Download capítulo 4 radicales libres y antioxidantes

CAPÍTULO 4
RADICALES LIBRES
Y ANTIOXIDANTES
CAPÍTULO 4
RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES
Como se mencionó anteriormente, todos los organismos aeróbicos, como producto de su metabolismo,
originan la formación de moléculas oxidantes. Las reacciones de oxidación-reducción (redox) son
biológicamente esenciales para la generación de compuestos de alta energía. Éstos se utilizan como
fuente para los procesos del metabolismo celular e involucran la transferencia de electrones.1-3 En la
actualidad, se acepta la propuesta respecto a que la tasa metabólica de las especies determina la esperanza
de vida, es decir, a mayor gasto metabólico por consumo de oxígeno, menor tiempo de vida.4 Esta
aseveración apoya la teoría de que el envejecimiento es producido por el incremento en el número de
radicales de oxígeno endógeno generados en las células y cuya acumulación produce un daño irreversible a las
biomoléculas. Esta teoría llamada de los radicales libres (RL) del envejecimiento fue propuesta por Denham
Harman en 19565 y es la más plausible, hasta el momento, para explicar este proceso, además de una serie de
enfermedades crónico-degenerativas como: diabetes mellitus, ateroesclerosis, enfermedad de Alzheimer,
cataratas, artritis reumatoide y cáncer, entre otras.1, 3,6,7
En este capítulo revisaremos brevemente los aspectos bioquímicos generales de la formación de RL y los
mecanismos antioxidantes que contrarrestan su efecto.
4.1. RADICALES LIBRES Y ESTRÉS OXIDATIVO
Los radicales libres (RL) son especies químicas que poseen en el último orbital un electrón no apareado,
por lo que, son capaces de extraer un electrón de las moléculas vecinas para completar su orbital,
convirtiéndose en componentes altamente reactivos y oxidantes. Una de las moléculas más susceptibles de
ser transformada es el oxígeno molecular (O2), su reducción involucra cuatro electrones y genera tres
especies reactivas de oxígeno (ERO2): anión superóxido (O2 ). peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical
hidroxilo (OH*) (Figura 4.1).1-3,6,7
Figura 4.1. Los cuatro pasos de la reducción del oxígeno molecular a agua con la
generación de tres especies reactivas de oxígeno (EROs).
El H2O2 no es un radical libre, pero cae en la categoría de EROs por ser un compuesto intermediario e importante
en la bioquímica de los RL, ya que, se descompone fácilmente en presencia de metales de transición, para
producir el más reactivo y dañino RL de oxígeno, el radical hidroxilo (OH·).3-7 Varios metales de transición
reaccionan con el H2O2, pero al que se le ha puesto más atención es al hierro. En el mecanismo mediado por
hierro, las sales ferrosas reaccionan con H2O2 para formar
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RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES
6,7
OH· por medio de una reacción llamada de Fenton. (Figura 4.2)
Fe (II) + H2O2
OH·+OH- + Fe(III)
Figura 4.2. Reacción de Fenton que involucra la presencia de sales ferrosas.
Por su parte, el O2-· puede reducir ciertos quelatos férricos, interviniendo en la reacción de formación
de OH·. La reacción condensada, sin los intermediarios del hierro, entre O2-' y H2O2 se conoce como
reacción de Haber-Weiss (Figura 4.3).6,7
O2- +H2O2
OH·+OH- + O2
Figura 4.3. Reacción de Haber-Weiss catalizada por hierro.
Los RL son generalmente producidos por reacciones de transferencia de electrones, las cuales
pueden ser mediadas por acciones enzimáticas que involucran a la cadena respiratoria, la fagocitosis,
el sistema citocromo P450, reacciones del retículo endoplasmico, la acción enzimática de xantina
oxidasa y la síntesis de prostaglandinas; además de reacciones no enzimáticas del oxígeno con
compuestos orgánicos o iniciadas por radiaciones ionizantes. Principalmente, son formados a través
de reacciones de oxidación-reducción (redox).6-8
Se considera a la mitocondria como la principal fuente de RL, debido a que en este organelo es donde
se produce la mayor parte de energía para la célula.4,6-8 La producción de O2_* mitocondrial ocurre en
dos puntos de la cadena de transporte de electrones (cadena respiratoria), en el llamado complejo I
(NADH deshidrogenasa) y en el complejo III (ubiquinona-citocromo creductasa). Bajo condiciones
normales, el complejo III es el principal centro de producción de EROs. Los electrones de las
deshidrogenasas de los complejos I y II son transferidos a la coenzima Q o ubiquinona (Q),
produciéndose la reducción de la coenzima (QH2) que subsecuentemente sufre dos reducciones
consecutivas de un electrón, en el llamado ciclo Q, usando formas oxidada y reducida de los
citocromos b y c. Se forma un radical de la coenzima Q (Q-) que es inestable y lleva a la producción de
O2_· por la transferencia de electrones directamente del oxígeno molecular (Figura 4.4).4
Figura 4.4. Ciclo Q para la producción de O
CAPITULO 4
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Otra especie reactiva de oxígeno es el llamado oxígeno singulete (1O2) que no es propiamente un radical libre
porque no contiene un electrón impar, ya que, los dos electrones de la última órbita ocupan el mismo orbital y
tienen los spin paralelos, es decir están apareados. Es una molécula muy reactiva y capaz de oxidar
rápidamente muchas otras, incluyendo ácidos grasos poli-insaturados. Se forma principalmente por
reacciones fotoquímicas y en los eosinófilos.8-10
Además del O2, el nitrógeno también es capaz de formar RL dos óxidos: óxido nítrico (NO*) y dióxido nítrico
(NO2*), conformando las llamadas especies reactivas del nitrógeno (ERNs). El NO* es un RL gaseoso derivado
de la oxidación del nitrógeno guanído-terminal del aminoácido L-arginina, en una reacción oxidativa que
consume oxígeno molecular y reduce equivalentes en la forma reducida de la coenzima nicotina-adeninadinucleótido fosfato (NADPH) para formar L-citrulina, esta reacción es catalizada por la enzima óxido nítrico
sintetasa (NOS) (Figura 4.5).9-12
NOS
L-arginina + O2 +NADPH
NO· + L-citrulina
Figura 4.5. Formación del radical de óxido nítrico a partir de arginina, oxígeno y NADPH.
