgico [42], el serotonérgico [91] y el colinérgico [81]. Quizás, la
susceptibilidad del hipocampo ante eventos de estrés oxidativo inducido por la deficiencia sérica de
hormonas tiroideas, radique en que es una de las regiones con mayor población de receptores
glutamatérgicos NMDA [69] y que a pesar de que el hipotiroidismo incrementa los receptores β2adrenérgicos [42] también los receptores μ-opioides se encuentran disminuidos [72] de tal forma que las
señales neuroprotectoras no son suficientes para compensar el daño.
El hipotiroidismo induce alteraciones de diversas variables fisiológicas dentro del organismo [45, 54, 80],
sin embargo, no existe un patrón común respecto al sistema antioxidante. La mayoría de los trabajos
tienen diversos factores como el modelo de hipotiroidismo empleado si éste es farmacológico, duración y
dosis del tratamiento anti-tiroideo; órgano en estudio, edad del sujeto experimental y especie.
Este es el primer estudio temporal que evaluó el sistema antioxidante de regiones cerebrales bajo un
tratamiento anti-tiroideo con metimazol. Con base en nuestros resultados, se demostró que las regiones
cerebrales se comportan de forma distinta para mantener su ambiente REDOX ante el hipotiroidismo. Así,
la activación del sistema antioxidante contribuye a evitar el daño oxidativo en las regiones del cerebelo,
corteza cerebral, cuerpo estriado y posiblemente la amígdala; mientras que en el hipocampo, las
alteraciones en los sistemas de neurotransmisión provoca la reducción en el sistema antioxidante lo que
favorece el daño oxidativo. Por lo tanto, es posible que el hipotiroidismo modifique por diferentes vías de
señalización el sistema antioxidante lo que provocaría protección o daño órgano-específico.
VII.- CONCLUSIÓN
El hipotiroidismo provoca cambios temporales en el sistema antioxidante enzimático y en el sistema
regulador GSH/GSSG dependiendo de la región cerebral involucrada. Así mismo, las estrategias de
protección antioxidantes que desencadenen las células de cada una de las regiones ante la deficiencia de
hormonas tiroideas, serán las responsables que permitan la supervivencia de las mismas.
xli
IMPACTO
Los resultados hallados en este trabajo, demuestran que las alteraciones en el sistema antioxidante de las
regiones cerebrales estudiadas se producen por la deficiencia sérica de hormonas tiroideas. Es por tanto,
muy interesante el continuar con esta investigación, realizando experimentos que aborden el sistema de
neurotransmisión. Respecto a este punto, se podrían evaluar las concentraciones de neurotransmisores y
receptores en las diferentes regiones cerebrales involucradas en procesos de neuroprotección o inducción
de daño celular. Así entonces, los resultados impactarán primeramente en la investigación básica y
posteriormente en el sector salud, ya que existe en México, un alto porcentaje de individuos con
deficiencias en la concentración sérica de hormonas tiroideas (hipotiroidismo “subclínico”), los cuales
presentan problemas de salud, desde infecciones frecuentes, migraña, problemas de circulación, etc.
xlii
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