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16-01-2014
Replicación del DNA e introducción a la
técnica de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
Curso de Biología Molecular y Genómica,
Instituto de Ciencias Biomédicas (ICBM),
Fac. de Medicina
Universidad de Chile
Dr. Juan Venegas Hermosilla
Enero, 2014
Introducción: componentes del ADN,
los desoxirribonucleótidos (dNMPs).
Fig.1. Se distinguen dos tipos: a) de un anillo = pirimídicas (C y T),
b) de dos anillos = púricas (A y G).
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Estructura de la doble hélice
La molécula de ADN (ácido
desoxirribonucleico) es el modelo
genético de cada célula y, en última
instancia, lo que determina todos los
aspectos de un ser vivo. La molécula
de ADN fue descubierta en 1951 por
James Watson, Francis Crick y
Maurice Wilkins empleando la
técnica de difracción de los rayos X.
En 1953, Watson (izquierda) y
Francis Crick (derecha) describieron
la estructura en doble hélice de la
molécula de ADN como una especie
de escalera de caracol con muchos
escalones. En 1962 ambos recibieron
el Premio Nobel de Medicina por su
trabajo.
Fig. 2.
La estructura de la doble hélice
descrita por Watson y Crick en 1953,
tiene las siguientes características:
•
La unión de dos
desoxirribonucleótidos se
realiza vía un ENLACE
FOSFODIESTER en el cual
esta involucrado el oxígeno del
carbono 3´ de la desoxirribosa
de un dNMP, con el oxígeno
del carbono 5´ del siguiente
dNMP, unidos vía un grupo
fosfato. Tal como se ve en la
fig. 3.
•
Este hecho da origen a una
molécula POLAR. Es decir,
que tiene un determinado
SENTIDO, caracterizado por
un extremo 5´ y un extremo 3´.
Fig. 3.
Hebra de DNA 5´-ATG-3´
o simplemente ATG
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La molécula de ADN estaba formada
por dos hebras ANTIPARALELAS.
F1
Fig. 4
Eso quiere decir que una de las hebras estaba en el sentido 5´- 3´ y
la otra en el sentido inverso, tal como se muestra en la Figura.
Entre las hebras antiparalelas del ADN
doble hebra, hay COMPLEMENTARIDAD
DE BASES NITROGENADAS, (Fig.5).
Eso implica que: siempre cuando en una hebra había una timina (T) en la otra
hebra había una adenina (A), y vise-versa.
En cambio, cuando en una hebra había una citosina (C), en la otra había una
guanina (G).
-Además, la unión de una T con un A era a través de DOS puentes
hidrógenos, en cambio, la unión de una C con una A, era a través de TRES
puente hidrógenos. ¿en que afecta esto la estabilidad de la doble hélice?.
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Diapositiva 5
F1
Fcoinhell, 04-11-2012
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En la doble hélice los enlaces fosfodiester
forman un esqueleto de azúcar-fosfato
helicoidal, que queda hacia el exterior de la
molécula.
En cambio,
las bases
nitrogenadas
quedan hacia
adentro
formando
especie de
escalones
Fig. 6
De la información anterior:¿Qué se podría
inferir con respecto a como podría ser la
duplicación o replicación de esta molécula?
-La COMPLEMENTARIDAD de bases nitrogenadas sugería que
una hebra podía ser el MOLDE O MATRIZ de la otra (Fig. 6).
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Hebra molde (matriz o parental) y hebra hija
Fig. 7. La doble hélice de Watson y Crick, sugería que la molécula de DNA que
surgía de la duplicación (la nueva doble hélice) estaba constituida por una
hebra parental (antigua) y una hebra hija complementaria (nueva) Esto sugería
que la duplicación del DNA era SEMICONSERVATIVA.
Los científicos que demostraron que efectivamente era así, fueron Meselson y
Stahl.
Experimento de Meselson y Stahl (1957).
a) Cultivó bacterias por
varias generaciones en
presencia del isótopo
pesado 15N. Aisló el DNA y
lo centrifugo. Todo el DNA
aparece cerca del fondo
del tubo.
b) Posteriormente, trasladó las
bacterias a un medio de cultivo con
14N, dejó que se originara una
primera generación de ellas. Aisló y
centrifugó el DNA, encontró que el
DNA se encontraba en una zona
intermedia del tubo.
c) En una segunda generación de
estas bacterias, al aislar y
centrifugar el DNA, encontró dos
zonas donde sedimento el DNA.
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Con el experimento de Meselson y Stahl, se
demostró que la replicación era semiconservativa, pero surgía una nueva
pregunta:
• ¿En que dirección o sentido se realizaba
la síntesis de las hebras hijas?.