-*
Los radicales OH*, O2 y NO* son capaces de reaccionar con las biomoléculas produciendo RL orgánicos
menos reactivos. El OH* reacciona con los carbonos centrales de las moléculas en forma RH, tales como
proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucléicos, convirtiéndolas en radicales (R*), este radical libre
carbono-central reacciona rápidamente con el oxígeno para formar un radical más estable llamado peroxílo
(ROO*) que a su vez puede tomar parte en otras reacciones para producir radicales alcoxilos (RO'). Así
mismo, los átomos de azufre en forma de compuestos sulfhidrilo (RSH) también pueden ser convertidos en
RL formando los radicales tiol (RS*).10 Por otro lado, el O2_· reacciona con el NO* para formar peroxinitrilo
(ONOO-).6-10 El peroxinitrilo es un poderoso oxidante que daña muchas moléculas biológicas y que a pH ácido
se puede descomponer liberando pequeñas cantidades de OH* independientemente de la catálisis de
metales. También, bajo ciertas condiciones, puede reaccionar con residuos de aminoácidos produciendo
nitrotirosina, compuesto que lleva a la inactivación enzimática (Figura 4.6).9,10
De todas las biomoléculas que pueden ser atacadas por RL, los lípidos son probablemente los más
susceptibles. Las membranas celulares son ricas en ácidos grasos poli-insaturados que son fácilmente
oxidables por un proceso conocido como lipoperoxidación o peroxidación lipídica. Este proceso daña
directamente la estructura de la membrana celular indirectamente a otros componentes celulares por la producción
de aldehidos reactivos. La lipoperoxidación se lleva a cabo por medio de una serie de reacciones en cadena
de tres pasos: iniciación, propagación y terminación. En la iniciación un ácido graso poliinsaturado es atacado
por un RL (OH·, RO· o ROO·) que abstrae un átomo de hidrógeno (H*) de un grupo metileno (—CH—) que
tenga un doble enlace adyacente, esta abstracción deja un carbono central desapareado (—*CH—). El radical
carbono-central sufre un rearreglo molecular para formar un dieno conjugado que, posteriormente, se combina
con O2 para formar un ROO*; este nuevo RL puede a su vez abstraer un átomo de hidrógeno de otro ácido
graso y así se propaga la reacción. La peroxidación continúa hasta que el sustrato se termina o se presenta un
antioxidante para romper la secuencia de la propagación (Figura 4.7).9,10
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RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES
Figura 4.6. Formación da radlcalea orgánicot aacundarioa a partir da EROa y NO*.
Figura 4.7. Reacciones da inicio y propagación da la lipoparoxidaclón.
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También existen sistemas enzimáticos que llevan a cabo reacciones de lipoperoxidación como parte de su acción
catalítica, tal es el caso de las ciclo-oxigenasas y lipoxigenasas que utilizan RL como intermediarios en las
reacciones de formación de endoperóxidos e hidroperóxidos, respectivamente. En estos casos, el RL se
localiza en los sitios activos de las proteínas.9
La extensa lipoperoxidación en las membranas biológicas causa pérdida de la fluidez, caída del potencial
de membrana, incremento de la permeabilidad a H * y otros iones y, eventualmente, liberación del
contenido celular y de los organelos causando la muerte celular.9
En las proteínas los RL producen carboxilación, pérdida de sulfhidrilos, fragmentación de moléculas, nitración,
enrollamientos erróneos de las estructuras secundarias o pérdida de la conformación de estructuras terciarias
y cuaternarias, reacciones espontáneas con glucosa (glucosilación) y entrecruzamíentos de tipo covalente.13-16
Todos los residuos de aminoácidos de las proteínas son sujetos de ataque por parte del OH*, siendo los de
preferencia: tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina, metionina y cisterna.13,14 Las proteínas oxidadas son
fácilmente degradadas por enzimas proteolíticas debido a la carboxilación, creación de nuevos grupo Ntermmales o cambios conformacionales. Se ha demostrado que el ONOO- oxida a las proteínas de
membrana y cítoplasmáticas afectando su naturaleza física y química.14-16
La glucosilación envuelve la interacción no enzimática entre los azúcares reductores, principalmente glucosa, con
los grupos amino de las proteínas para formar bases de Schiff que sufren un rearreglo molecular para formar
cetoaminas o compuestos de Amadori (Capítulo 3). Es un proceso que ocurre en varias semanas, por lo
que, afecta proteínas de larga vida. Estos productos glucosilados en presencia de O2.· y Fe(ll) forman
productos de fragmentación que posteriormente se condensan conformando los llamados productos
finales de glucosilación avanzada (AGEs, Advenced Glucosyiation End-products) o productos avanzados
de Maíllard. Hay suficiente evidencia que muestra que estos productos se incrementan con la edad, por lo que,
13,17
se relacionan con el envejecimiento.
Con respecto a los carbohidratos, el efecto de los RL parece centrarse en las reacciones de glucosilación
con proteínas, otros efectos son poco conocidos.16
El ADN no está exento del proceso oxidativo, tanto el nuclear como el mitocondrial.10 Al respecto Ames estimó
que una célula de rata recibe 100 000 golpes oxidativos en el ADN/día producidos por OH*,18 es decir, de cada
1012 moléculas de oxígeno que entran a la célula/día, es posible que 1 en 200 dañen al ADN.19 Las EROs pueden
causar entrecruza miento de proteínas-ADN, intercambio de cromátides hermanas, daño a la estructura de
desoxirribosa-fosfato y oxidación de las cuatro bases nitrogenadas.19-21 Las modificaciones oxidativas en las
bases producen mutaciones, mientras que la oxidación de la desoxirribosa puede inducir liberación de bases y
rompimiento en cadena sencilla de las hebras de ADN.16,21 Por lo general, los OH* producen múltiples productos
de oxidación de las bases como 8-hidroxiadenina y timidina glicol; el 1O2 preferentemente modifica la guanina
por 8-hidroxilación formando los compuestos 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (80HdG) y su base libre 8hidroxiguanina (80HG).21 La reactividad del OH' hacia la desoxirribosa varía considerablemente, siendo los
16
carbonos 4 y 5 los más susceptibles, la lesión predominantemente observada es el rompimiento de la
22
hebra mediado por hierro y H2O2.
RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES
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Adicionalmente a lo expresado con anterioridad, se sugiere que el incremento de EROs puede representar
una común, pero no universal, señal de estrés celular. Cuando el estrés es severo, la supervivencia es
dependiente de la habilidad de la célula para adaptarse o resistir el estrés y de reparar o reemplazar las
moléculas dañadas. Se han encontrado varios mecanismos de respuesta al estrés en las células a través de
4
caminos de señalización transcripcional y post-transcripcional que actúan sobre genes específicos. De éstos,
el sistema transcripcional del factor nuclear kappa B (NF-KB) se activa con concentraciones micromolares de
H2O2 en varios tipos celulares, así como, por la acción moderada pro-oxidante en el sistema redox del glutatión.
Un gran cuerpo de evidencia experimental ha sugerido que las EROs co-modulan la activación de NF-KB en
ciertos tipos celulares y bajo ciertas condiciones, así mismo, se ha descrito que este factor está
relacionado con la expresión de la óxido nítrico sintetasa (NOS).11
Para prevenir la formación de moléculas oxidantes y para reparar el daño oxidativo a los tejidos y
biomoléculas, todos los organismos aeróbicos poseen un complejo armónico de defensas antioxidantes
enzimáticos y no enzimáticos. El balance entre la producción de RL y las defensas antioxidantes determina el
grado de estrés oxidativo,4 de tal manera que se puede decir que el estrés oxidativo (EOx) es el desequilibrio
bioquímico propiciado por la producción excesiva de RL que provocan daño oxidativo a las biomoléculas y
no puede ser contrarrestado por los sistemas antioxidantes.2
4.2. SISTEMAS ANTIOXIDANTES
Se define como antioxidante a aquella "sustancia que, presente en bajas concentraciones comparada con los
sustratos oxidables, retarda o previene significativamente la oxidación de esos sustratos".9,33 Esta definición
enfatiza la importancia de la fuente de estrés oxidativo y el blanco medido (el sustrato oxidable), aunque hay
algunas moléculas que no cumplen exactamente con los requerimientos de la definición, como es el caso de
la albúmina.23
Los antioxidantes pueden actuar en diferentes etapas en una secuencia oxidativa, de ahí que su sitio de acción
puede ser intracelular, en la membrana celular o extracelular.
