Download Clase 13. Tema IV. Replicación

Replicación del DNA
En base a lo que conocemos de la
estructura de DNA.....
1.
La doble hélice de DNA con su
apareamiento entre cadenas
complementarias sugiere que
cada cadena sirve como molde
para la síntesis de una cadena
hija
2.
La conservación del contenido
A/T y G/C en todas las células de
un organismo
Posibles mecanismos de replicación del
DNA
Hebras parentales
Replicación
Estructura del DNA
Doble Hélice
Semiconservadora
Cadenas
complementarias
Conservadora
Dispersa al azar
¿Pruebas experimentales?
Hebras hijas
Experimento de Meselson y Stahl
Alimentar cultivo
de E. coli con
fuente de 14N o 15N
y purificar el DNA
Separación de DNA
por centrifugación en
gradiente de CsCl
Experimento de Meselson y Stahl
Comprobación del mecanismo semiconservador de replicación
Consistente con
un mecanismo
semiconservador
Se deja otro ciclo
de replicación
DNA
bacteriano
durante
replicación
¿Es la replicación del DNA unidireccional o bidireccional?
En bacterias, que tienen genoma circular cerrado
Replicación del DNA de E.
coli por 1.5 generaciones
en presencia de
nucleótidos marcados
Autoradiografía
Demostración experimental
Experimento de Gyurasits y Lake
DNA de Bacillus subtilis
Pulso de baja intensidad
en el inicio
Pulso de alta intensidad
Resultados del experimento de Gyurasits y Lake
• Horquillas en ambas direcciones muestran marca fuerte,
lo que indica que que fueron activas durante el segundo
pulso. Ambas horquillas surgen de un punto inicial que
es el origen de replicación. Las horquillas se mueven en
direcciones opuestas.
• Evidencia de que la replicación del DNA es bidireccional
y a partir de un origen de replicación
Reacción básica de la replicación de DNA
DNA polimerasa
DNAn + dNTP
(DNA)n+1 + PPi
• Cada cadena de DNA sirve como molde para la síntesis de una
cadena nueva
• Los substratos son desoxiribonucleósidos 5’ fosfato (dNTPs:
dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (nucleótidos)
• Las cadenas de DNA se separan y se sintetiza la hebra
complementaria de cada una, de manera simultánea
• Las DNA polimerasas añaden dNTPs al molde de la cadena
madre en dirección 5’ a 3’
• La DNA polimerasa requiere un 3’OH libre para poder
polimerizar
Se produce un ataque nucleofílico del 3’OH al
fosfato α del dNTP entrante
dNTP
γ
β
α
DNAn
molde
PPi
(DNA)n+1
γ
β
α
Pero si…
La horquilla de replicación es bidireccional
Las cadenas
de DNA son
antiparalelas
Y la DNA polimerasa
solo sintetiza en
dirección 5’ a 3’
Entonces….
¿Qué ocurre en la horquilla de replicación para que se
puedan sintetizar las dos hebras de manera
complementaria y antiparalela, aún cuando la horquilla
avanza en una dirección?
Mecanismos para explicar la síntesis de
las cadenas complementarias
Síntesis continua requiere
que las DNA polimerasas
sintetisen DNA de 5’->3’ y
de 3’ -> 5’
Síntesis discontinua las dos
cadenas nuevas se sintetizan
en fragmentos, en dirección
de 5’->3
Síntesis semidiscontinua
una cadena se sintetiza en
forma continua y la otra en
forma discontinua, en
dirección de 5’->3.
La replicación del DNA es semidiscontinua
Experimentos de Reiji Okazaki
Durante la replicación
del DNA se sintetizan
fragmentos que varían
entre 1000 a 2000
nucleótidos
¿Explicación?
Replicación semidiscontinua:
Una hebra se sintetiza en forma continua y la otra discontinua
Cadena adelantada o guía (leading)/ Cadena retrasada (lagging)
5’
3’
*
3’
5’
5’
3’
5’
3’
*
5’
*
3’
3’
3’
5’
5’
5’
3’
5’
3’
Como la dirección de síntesis de la cadena discontinua es
opuesta a la dirección de apertura de la horquilla, se comienza
una nueva cadena.