¿Cuál seria entonces el sentido
(dirección) de la síntesis de la hebra
hija?.
•
La respuesta a esta pregunta vino de los estudios de Reiji Okazaki
(1960), analizando la incorporación de timidina tritiada (timidina
marcada con el isótopo tritium, 13H) en la replicación del DNA
cromosomal de la bacteria Escherichia coli .
•
Con estos estudios él demostró que la síntesis de las hebras hijas
era en el sentido 5´- 3´, que además, una de las hebras se
sintetizaba en forma discontinua (a los que posteriormente se le
llamaron “Fragmentos de Okazaki) y la otra en forma continua.
•
Es decir, que la replicación del DNA es también SEMIDISCONTINUA.
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Resultados de los estudios de Okazaki:
replicación SEMIDISCONTINUA
•
•
•
Esto implica que hay una hebra “líder” (continua) y una hebra
retrazada (discontinua).
De este modelo surge el concepto de “horquilla de replicación” =
vértice donde se va abriendo la doble hélice.
Nótese que la dirección del avance de la horquilla no es igual a la
dirección de la síntesis de la hebra retrazada.
Sin embargo, todavía quedaban mas
preguntas por contestar, entre ellas:
• ¿Dónde se iniciaba la replicación del DNA, en sitios al
azar o en algún sitio especifico?
• Si se iniciaba en un sitio especifico u ORIGEN DE
REPLICACION: ¿ esta seria en una sola dirección
(unidireccional) o ambas direcciones (direccional) ?.
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Comienza en un origen y es usualmente
bidireccional: Experimentos de John Cairns
Lehninger, pag. 951, IV Ed. 2005
Este experimento confirmó además que la síntesis de ambas hebras
era simultánea y que se generaba una estructura que sería llamada
“burbuja de replicación”.
La burbuja de replicación
• Los resultados de los experimentos
anteriores indican que en la replicación del
DNA se produce una estructura que se
llama “burbuja de replicación” (ver
fig.anexa).
• En esta estructura hay dos horquillas de
replicación, que avanzan en sentidos
opuestos.
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La burbuja de replicación: avance
bidireccional de las orquillas.
Resumiendo hasta aquí: las
características generales de la
replicación del DNA (doble hélice)
son:
- Semiconservativa
- Semidiscontinua
- Comienza en un origen y es usualmente
bidireccional
- La síntesis de las hebras hijas es en la
dirección (sentido) 5´-3´.
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Bases moleculares de la
replicación del DNA
Estudios realizados en la bacteria
Escherichia coli (Arthur Kornberg).
•
•
DNA cromosomal de la E.coli: doble hebra circular cerrado.
Secuenciado completamente en 1997 (Science 277 (5331) :1453-1462), cepa K-12,
tiene una longitud de 4.639.221 pares de bases (pb) y codificaría para 4288
proteínas.
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Características del origen de replicación u
oriC.
Formación de
complejo preelongación.
- HU y IHF = proteínas tipo histona que ayudan a la unión de la
proteína DnaA a la doble hebra en el oriC.
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Necesidad de unión de una TOPOISOMERASA para
relajar la tensión producida por la abertura de la doble
hélice.
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Síntesis de los RNA partidores
(“primers” o cebadores) por la
Primasa.
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Elongación de los partidores por la DNA
polimerasa III de E. coli, tanto en la hebra líder
como en la hebra retrazada.
Características generales de
las DNA polimerasas:
1. Requieren una hebra de DNA molde
(templado o matriz).
2. Necesitan un partidor (primer).
3. Utilizan un desoxirribonucleótido trifosfato (dATP, d-GTP, d-CTP y d-TTP
4. Polimerizan en sentido 5’ a 3’,
adicionando nucleótidos al extremo 3’
libre.
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Reacción catalizada por todas las
DNA polimerasa
Además, en E. coli todas las DNA
polimerasas poseen una actividad
correctora llamada exo 3´-5´.
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Las tres DNA pol. de E. coli
Estructura general de las DNA polimerasas:
forma de una mano derecha (modelo de la
pol I de E. coli)
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Subunidades de la DNA polimerasa III
de E. coli (la pol replicadora)
Estructura de un dímero de la DNA polimerasa III de E. coli
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Volviendo a la horquilla de replicación:
Dímero de la pol III cuando esta sintetizando
simultáneamente la hebra líder y la hebra
retrazada.
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Remoción de los partidores y
ligamiento de los fragmentos de
Okazaki.
Función de la topoisomerasa IV para separar los dos DNA duplex
replicados
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Fin de esta primera parte.
Suplemento:
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Deoxyribonucleotides and ribonucleotides of nucleic acids
Watson-Crick model for the structure of DNA.
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Comparison of A, B and Z forms of DNA
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