4.2.1. Antioxidantes celulares
Las células tienen formidables defensas contra el daño oxidativo, constituido básicamente por enzimas, por
lo que, la protección antioxidante ocurre a diferentes niveles:9-24
a)
b)
c)
d)
Previniendo la formación de RL.
Interceptando los radicales cuando son formados.
Reparando el daño oxidativo causado por los radicales.
Incrementando la eliminación de las moléculas dañadas por medio de
apoptosis.
e) No reparando excesivamente las moléculas dañadas para minimizar la
introducción de mutaciones.
f) Induciendo y asistiendo los antioxidantes enzimáticos y agentes
destoxificantes.
CAPITULO 4
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4.2.2. Antioxidantes de la membrana celular
Debido a la doble característica de la membrana celular, hidrofóbica en el interior e hidrofílica en el exterior, se
requiere de diferentes tipos de antioxidantes: moléculas liposolubles en el interior de la membrana e
hidresolubles en la parte externa.9
4.2.3. Antioxidantes extracelulares
Se han descrito en los líquidos celulares algunas variantes de enzimas que actúan a este nivel. Diferentes
proteínas atrapadoras de iones metálicos y compuestos de bajo peso molecular, y proteínas con actividad
de oxidación-reducción (redox).9
Para un mejor entendimiento de la acción de los antioxidantes, se han clasificado de acuerdo a su función,
dividiéndolas en tres grupos: primarios, secundarios y terciarios (Cuadro4.1, Figura 4.8).25,26
Sistemas Antioxidantes
Figura 4.8. Clasificación de los sistemas antioxidantes.
Cada uno de estos sistemas antioxidantes, in vivo, tienen diferentes mecanismos de acción, los cuales
describiremos brevemente a continuación.
4.3. ANTIOXIDANTES PRIMARIOS
Son los que previenen la formación de RL evitando así el daño oxidativo. Son el primer nivel de protección.
Hay tres mecanismos por los cuales se lleva a cabo su acción: a) descomponiendo enzimáticamente, los
hidroperóxidos formados y el H202 generado; b) quelando los iones metálicos
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RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES
Cuadro 4.1. Sistemas de defensa contra el daño oxidativo. (Modificado de Niki, 1999).
Sistema antioxidante
Antioxidante
1. Antioxidantes preventivos o primarios. Suprimen la
formación de radicales libres:
a. Descomposición no-radical de hidraperóxidos o
peróxido de hidrógeno (H2O2).
Enzimas:
- Catalasa (CAT)
- Glutatión peroxidasa (GPx)
b. Secuestro de iones metálicos catalíticos por
quelación.
Proteínas:
- Transferrina, ferritina
- Ceruloplasmina
- Albúmina
- Metalotioneínas
c. Remoción o depuración de especies reactivas de
oxígeno.
2. Antioxidantes "atrapadores" de radicales o
secundarios. Atrapan radicales para inhibirla cadena
de iniciación o romper la cadena de propagación.
3. Enzimas reparadoras y de novo o terciarios.
Reparan el daño y reconstituyen las biomoléculas.
Enzimas: -Superóxido
dismutasa(SOD)
a. Hidrofílicos:
- Vitamina C
- Ácido úrico
- Bilirrubina
- Albúmina
b. Lipofílicos:
- Vitamina E
- Vitamina A y Carotenoides
- Melatonina
- Estrógenos
- Reparadoras de lípidos
- Reparadoras de proteínas
- Reparadoras de ADN
potencialmente oxidantes por medio de proteínas, y c) removiendo o depurando enzimáticamente las EROs
que han sido formadas.
4.3.1. Descomposición no radical de hidroperóxidos y peróxido de hidrógeno.
■ CATALASA (CAT)
Es una enzima constituida por cuatro subunidades protéicas. Cada una contiene un grupo hemo en el sitio
activo, por lo que, es una hemoproteína. Cada subunidad generalmente contiene una molécula de NADPH
unida a ella, la cual ayuda a estabilizar a la enzima. Se encuentra en los
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peroxisomas celulares y en el citoplasma, principalmente en el hepatocito y los eritrocitos, aunque
también está presente a bajas concentraciones en las células del cerebro, corazón y músculo
esquelético.27-28 Cataliza la reacción de descomposición del H2O2 (Figura 4.9).
2H2O2
2H2O + O2
Figura 4.9. Reacción de descomposición del H2O2 catalizada por catalasa.
Es considerada una enzima antioxidante porque regula los niveles de H2O2 que, si se encuentran
elevados, pueden producir un exceso de OH* a través de las reacciones de Fenton y Haber-Weiss.28 Si
la concentración de H2O2 es fija, la velocidad inicial de remoción será proporcional a la concentración
de CAT presente. Esta reacción de descomposición del H2O2 puede ser seguida por la pérdida de la
27
absorción a 240 nm o por la medición de la liberación de O2 utilizando un electrodo de oxígeno.
- GLUTATIÓN PEROXIDASA (GPx, GSH-Px)
Enzima constituida por cuatro subunidades protéicas, cada una de las cuales contiene un átomo de
selenio (Se) en su sitio activo. El Se, probablemente, se encuentra en forma de selenio-cisteína, es
decir, en el aminoácido cisteína que contiene normalmente un átomo de sulfuro (R-SH) se encuentra
un átomo de selenio (R-SeH).27 A nivel celular se encuentra en citoplasma y mitocondria.28
Cataliza la oxidación del glutatión reducido (GSH) a glutatión oxidado (GSSG) a expensas de H2O2
(Figura 4.10).
H2O2 + 2 GSH
GSSG + 2 H20
Figura 4.10. Reacción de oxidación del glutatión catalizada por GPx.