En cambio, la cadena continua simplemente se sigue alargando
Como la DNA polimerasa no puede polimerizar una hebra
nueva de DNA si no cuenta con un cebador que tenga un
3’OH libre, es necesario que estos cebadores sean
sintetizados previo a que la DNA polimerasa actúe
continua
Hebra “guía”
Fragmentos
de Okazaki
Hebra
“retrasada”
discontinua
El crecimiento de ambas cadenas es en sentido 5’
3’
Los cebadores son sintetizados por una DNA primasa
La DNA primasa emplea ribonucleótidos para sintetizar los cebadores
Generalidades de la Replicación
de DNA
•
•
•
•
•
Semiconservadora
A partir de un origen de replicación
Bidireccional
Semidiscontinua
Requiere de un cebador de RNA
Origen de Replicación OriC
En bacteria hay un solo origen de replicación
Secuencias repetidas en
tandem (13 pb)
Cajas reconocidas por DnaA (9 pb)
1.
Activación por metilación de A en GATC
2.
Unión de DnaA “abre el DNA”
3.
Unión de DnaB y DnaC- actividad helicasa
ATP dependiente
4.
Unión de SSB para mantener separadas las
cadenas de DNA
El DNA cuando está
superenrollado no se
puede replicar.
Proteínas que intervienen
en la apertura de la doble
hebra de DNA preparándola
para ser replicada:
DnaA, DnaB, DnaC, y HU
en OriC
Proteína Dna A
• La proteína DnaA es un monómero de 52
kDa. Tiene una muy alta afinidad por ATP
(Kd = 0.03 µM) y lo hidroliza lentamente a
ADP en una forma dependiente de DNA.
Tiene un dominio de unión a ATP.
• Se une con alta afinidad y de forma
cooperativa a las cajas dnaA de oriC y se
ha calculado una estequiometría de 30
subunidades de dnaA por oriC.
Reconocimiento del oriC y formación del primosoma
1. La proteína HU causa
torsiones en el DNA y facilita
su unión a la proteína DnaA
2. La unión del complejo
HU-ATP-DnaA desestabiliza
la doble hélice en la región
P1
Reconocimiento del oriC y formación del primosoma
3. Unión de la proteína DnaA al origen de replicación.
Depende de ATP. Desestabilización de la doble hélice en la
región P1.
Proteína DnaB. Helicasa
Monómeros de 50 kDa que forman
un homohexámero.
Tiene dominios que se requieren
para:
• Interacción con la proteína DnaC
• Unión a DNA de cadena sencilla
• Unión a DNA de cadena doble
• Activación de la primasa
• Hidrólisis de ATP
La helicasa rodea una de las hebras del
DNA duplex y se desplaza logrando la
apertura de la doble hélice por exclusión
estérica.
Una hebra es excluida del canal interno,
mientras que la otra hebra es retenida en
el interior del anillo.
DnaB. helicasa
Rompe los
puentes de
hidrógeno
entre las bases
Reconocimiento del oriC y formación del
pre-primosoma
3. Unión de DnaB y DnaC a
la región abierta del DNA.
Reconocimiento del oriC y formación del primosoma
2. La unión del complejo HU-ATP-DnaA
desestabiliza la doble hélice en la región P1
1. La proteína HU causa
torsiones en el DNA y
facilita su unión a la
proteína DnaA
3. Unión de
DnaB a la
región
abierta del
DNA. Unión
de DnaC a
DnaB
Proteína SSB “Single-strand binding”
La proteína SSB se une al DNA de cadena sencilla con alta
afinidad y así previene que se vuelva a formar el híbrido DNADNA.
Proteínas de unión a cadena sencilla
(SSB)
La unión de SSB es cooperativa y ayuda a la
polimerasa facilitando su actividad
Estructura de las SSB
• Una vez que se ha abierto el DNA y se
evita su rehibridación o autohibridación,
comienza la síntesis
Como la DNA polimerasa no puede polimerizar una hebra
nueva de DNA si no cuenta con un cebador que tenga un
3’OH libre, es necesario que estos cebadores sean
sintetizados previo a que la DNA polimerasa actúe
continua
Hebra “guía”
Fragmentos
de Okazaki
Hebra
“retrasada”
discontinua
El crecimiento de ambas cadenas es en sentido 5’
3’
DnaG Primasa
La primasa es una proteína
monomérica de 60 kDa que sintetiza
oligo-ribonucleótidos de 10 a 12
unidades de longitud, usando rNTPs.
Es dependiente de molde y la
secuencia corresponde al origen de
replicación.
El extremo 3‘ del último
ribonucleótido es extendido como
DNA por la acción de la DNA
polimerasa. Se forma una unión
covalente entre RNA y DNA
DNA primasa
RNA polimerasa
que sintetiza los
cebadores de RNA
La DNA polimerasa III cataliza la reacción de
polimerización durante la replicación
La actividad de DNA polimerasa
cataliza la adición de un dNTP al
extremo 3’-OH de un
polidesoxinucleótido
complementario al DNA molde, por
un mecanismo de desplazamiento
nucleofílico.