La mayoría del glutatión in vivo está presente como GSH. Se ha encontrado alta actividad enzimática
en el hígado y eritrocitos, moderada en el corazón, hígado y cerebro, y baja en el músculo.27,28
La enzima es específica para GSH como donador de iones hidrógeno, aunque es capaz de aceptar
otros peróxidos, no sólo H2O2. Aparentemente el GSH reduce al Se y la forma reducida de la enzima
reacciona con el H2O2, es por ello que los organismos animales requieren de trazas de Se para un
buen funcionamiento antioxidante.27
La razón GSH/GSSG en las células normales se mantiene alta, por lo que, el mecanismo para regresar
el GSSG a GSH es llevado a cabo por medio de glutatión reductasa (GR), una enzima formada por dos
subunidades protéicas (cada una con un flavin-adenin-dinucleótido (FAD) en su sitio activo) que
cataliza la reacción a expensas de una molécula de NADPH.27,28
68
RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES
El NADPH requerido es provisto en los tejidos animales, principalmente, por una compleja vía
metabólica conocida como vía oxidativa de las pentosas fosfato, en donde la primera reacción es
catalizada por la enzima glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH).27
La velocidad a la cual la vía de las pentosas fosfato opera está controlada por el suministro de
nicotina-adenina-dinucléotido fosfato (NADP+) de la G6PDH. Como la GR actúa y la razón NADPH/
NADP+ disminuye, la vía de las pentosas fosfato acelera el reemplazo a NADPH.27
Se ha descrito que la CAT y la GPx actúan en cooperación para remover el H2O2 formado en las
diversas reacciones metabólicas, principalmente la llevada a cabo por la superóxido dismutasa
(SOD).27
La acción de la GPx puede ser valorada de diferentes maneras, ya sea midiendo la liberación de
GSSG o por acción de la enzima en un hidroperóxido orgánico en presencia de H2O2.27,28
4.3.2. Quejantes de iones metálicos
Son básicamente proteínas séricas, dentro de las cuales se encuentran: trasferrina, ferritina,
ceruloplasmina, albúmina, a-lactoalbúmina, β-lactoglobulina,inmunoglobulinas y otras proteínas no
identificadas de la leche de vaca pasteurizada. Su principal mecanismo antioxidante incluye la
remoción de radicales libres por aminoácidos tales como tirosina y cisteína, y la quelación de metales
de transición. También se reporta que las proteínas séricas incrementan los niveles de glutatión, al ser
fuentes naturales de cisteína y glutamilcisteína, precursores de la síntesis de glutatión.29
- TRANSFERRINA Y FERRITINA
El hierro ionizado en su forma ferrosa (Fe2*) tiene un efecto tóxico pro-oxidante derivado de la
reacción de Fenton, el cual es prevenido por las proteínas enlazantes de hierro: transferrina y
ferritina.
La tranferrina es una β2-globulina que "atrapa" al Fe2+ para distribuirlo a los sitios de absorción,
almacenamiento y utilización, une dos iones por mol de proteína9,30. Se han identificado receptores
celulares específicos para el hierro de la transferrina en hígado y placenta, pero los que ofrecen una
mayor área de receptores son los reticulocitos y los precursores eritroides de la médula ósea.30
La ferritina representa un grupo heterogéneo de proteínas hidrosolubles, relativamente termoestables,
presentes en casi todas las células, principalmente en hígado, bazo y médula ósea, y que almacenan
hierro en una forma relativamente inerte, y que además lo pueden liberar cuando se necesita para
efectuar procesos metabólicos dependientes de hierro como la síntesis de hemoglobina. Posee un
centro de hierro polinuclear rodeado de una cubierta protéica. Incorpora el Fe2* y lo oxida a Fe3+, lo
deposita en el interior del núcleo y lo libera cuando se enfrenta con agentes reductores como las
flavinas reducidas y el GSH.30,31
La acción antioxidante de ambas proteínas, y demás enlazantes de hierro, se debe a que el hierro
unido a ellas no está disponible para estimular reacciones de radicales como la lipoperoxidación o la
formación de OH·, convirtiéndose en una parte importante del sistema de defensa antioxidante
CAPÍTULO 4
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extracelular. Las proteínas no se dañan fácilmente por el H2O2 o los lipoperóxidos y sólo liberan los
iones de hierro a pH ácido.27
- CERULOPLASMINA
Es una α2-glucoproteína quelante de cobre en un 90% y que contiene 6 átomos de este metal por
molécula. También tiene la habilidad de oxidar el Fe2+ a Fe3+ sin liberar radicales de oxígeno
intermediarios, por lo que, se le conoce como ferroxidasa,27,31,32 siendo esta característica lo que la
hace ser considerada como una proteína antioxidante, ya que, mantiene el metal dentro de su sitio
activo.27 Es sintetizada en el hígado y localizada primariamente en el suero.31
La acción de ferroxidasa de la ceruloplasmina permite inhibir la formación de lipoperóxidos u OH·,
dependiente de hierro, a partir de H2O2. También tiene una actividad no significativa de "superóxido
dismutasa" o "catalasa", ya que, puede reaccionar con O2_· y HzO2.27 Inhibe la liberación de hierro
dependiente de O2_· de la ferritina, limitando la biodisponibilidad de éste in vivo al reincorporarlo a la
enzima cuando es liberado.31
La pequeña cantidad de cobre plasmático no unida a ceruloplasmina se enlaza a histidina, péptidos
pequeños y albúmina. Ninguna de estas formas de cobre puede, aparentemente, generar oxidantes
reactivos.27
Su actividad puede ser medida mediante su acción de oxidasa utilizando compuestos oxidables que
absorben en el espectro de luz visible.32
- ALBÚMINA
Es la más abundante de las proteínas séricas circulantes. Dentro de sus variadas funciones se
encuentra la de antioxidante tanto de forma primaria como secundaria. Es la responsable de más del
33
35% de la actividad antioxidante del plasma. Esta actividad se basa en su habilidad para unir iones
cobre inhibiendo la lipoperoxidación y la formación de OH· cobre-dependientes. Estas reacciones se
llevan a cabo en la superficie de la proteína y la dañan, por lo que, es considerada como un
"antioxidante sacrificado", pero debido a su alta concentración plasmática y su rápido recambio es que
el daño es probablemente insignificante. De esta manera, aunque la unión de cobre a albúmina provoca
daño en la molécula bajo ciertas circunstancias, se previenen reacciones de oxidación en blancos más
importantes.27
También es un poderoso removedor de ácido hipocloroso (HCIO), un oxidante producido por la enzima
mieloperoxidasa (MPO) en las células fagocíticas activadas. La MPO funciona como genuina oxidasa
dependiente de O2y no de H2O2 como co-sustrato para la oxidación de compuestos.34 Nuevamente, la
albúmina actúa reaccionando con el HCIO y protegiendo de la oxidación a blancos más importantes.27
Dentro de otras de sus funciones se encuentra la unión a compuestos no hidrosolubles como la
bilirrubina. Stocker, Glazer y Ames han sugerido que la albúmina unida a bilirrubina actúa como un
antioxidante en algunos sistemas lipidícos, aunque la prevención del daño oxidativo a través de los
mecanismos de cobre y HCIO son propios de la proteína.27
RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES
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- METALOTIONEINAS
Son proteínas de bajo peso molecular (aproximadamente 6500 daltons) que se encuentran en el
citoplasma de las células eucariotes, especialmente en hígado, riñón e intestino. Probablemente
también pueden entrar al núcleo. Son ricas en sulfuras (-SH) y poseen la habilidad de unir iones de
metales como zinc (Zn2+), cobre (Cu+), cadmio (Cd2+) y mercurio (Hg2+).27 Se han descrito dos
isoformas en la mayoría de los vertebrados, metalotioneína I y II.35
Su producción es inducida por estrés oxidativo de diferentes orígenes: físico, químico y por citocinas;
por lo que, se considera que son protectoras del estrés oxidativo por diferentes mecanismos.35 La
propiedad de secuestrar al Cu+ disminuye la generación de radicales promovidos por este metal, el
Zn2+ liberado de la Zn-metalotioneína puede inhibir la peroxidación lipídica y su alto contenido en
grupos-SH las hace excelentes removedores de O2 singulete (1O2) y OH·.27,35
4.3.3. Remoción o depuración de especies reactivas de oxígeno.
- SUPERÓXIOO DISMUTASA (SOD)
Fue descrita por McCord y Fridovich en 196827 como una enzima que se encarga de la dismutación
del ión superóxido (02~') por medio de la reacción que se presenta en la Figura 4.11.