Con un alto grado de fidelidad gracias a su
actividad exonucleasa
Hay dos propiedades importantes de las DNA
POLIMERASAS:
FIDELIDAD Y PROCESIVIDAD
La FIDELIDAD se refiere al
seguimiento exacto de la secuencia
que sirve como molde. En promedio,
las DNA pols, 1 error por cada 108 nts
La actividad de exonucleasa 3’ 5’
de la DNA polimerasa contribuye a la
fidelidad pues tiene actividad
correctora (proofreading).
Competencia cinética entre la actividad de Polimerasa y de Exonucleasa
La PROCESIVIDAD se refiere a la capacidad de una DNA
polimerasa de elongar una cadena de DNA por muchos nucleótidos
antes de disociarse del complejo que forma con el sustrato.
La DNA polimerasa I tiene una procesividad baja. Es distributiva.
La DNA polimerasa III tiene una procesividad alta.
Actividad de
exonucleasa 3’ 5’
Si la síntesis
no fuera de
5´-3´ la
Polimerasa
no podría
efectuar el
proofreading
Mismatch
Subunidades de la DNA polimerasa III de E. coli
Sub
α
# por
holoenzima
2
Mr
Función
132,000
Actividad polimerasa
ε
2
27,000
Exonucleasa 3’→
→5’
θ
2
10,000
Se requiere para la union de
DnaB
τ
2
71,000
Unión estable al molde,
dimerización del núcleo
γ
2
52,000
δ
1
35,000
δ’
1
33,000
χ
1
15,000
ψ
1
12,000
β
4
37,000
Abrazadera que carga las
subunidades β al DNA
Pinzas que forman una rueda
sobre el DNA y aseguran
óptima procesividad
Núcleo de
la
polimerasa
Abrazadera
complejo γ
proteínas β
Pinza rodante
La DNA pol III es altamente
procesiva gracias a las
subunidades β
Subunidades de la DNA polimerasa III de E. coli
Sub
α
# por
holoenzima
2
Mr
Función
132,000
Actividad polimerasa
ε
2
27,000
Exonucleasa 3’→
→5’
θ
2
10,000
Se requiere para la union de
DnaB
τ
2
71,000
Unión estable al molde,
dimerización del núcleo
γ
2
52,000
δ
1
35,000
δ’
1
33,000
χ
1
15,000
ψ
1
12,000
β
4
37,000
Abrazadera que carga las
subunidades β al DNA
Pinzas que forman una rueda
sobre el DNA y aseguran
óptima procesividad
Núcleo de
la
polimerasa
Modelo del
dímero
Función en la horquilla de replicación
La DNA pol III es la que replica las dos hebras a la
vez
Corrige errores con actividad exonucleasa 3’→
→5’
La replicación de la hebra retrasada se interrumpe
cada 1000 nt approx
DNA polimerasa I
La DNA pol I rellena los
espacios entre fragmentos
de Okazaki
Utiliza actividad
exonucleasa 5’→
→3’ para
eliminar cebador de RNA
Función de la DNA polimerasa I en la replicación
Función de la DNA ligasa en la replicación
1. Formación del
intermediario
Enzima ATP
2. Transferencia
del adenilo al 5’-P
3. Formación
del enlace
fosfodiéster
La DNA ligasa de E. coli es una enzima de 75 kDa. Es muy lábil
TERMINACIÓN DE LA REPLICACIÓN EN
PROCARIONTES
Las dos horquillas de
replicación se aproximan a la
misma región que contiene
las cajas Ter. Son secuencias
de 22 pb, tambien llamados
sitios de terminación. Están
presentes en tandem (seis)
en forma invertida.
A estas secuencias se unen
las proteínas TUS (TBP).
La presencia de estas
proteínas de unión a DNA
causa que se detenga el
avance de las horquillas.
Tus: termination utilization
substance TBP: Termination
binding protein. Proteína de 36
kDa que afecta la actividad de
la DNA helicasa (DnaB).
TERMINACIÓN. Desenrrollamiento y Síntesis
reparativa.
Las dos hebras duplex, productos de la
replicación están enrrolladas
La topoisomerasa IV contribuye a la
desnaturalización y descatenación de las
hebras. Mutantes en el gene de TopoIV
exhiben cromosomas que no se han
separado totalmente.