202- + 2H+
H2O2 + O2
Figura 4.11. Reacción de dismutación llevada a cabo por SOD.
Se conocen tres formas moleculares (isoenzimas):27,36
- • Cobre-Zinc-superóxido dismutasa (CuZn-SOD) en citoplasma.
- • Manganeso-superóxido dismutasa (Mn-SOD), en la matriz mitocondrial.
- • Cobre-Zinc-superóxido dismutasa (EC-SOD), de alto peso molecular en líquidos
extracelulares.
Las enzimas citoplasmáticas CuZn-SOD son las más abundantes, tienen un peso molecular
aproximado de 32 000 daltons y contienen dos subunidades proteicas, cada una con dos sitios activos
uno que contiene un ion cobre y otro con zinc. En la reacción de dismutación, el cobre sufre un proceso
alternado de oxidación y reducción, mientras que el Zn na tiene acción catalítica sino que únicamente
estabiliza a la molécula. Por su parte, la actividad de las Mn-SOD es dependiente del tejido y la
especie, encontrándose que los eritrocitos de mamíferos no contienen esta forma de la enzima.27 La
isoenzima extracelular (EC-SOD) es secretora y remueve principalmente el O2-• del espacio
extracelular. Las tres isoenzimas tienen la misma actividad catalítica específica y funcionan juntas de
manera complementaria como consecuencia a su diferente distribución celular y subcelular.36
Debido a que en la reacción de dismutación se produce H2O2 se observa un incremento de éste en los
tejidos. El H2O2 es tóxico, y por la reacción de Fenton mediada por Fe2+ se produce OH•, de
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ahí que la actividad incrementada tanto intra como extracelular de la SOD aumenta la lipoperoxidación
y el daño celular.37 Este efecto dañino de la SOD es contrarrestado por las enzimas que se encargan
de transformar el H2O2 en compuestos no oxidantes como son la GPx y la CAT, por lo que, el efecto
antioxidante es llevado en dos pasos: la dismutación del O2 • y la conversión del H2O2. El balance entre
estos dos pasos antioxidantes enzimáticos pueden ser críticos, ya que, una actividad baja de SOD en
relación a GPx y/o CAT puede producir una acumulación de O2-, mientras que un exceso de SOD en
relación a GPx y/o CAT incrementa los niveles de H2O2.38
Existen diversas maneras de cuantificar la actividad de la SOD, utilizándose más frecuentemente un
método indirecto. En este método se genera O2• con la enzima xantina oxidasa a partir del sustrato
xantina y la SOD compite con un colorante indicador (INT) por el O2-•27 Los métodos actuales no
distinguen entre la actividad de las tres isoenzimas.36
4.4. ANTIOXIDANTES SECUNDARIOS
Cuando el nivel de antioxidantes primarios ha sido rebasado, el organismo tiene un segundo nivel de
protección llamado de antioxidantes secundarios. El papel de los antioxidantes secundarios es
"atrapar" a los RL que se han formado, impidiendo así la iniciación de una cadena oxidativa o
interrumpiendo su propagación.
4.4.1. Hidrofílicos
- VITAMINA C (ÁCIDO ASCÓRBICO)
Es una vitamina soluble en agua requerida in vivo como cofactor de varias enzimas, siendo
considerada como el más importante antioxidante en los líquidos extracelulares.27'39 Los humanos no
tenemos la capacidad de sintetizar ácido ascórbico al carecer de la enzima L-gulono-y-lactona oxidasa,
por lo que, es necesario suplementario exógenamente.29,40,41
Químicamente se encuentra como anión monovalente a pH fisiológico, por lo que, es un donador de
electrones específico, funcionando como agente reductor (antioxidante) en muchas reacciones intra y
extra celulares.29,41
Funciona en el organismo en forma de ascorbato, siendo su principal propiedad la habilidad de donar
dos electrones, ayudando al organismo a destoxificar varios radicales orgánicos derivados del oxígeno,
nitrógeno y sulfuras.29,42 La donación de un electrón del ácido ascórbico produce el radical de ácido
semideshidroascórbico, que posteriormente es oxidado a ácido deshidroascórbico (Figura 4.12),27,43,44
44
esta serie de reacciones es rápida, degradando la vitamina.
El ácido deshidroascórbico es reciclado a ascorbato por medio de la enzima deshidroascorbato
reductasa, con la participación del GSH en la reacción (Figura 4.13).27,44
Debido a esta serie de reacciones, el ascorbato ayuda a proteger contra las EROs, en medio acuoso in
vivo, ya que, reacciona rápidamente con O2·, OH·, H2O2 y radicales peroxilo (ROO·)> remueve el 1O2,
reduce los radicalestiol (RS") y se combina rápidamente con HCIO.27,39,43 También remueve muy
72
RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES
Figura 4.12. Reacciones de transformación de ácido ascórbico en presencia de RL.
Figura 4.13. Reacción de reciclado de ácido ascórbico en presencia de glutatión.
eficientemente ERNs previniendo la nitración de las moléculas44. En el interior de las células, el ascorbato actúa
como donante de electrones, formando parte de la interacción entre el hierro y la ferritina; fuera de las células puede
evitar la oxidación de la lipoproteína de baja densidad (LDL).45 En varios estudios con lípidos plasmáticos de
humanos se ha mostrado que es un inhibidor de la lipoperoxidación más eficiente que otros componentes del
plasma como tioles de las proteínas, urato, bilirrubina y a-tocoferol.39
El ascorbato juega un papel muy importante junto con la vitamina E en la protección de la membrana durante el EOx,
regenerando el a-tocoferol (vitamina E) presente en la membrana, a partir de
CAPITULO 4
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radicales α-tocoferilos que se forman en la inhibición de la peroxidación lipídica por vitamina E,
rompiendo la cadena de lipoperoxidación.27,29,43,44
Recientemente también se ha descrito que el ascorbato tiene una reacción sinérgica antioxidante con
los flavonoides, compuestos fenólicos que están presentes en mucho alimentos de la dieta humana46
(ver Capítulo 5).
Por otro lado, existen evidencias de que la vitamina C actúa como pro-oxidante in vivo, ya que, el
ascorbato puede reducir el Fe3+ a Fe2+, lo mismo que al Cu2+, en presencia de H2Oz, estimulando la
formación de OH• vía reacción de Fenton e iniciando la lipoperoxidación, aunque este efecto es
dependiente de la concentración de ascorbato presente, considerándose la posibilidad de que
megadosis de vitamina C suplementadas durante largo tiempo pueden causar oxidación en los
sistemas vivos,27,29,43 pero su mayor efecto es antioxidante.