Ocurre síntesis reparativa para llenar los
huecos
DNA pol III
Cadena lider
Dna B
Topoisomerasa
Helicasa
RNA Primasa
Cebador
Cadena
retrasada
Fragmentos de
okasaki
DNA pol III
SSB
Cómo se asegura la célula que su DNA se
replica solo una vez?
Las enzimas Dam
metilasas regulan
el inicio en el
origen de
replicación
Los cromosomas eucariontes tienen múltiples
origenes de replicación
No todos los orígenes de replicación
se activan al mismo tiempo
REPLICACIÓN DE DNA EN EUCARIONTES
En eucariontes, la replicación comienza en muchos sitios a lo
largo de los cromosomas.
Los orígenes de replicación de metazoarios no están definidos por
una secuencia específica, como el oriC.
Sino que consisten en:
• Sitios de inicio de alta frecuencia
• Sitios de inicio de baja frecuencia
Los orígenes de replicación se establecen durante la fase G1 del
ciclo celular y dependen de mucho parámetros:
Estructura nuclear
Estructura de la cromatina
Secuencia de DNA
Modificaciones en el DNA
Permite modificar el número y localización de los orígenes de
replicación
DNA polimerasas en células eucariotas
Proliferating-Cell Nuclear Antigen (PCNA)
• PCNA es una proteína de 29
kDa.
• Forma un trímero alrededor del
DNA.
• Incrementa la procesividad de
la DNA pol delta hasta 40 veces.
•Se ha demostrado su interacción
in vitro con mas de 50 proteínas.
Entre ellas:
• Ciclina D1, cdk2 y el inhibidor
de cdks
Replicación del ADN:
en E. coli vs. en células humanas
Cantidad de DNA, pb/ cél.
E. coli
3.9 106
Cél humanas
109
Velocidad avance horquilla µm/min
30
3
Velocidad de replicación, nt / seg
850
60-90
Número de orígenes de replicación
/ célula
1
103-104
Tiempo 1 replicación genómica (hs)
0.27
8
Tiempo 1 división celular (hs)
0.33
24
Los orígenes de replicación más
estudiados son de levadura
Origen de replicació
replicación en eucariotas
Complejo prereplicativo
TERMINACIÓN EN EUCARIONTES
El dilema de los cromosomas lineales
Durante la terminación
en procariontes, hay
hidrólisis del cebador
pero el extremo 3’ de la
cadena funciona para
cebar la síntesis que así
completa la cadena.
Sin embargo, en los
cromosomas lineales de
eucariontes, después de
eliminar al cebador no hay
forma de completar la
síntesis.
Esto implica que los cromosomas se irían acortando después de
cada ronda de duplicación
TERMINACIÓN EN EUCARIONTES
El dilema de los cromosomas lineales. La Solución
Telomerasa. Enzima que adiciona
secuencias cortas que se repiten
en los extremos de los
cromosomas. Telómeros.
Las secuencias repetidas varían
entre especies:
Tetrahymena
TTGGGG
Humano
TTAGGG
Paramecium
TTGGGG
Trypanosoma
TTAGGG
Arabidopsis
TTTAGG
La telomerasa es una DNA polimerasa que utiliza RNA
como molde
La telomerasa está
compuesta por dos
subunidades:
• Subunidad catalítica
(proteína)
• Subunidad de RNA
asociada
Funciona como molde
para elongación de
una de las cadenas.
Mecanismo de acción de la telomerasa
Mecanismo de acción de la telomerasa
El resultado:
La telomerasa está presente en
células embrionarias, pero en
células somáticas su actividad es
muy baja.
Topología del DNA
• Tiene implicaciones en los procesos de
Replicación, Recombinación y Reparación
La replicación
causa
superenrollamiento
La replicación causa
superenrollamiento
DNA duplex
parental
relajado
DNA
circular
Replicación
Región
superenrollada
Las proteínas DnaB y DNA Girasa
resuelven el problema
Proteína
DnaB
DNA Girasa
Las topoisomerasas
Las topoisomerasas
Tipo I
cortan 1 sola hebra
Las topoisomerasas
Tipo II
cortan las 2 hebras
Topoisomerasa IV
Girasa
Topoisomerasa IV
participa en la
terminación de la
replicación de
moléculas circulares.
Decatenación
Acción de las Topoisomerasas durante la
recombinación
Topoisomerasa I
En Eucariotes, durante la
replicación hay modificaciones
en los octámeros de histona
Las Histonas parentales se
distribuyen
proporcionalmente entre
las nuevas cadenas.
El patrón de nucleosomas se hereda a
las cadenas hijas