Se han desarrollado varios métodos para la cuantificación del ácido ascórbico en muestras biológicas,
alimentos y productos farmacéuticos. Los sistemas de detección suelen basarse en una de las
reacciones siguientes: oxidación del ascorbato a ácido deshidroascorbico, reducción del ácido
deshidroascorbico a ascorbato o absorción ultravioleta (UV) del ascorbato o ácido deshidroascorbico;
siendo el método de elección la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) por ser más
preciso y exacto.44-45
- ÁCIDO ÚRICO
Tradicionalmente se consideraba que el ácido úrico era un desecho metabólico y biológicamente
inactivo, ya que, es el producto final del metabolismo de las purinas en los humanos, sin embargo,
actualmente se sabe que, debido a su estructura cíclica insaturada con un par de electrones no
compartidos, puede recibir hasta 6 electrones de radicales libres, por lo que, tiene una función
antioxidante in vivo.27,47 Al recibir estos electrones, se produce una deslocalización del electrón impar
sobre el anillo purinico dando origen a un radical de ácido úrico intermediario y menos reactivo que
puede ser reducido por otra molécula antioxidante (Figura 4.14).47,48
El ácido úrico es un poderoso removedor de 1O2, OH•, ROO•, ozono (O3) y HCIO, el cual por un
mecanismo no enzimático de oxidación se transforma a alantoína;27,47 remueve ERNs y quela iones
metálicos.46 También protege a los eritrocitos de la lipoperoxidación y es el responsable de una acción
antioxidante atrapadora del 15% respecto a otros componentes, atenuando la autoxidación lipídica de
ácidos grasos insaturados y LDL-colesterol; además, hay evidencias de que tiene una cierta acción
protectora de la oxidación del ADN celular.46,47
Figura 4.14. Conversión de urato a radical urilo.
74
RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES
Los electrones que recibe son en forma transitoria y después los cede al ácido ascórbico,
reduciéndose nuevamente, por lo que, se plantea una acción sinérgica entre ambos antioxidantes.47,48
Los estudios iniciales de Ames y cols, indican que el ácido úrico puede reemplazar algunas de las
funciones antioxidantes del ascorbato en humanos, preservando de esta manera a la vitamina.48
El ácido úrico puede ser degradado por la acción de iones metálicos como el cobre, acción que puede
ser protegida por algunos flavonoides. El mecanismo de protección puede ser por la intercepción de
especies reactivas, quelando los metales de transición y/o por la regeneración del urato de su forma
radical, incrementando así la capacidad antioxidante del plasma. Este mecanismo puede ser idéntico a
la habilidad del ascorbato para reciclar urato de su forma radical.46
Al igual que el ácido ascórbico, bajo ciertas circunstancias, y en bajas concentraciones, el radical de
ácido úrico puede participar en reacciones de propagación de lipoperoxidación vía reacción de
Fenton.47 Filipe y cols. (2001 )48 demostraron que el ácido úrico actúa como antioxidante in vitro a
concentraciones superiores a 20 µ.M, pero es pro-oxidante a concentraciones entre 5-10 µ.M.
El efecto antioxidante del ácido úrico puede seguirse en el laboratorio por la aparición de alantoína en
las muestras biológicas a 220 nm, este compuesto es un marcador biológico importante, ya que, sólo
se forma y se acumula bajo condiciones de estrés oxidativo.27
- BlLIRRUBINA
Es un pigmento biliar producido por el catabolismo del grupo hemo por medio de la vía hemo
oxigenasa. La forma libre o no conjugada es insoluble en agua y soluble en compuestos no polares,
por lo que, para ser transportada en el plasma necesita unirse a albúmina.
Desde los inicios de 1990 se ha descrito su papel fisiológico como un potente antioxidante,
considerándose que la forma unida a albúmina es antioxidante en los fluidos extracelulares humanos,
su actividad antioxidante es predominantemente debida a su habilidad para remover especies
reactivas como el O2-• y radicales ROO, además de que in vitro previene eficientemente la oxidación
de los lípidos de las membranas.49,50 La forma no conjugada rompe las cadenas de lipoperóxidos y
remueve el H2O2, ONOO- y ROO• in vitro, e in vivo remueve sustancias reactivas de oxígeno.49
Se han propuesto varios mecanismos por los cuales la bilirrubina actúa como antioxidante: por su
estructura, su vía de producción a través de la hemo oxigenasa y por su acción sinérgica con la
vitamina E.
Con respecto a su estructura se ha reportado que la bilirrubina, especialmente a bajas concentraciones,
reacciona con los radicales ROO' de las cadenas de lipoperóxidos donando un átomo de hidrógeno de
51
su anillo tetrapirrólico, tanto en su forma libre como en la unida a albúmina.
El papel protector contra EOx de la hemo oxigenasa y la bilirrubina ha sido demostrado en numerosos
estudios in vitro e in vivo, debido a que la liberación del hierro de las fuentes endógenas del hemo
produce un incremento de ferritina y de la capacidad celular para secuestrar al metal, aumentando la
resistencia al EOx. También se ha observado que la producción de EROs rápidamente disminuye el
glutatión reducido (GSH) e induce la actividad de hemo oxigenasa, esta
CAPITULO 4
75
inducción ocurre una vez que las sustancias reactivas de oxígeno se han incrementado y el sistema de
defensa antioxidantes (GSH, SOD, CAT y GPx) ha disminuido.49
Con respecto a su papel sinérgico con la vitamina E, se ha descrito que tanto la forma libre de la
bilirrubina como la unida a albúmina, pueden asociarse a la LDL, protegiendo eficientemente a los
lípidos de la peroxidación por un mecanismo de interacción entre éstas y el radical tocoferilo, muy
semejante al del ascorbato, convirtiéndose en la tercera línea de defensa antioxidante; es más, bajo
condiciones en donde la bilirrubina se incrementa y el ascorbato disminuye, la importancia relativa del
pigmento como antioxidante fisiológico se incrementa.52
Al igual que otros antioxidantes, también se ha reportado que tiene un efecto pro-oxidante, sobretodo
en presencia de cobre (Cu2+), ya que, tiene la capacidad de generar radicales libres especialmente
OH', provocando la degradación de ADN. El modelo propuesto para tal acción involucra la formación
de un complejo entre dos moléculas de bilirrubina y de dos iones Cu2+ en los nitrógenos de los anillos
pirrólicos terminales, que provocan oxidación del ADN.50
4.4.2. Lipofílicos
- VITAMINA E (Α-TOCOFEROL)
El término genérico Vitamina E agrupa al menos ocho diferentes compuestos, tocoferoles y
tocotrienoles, siendo cuatro los más abundantes: α, β γ y δ -tocoferoles, clasificados según el número
y posición de los grupos metilo en el anillo cromanol.
El más importante para los humanos es el α -tocoferol. Ninguno de los compuestos es sintetizado por
los animales. Una de sus principales funciones bioquímicas es su reactividad antioxidante, la cual está
asociada con las propiedades redox del anillo de su estructura (Figura 4.15).39,44,53
Debido a la característica de ser una molécula lipofílica, actúa en las membranas celulares y en las
partículas de lipoproteínas, especialmente la LDL; inhibe la lipoperoxidación al remover radicales
peroxilo lipidicos (LOO·) formando hidroperóxidos lipidíeos y un radical a-tocoferilo, el cual es menos
reactivo con los ácidos grasos poli-ínsaturados vecinos, rompiendo así la propagación. También atrapa
al 1O2 y reacciona con ONOO-. Por ello, comparado con otros antioxidantes lipofílicos, el β-tocoferol es
probablemente el más eficiente de los antioxidantes en la fase lípídica.27,39,43
Figura 4.15. Conversión de «-tocoferol en el radical a-tocoferilo.
76
RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES
Como se describió anteriormente, se ha reportado una reacción sinérgica entre el ácido ascórbico y el
α-tocoferol, ya que, la vitamina C reduce los radicales α-tocoferilos restaurando la actividad
removedora del α-tocoferol, reacción que se lleva a cabo en la superficie de las membranas y las
lipoproteínas, convirtiéndose el ácido ascórbico en el radical ascorbilo, mucho menos reactivo (Figura
27,39
4.16).
Figura 4.16. Reacción sinérgica entre α -tocoferol y ácido ascórbico.
La medición de los niveles de vitamina E en líquidos biológicos se puede llevar a cabo, simultáneamente
con el retinol y otros carotenoides, por HPLC utilizando un detector de absorción ultravioleta-visible,
permitiendo un análisis rápido y fácil.53,54
- VITAMINA A Y CAROTENOIDES
La vitamina A o retinol, químicamente es un alcohol con una estructura primaria base para una serie
de compuestos llamados carotenoides. El retinol puede ser reversiblemente convertido a retinal en
varios tejidos y posteriormente, por una reacción irreversible, a ácido retinoico, ambos compuestos
considerados como las formas activas de la vitamina (Figura 4.17).55,56
En general, los carotenoides son compuestos naturales coloridos (pigmentos), no sintetizados por los
animales, con propiedades lipofílicas. Se han descrito más de 600 compuestos diferentes, siendo
cerca de 50 con actividad de pro-vitamina A.44,55 Los principales carotenoides del plasma humano son
α y β-carotenos, licopeno, criptoxantina y luteína, pero el β-caroteno es el que tiene mayor actividad
antioxidante, ya que, produce dos moléculas de retinol al romperse.29
Figura 4.17. Estructura del retinol, forma alcohol-libre de la vitamina A.
CAPITULO 4
77
La vitamina A funciona como antioxidante rompiendo cadenas por una combinación con ROO·, antes
que estos radicales puedan propagar la peroxidación en la fase lipídica de la célula, generando
hidroperóxidos.27,55 Utilizando un sistema de peroxidación in vitro, la actividad antioxidante de los
57
retinoides es: retinol > retinal » palmitato de retinil > ácido retinóico.
Al igual que la vitamina A, la mayoría de los carotenoides tienen múltiples actividades antioxidantes,
incluyendo la habilidad para remover al 1O2 y ROO-, muy probablemente debido a su estructura que
contiene un sistema extendido de dobles enlaces conjugados.39,43,44,54 Los mecanismos mejor descritos
son los relacionados con el 1O2, que es una forma de oxígeno muy inestable por encontrarse en estado
excitado, proponiéndose dos formas de acción:43,55
• Física: que implica la transferencia de energía de las especies excitadas de oxígeno al
carotenoide, produciendo un carotenoide con un triplete excitado. La energía del
carotenoíde excitado es disipada a través de interacciones vibracionales con el
solvente para recuperar el estado basal y generando calor. Con este mecanismo, el
carotenoide permanece intacto, pudiendo sufrir varios ciclos de desactivación. Es el
mecanismo más importante.
• Química: Se sugiere que hay una reacción con los ROO" formando un radical caroteno
intermediarioque posteriormente es destruido. Este mecanismo contribuye a la
extinción de 1O2 en menos del 0.05%.
La habilidad química de los carotenoides para remover radicales ROO· aún siguen en discusión, sin
embargo, se plantea la posibilidad de que los carotenoides se combinen con ROO· para formar
grandes radicales de resonancia estabilizados, por un mecanismo de auto-oxidación.55
Los métodos tradicionales para medir carotenoides en muestras biológicas no permiten la separación
de los diferentes carotenoides de otros compuestos como la bilirrubina, y en los alimentos se involucra
la cuantificación de estos compuestos como potenciales precursores de vitamina A, por lo que, los
resultados son reportados como equivalentes de unidades de retinol. Por lo anterior, el método de
elección es el HPLC.44
- MELATONINA
Es una hormona producida por la glándula pineal, en la obscuridad de la noche, cuya función principal
es la inducción del sueño, el control de la función reproductiva y los ritmos circadianos, por lo que, es
considerada "el reloj biológico", aunque también se ha descrito que tiene una actividad antioxidante
importante.58-61 Químicamente es una indolamina derivada del triptofano, cuya producción en el humano
disminuye con la edad.58-60 Se ha sugerido que su estructura de indol le confiere propiedades
antioxidantes, siendo el metabolito N-acetil-5-metoxitriptamina el metabolito más activo.59
La melatonina parece funcionar como intermediario entre el individuo y el ambiente a nivel
neuroendocrino controlando la hipersecreción de glucocorticoides provocada por una inflamación o
estrés; a su vez, proporciona a la célula NADPH2 para regenerar GSSG a partir de GSH por inducción
de glutatión reductasa (GR) y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) del ciclo de las pentosas,
reduciendo la habilidad de la conversión de H2O2 a OH·.59 Pero existe controversia en
78
RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES
cuanto a su capacidad de remover EROs. Por un lado, Reiter y cols. (1996) indican que la melatonina
previene la lipoperoxidación de las membranas atrapando OH" convirtiéndose en el radical catión
indolil (Figura 4.18), que es menos tóxico, que a su vez puede remover con O2-· produciendo un
compuesto mucho menos reactivo (N1-acetil-N2-formil-5-metoxicinuramina) que es excretado en
orina,61 y Mahal y cols. (1999)62 confirman esta observación in vitro, agregando que la molécula puede
ser regenerada por iones ascorbato y urato, además de que, al encontrarse en la membrana, citosol y
el núcleo celular, no sólo remueve EROs, sino que también actúa como un agente reparador.
Figura 4.18. Estructura del radical indolil de melatonina.
Por otro lado, recientemente Antunes y cols. (1999)63 han descrito que la melatonina no puede
funcionar como un atrapador de los ROO· generados durante la lipoperoxidación, ya que, en su
estructura no contiene un átomo de hidrógeno abstraible como el α-tocoferol, pero sí actúa como una
molécula que retarda los sistemas de auto-oxidación de iones metálicos libres; además, su acción
antioxidante se lleva a cabo en concentraciones mucho más altas que las encontradas en el plasma y
tejidos humanos, por lo que, in vivo es muy probable que su función antioxidante sea muy débil.
La cantidad de melatonina es medida a través de sus metabolitos urinarios como la 6sulfatoximelatonina (6-SMT) por el ensayo inmunoenzimático (ELISA).61
- ESTRÓGENOS
Muchos compuestos de gran variedad estructural pueden tener actividad estrogénica. Las sustancias
estrogénicas pueden contener un sistema de anillos esteroideos, como las hormonas ováricas 17- β
estradiol (E2) y estrona (E,), o ser compuestos fenólicos no esteroideos como los estrógenos sintéticos
y las isoflavonas (fitoestrógenos) (Figura 4.19).64
Figura 4.19. Estructuras de un estrógeno natural y un fitoestrógeno.
CAPÍTULO 4
79
La actividad antioxidante de los estrógenos y sus metabolitos ha sido demostrada tanto in vivo como in
vitro, por medio de la inhibición de la oxidación del colesterol o la peroxidación de ácidos grasos poliinsatura dos o LDL. Este efecto antioxidante está asociado con el grupo OH de la estructura fenol del
estrogeno, resultando un radical fenoxi intermediario, el cual puede ser reducido nuevamente a fenol
por otros antioxidantes celulares; además, los estrógenos tienen la capacidad de regenerar el tocoferilo
a tocoferol más eficientemente que el ascorbato.64,65 Dentro de su actividad antioxidante, el estradiol
también promueve la vasodilatación, mostrando ser un cardioprotector.66
En presencia de iones metálicos con actividad redox, los estrógenos pueden actuar también como prooxidantes ya que, son convertidos a catecol por acción del sistema citocromo P450. Los estrógenos 4hidroxilados son oxidados por enzimas microsomales a semiquinonas (SQ) y quinonas (Q), los cuales,
a su vez, pueden ser reducidos por citocromo P450 reductasa-dependiente de NADPH. Este ciclo
metabólico redox puede generar O2_ que reduce el Fe3+ a Fe2+ y por medio de la reacción de Fenton
produce OH* (Figura 4.20) y es dependiente de la concentración de iones metálicos en el medio.65
Figura 4.20. Mecanismo de acción pro-oxidante de los estrógenos.
Teniendo como fundamento esta reacción pro-oxidante, la medición de la acción de los estrógenos se
lleva a cabo a través de la formación o inhibición de la 80HdG del ADN al generarse OH· durante el
ciclo metabólico redox de los estrógenos.65
4.5. ANTIOXIDANTES TERCIARIOS
Si los otros dos sistemas antioxidantes no han sido eficientes y las biomoléculas son oxidadas, todas
las células tienen una serie de enzimas que conforman los llamados sistemas de reparación. Los
sistemas de reparación incluyen enzimas encargadas de restaurar directamente las biomoléculas a su
conformación nativa, así como, enzimas catabólicas que pueden específicamente degradar las
moléculas no funcionales, esta degradación puede servir no sólo para removerlas del citosol, sino para
aumentar la cantidad de precursores para resíntesis.67
80
RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES
4.5.1. Reparación de lípidos
Como un mecanismo de defensa antioxidante celular, la reparación de lípidos comienza en la
membrana. Las membranas peroxidadas se vuelven rígidas, pierden la permeabilidad selectiva y, bajo
67
condiciones extremas, pueden perder su integridad. Se han descrito tres grupos de enzimas
27,66
reparadoras de lípidos como las principales:
ƒ
ƒ
ƒ
Fosfolipasas: Cortan los segmentos oxidados de la membrana para que otras
enzimas puedan reparar los segmentos dañados.
GPx y glutatión transferasas (GT): Reducen los peróxidos de ácidos grasos
liberados a alcoholes, sin eliminar grandes segmentos de las membranas.
Acetiltransferasas: Reemplazan los ácidos grasos dañados de los lípidos.
Estos grupos enzimáticos actúan en forma de cascada, uno detrás del otro (Figura 4.21).
En la figura 4.21 se puede observar como los ácidos grasos potiinsaturados de la membrana celular
son oxidados a lipoperóxidos por acción de los radicales libres (a), al ser oxidados se convierten en
buenos sustratos para enzimas fosfolipasas, de las cuales la fosfolipasa Az, en presencia de iones
...
PLase A: = fosfolipasa A:; GSH-Px = glutatión peroxidasa; GSH
= alcohol de ácido graso. FA-CoA = fatit-acii-coenzíma A.
Fuente: Halliwell B, Gutteridge JMC. 19S5
glutatión reducido; FAOH
Figura 4.21. Interacción entre las enzimas reparadoras de lípidos en la membrana celular.
CAPÍTULO 4
81
calcio, genera un ácido graso peroxidado y un lisofosfolípido (b); el ácido graso peroxidado liberado al
citosol es sustrato para la GPx, que lo reduce a un alcohol de ácido graso (c); finalmente, el
lisofosfolípido puede servir de sustrato por reacciones de reacilación con fatil-acil-CoA, restableciendo
27,68
la membrana (d).
4.5.2. Reparación de proteínas
Las proteínas que han sido oxidativamente modificadas pueden desnaturalizarse, convirtiéndose en
hidrofóbicas o llevar a cabo reacciones de entrecruzamíento con la formación de agregados insolubles
como los cuerpos de inclusión o la lipofuccina. Las proteínas desnaturalizadas son excelentes
sustratos para la degradación por sistemas proteolíticos,15 de ahí que actúen tres tipos de grupos
enzimáticos:68
• Proteinasas: Escinden proteínas oxidadas.
• Proteasas: Cortan los productos de la actividad de las proteinasas.
• Peptidasas: Rompen los productos de la actividad de las proteasas, liberando aminoácidos
que pueden reciclarse para la síntesis de nuevas proteínas.
Pacifici y cois, en 1989, sugirieron que la actividad proteolítica contra las proteínas oxidadas es llevada
a cabo por un gran complejo proteolítíco de 670 kDa llamado macroxiproteinasa (MOP), cuya función
es la degradación selectiva de proteínas aberrantes previniendo su acumulación y agregación.
Posterior a la acción de la MOP, se activan las proteasas y peptidasas, proveyendo así de aminoácidos
para la síntesis de novo de nuevas proteínas.15
4.5.3. Reparación del ADN
Como se mencionó anteriormente, los tipos de daño al ADN pueden agruparse en: rompimiento de
hebra (sencillo o doble), intercambio de cromátidas hermanas, entrecruzamíento ADN-ADN y ADNproteína, y modificación de bases. Las cuatro bases del ADN pueden ser oxidadas, pero las pirimidinas
parecen serlas más susceptibles,65 de ahí que se encuentren tres grupos de reparación:68
• Exo y endonucleasas: Eliminan los segmentos alterados del ADN.
• Glicosilasa y polimerasas: Rellenan los huecos que dejan las exo y endonucleasas.
• Ligasas: Sueldan los extremos de la hebra una vez corregidos los desperfectos.
Estos grupos actúan en combinación conformando la vía de reparación de escisión de bases (BER,
base excisión repait). Primero, las N-ADN glicosilasas rompen el enlace N-glicosílico entre la base
dañada y la desoxirribosa, dejando un sitio abásico (AP), apurínico/apirimidímico, que no son
informativos y por lo tanto, deben ser eliminados, asi que el esqueleto del ADN próximo al sitio abásico
es escindido por una AP-endonucleasa o unido por una AP-liasa.6S
Se han aislado varias exo y endonucleasas bacterianas, de las cuales la endonucleasa III rompe en el
lado 3' de los sitios AP, además de poseer una actividad N-glicosilasa para glicol-timina y residuos de
urea; y la exonucleasa III tiene una actividad nucleolítica de 3' a 5' que es responsable de la remoción
de los fragmentos de azúcar generados durante la ruptura oxidativa de la hebra. En los
82
RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES
mamíferos se ha aislado también una endonucleasa con una actividad semejante a la endonucleasa
III bacteriana. Se utiliza el término de redoxiendonucleasas para las nucleasas que participan en la
reparación del daño oxidativo del ADN.15
También el ADN puede sufrir desmetilaciones oxidativas, por lo que, las ADN metilasas juegan un
papel importante en la restauración de los patrones de metilación y mantienen el fenómeno
epigenético.15
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