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UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA
FACULTAD DE VETERINARIA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA Y SANIDAD ANIMAL
UNIDAD DE PARASITOLOGÍA Y ENFERMEDADES PARASITARIAS
REGULACIÓN DE LA INDUCCIÓN DE ARGINASA EN
LEISHMANIOSIS EXPERIMENTAL MURINA Y SU PAPEL EN LA
INFECCIÓN IN VITRO E IN VIVO POR Leishmania spp.
VIRGINIA INIESTA OROZCO
CÁCERES, 2003
Edita: Universidad de Extremadura
Servicio de Publicaciones
c/ Pizarro, 8
Cáceres 10071
Correo e.: [email protected]
http://www.pcid.es/public.htm
UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA
FACULTAD DE VETERINARIA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA Y SANIDAD ANIMAL
UNIDAD DE PARASITOLOGÍA Y ENFERMEDADES PARASITARIAS
REGULACIÓN DE LA INDUCCIÓN DE ARGINASA EN LEISHMANIOSIS
EXPERIMENTAL MURINA Y SU PAPEL EN LA INFECCIÓN IN VITRO E IN
VIVO POR Leishmania spp.
Vº Bº
Los Directores
Prof. Dra. Inés Mª Corraliza Generelo
Prof. Dr. Luis Carlos Gómez Nieto
Memoria de presentada por la Licenciada en Veterinaria
Virginia Iniesta Orozco para optar al grado de Doctor.
INÉS Mª CORRALIZA GENERELO, Profesora Asociada de Bioquímica, del
Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Genética, y LUIS CARLOS GÓMEZ
NIETO, Profesor Titular de Parasitología y Enfermedades Parasitarias, del Departamento
de Medicina y Sanidad Animal, ambos de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de
Extremadura
INFORMAN
Que la licenciada en Veterinaria VIRGINIA INIESTA OROZCO ha realizado en esta
Unidad, bajo nuestra dirección, el presente trabajo de investigación titulado “Regulación
de la inducción de arginasa en leishmaniosis experimental murina y su papel en la
infección in vitro e in vivo por Leishmania spp.”, con el que opta al título de Doctor en
Veterinaria.
Que en todo momento ha demostrado gran rigor científico en el desarrollo de esta
memoria, utilizando todos los medios puestos a su alcance para la consecución de los
objetivos marcados.
Por todo lo cual, y para que conste en su memoria de Doctorado, firmamos el presente
informe en Cáceres, a 6 de Junio de 2003.
Vº Bº
Los Directores
Prof. Dra. Inés Mª Corraliza Generelo
Prof. Dr. Luis Carlos Gómez Nieto
A mis padres, por enseñarme a ser feliz;
y a Miguel, por compartir su felicidad conmigo.
ÍNDICE
RESULTADOS
Ratón de la cepa resistente C57BL/6.
ÍNDICE
ÍNDICE
1.-INTRODUCCIÓN ..........................................................................................................3
Objetivos del trabajo ....................................................................................................................5
2.-REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .....................................................................................9
2.1. Parásito ..........................................................................................................................9
2.1.1. Ciclo biológico .........................................................................................................................9
2.1.2. Clasificación de las especies de Leishmania .......................................................................12
2.2. Patogénesis de la leishmaniosis .........................................................................................14
2.2.1. Formas clínicas..................................................................................................................... 14
2.2.2. Respuesta inmune frente a Leishmania ............................................................................ 16
2.2.2.1. Respuesta immune humoral ..........................................................................................16
2.2.2.2. Respuesta immune celular .............................................................................................20
2.2.2.2.1. Linfocitos ..............................................................................................................21
2.2.2.2.1.1. Linfocitos Th (CD4+) ..................................................................................21
2.2.2.2.1.2. Linfocitos Tc (CD8+) ...................................................................................23
2.2.2.2.2. Células NK ............................................................................................................23
2.2.2.2.3. Células dendríticas ................................................................................................24
2.2.2.2.4. Macrófagos ...........................................................................................................25
2.2.2.2.4.1. Generalidades...............................................................................................25
2.2.2.2.4.1.1. Funciones generales.............................................................................25
2.2.2.2.4.1.2. Mecanismos de activación ..................................................................27
2.2.2.2.4.2. El macrófago en infecciones por Leishmania .........................................30
2.2.3. Susceptibilidad y resistencia a la infección por Leishmania ............................................ 32
2.2.3.1. Modelo L. major /ratón ..................................................................................................32
2.2.3.1.1. Susceptibilidad y respuesta Th2 ........................................................................35
2.2.3.1.2. Importancia de la respuesta de IL-12 ...............................................................38
2.2.3.1.3. Desarrollo de las células Th1 y resistencia ........................................................39
2.2.3.1.4. Moléculas efectoras implicadas en la resistencia adquirida ..............................40
2.2.3.2. Modelos de leishmaniosis visceral murina (L. infantum - L. donovani)......................41
I
ÍNDICE
2.3. La enzima arginasa y su implicación en el sistema inmune ...................................42
2.3.1. Metabolismo de la L-arginina en mamíferos ...............................................................42
2.3.2. Regulación del metabolismo de la arginina en macrófagos ........................................43
2.3.2.1. Vía de la Óxido Nítrico Sintasa inducible (iNOS) ....................................................43
2.3.2.2. Vía de la Arginasa .....................................................................................................45
2.3.3. Papel de la arginasa en la respuesta inmune ................................................................48
3.-MATERIAL Y MÉTODOS .........................................................................................55
3.1. MATERIAL ................................................................................................................55
3.1.1. Material biológico ....................................................................................................55
3.1.1.1. Ratones y células murinas .................................................................................55
3.1.1.2. Parásitos ............................................................................................................56
3.1.2. Medios de cultivo .....................................................................................................56
3.1.2.1. Medio de cultivo completo para macrófagos diferenciados ..............................56
3.1.2.2. Medio de cultivo condicionado .........................................................................56
3.1.2.3. Medio de cultivo para aislamiento de Leishmania ............................................57
3.1.2.4. Medio de cultivo para mantenimiento de Leishmania ......................................57
3.1.3. Tampones .................................................................................................................57
3.1.3.1. Tampón fosfato (PBS) .......................................................................................57
3.1.3.2. Tampón citrato-fosfato ......................................................................................58
3.1.3.3. Tampón Tris-HCl ..............................................................................................59
3.1.3.4. Tampón de la muestra para electroforesis .........................................................59
3.1.4. Reactivos, citoquinas y otros productos ................................................................60
3.1.5. Material de laboratorio ...........................................................................................61
3.1.6. Aparatos ...................................................................................................................62
3.1.7. Soporte informático ................................................................................................64
II
ÍNDICE
3.2. MÉTODOS ..................................................................................................................65
3.2.1. ESTUDIOS IN VITRO ............................................................................................65
3.2.1.1. Obtención de macrófagos derivados de médula ósea .............................................65
3.2.1.2. Cultivo y activación de macrófagos ......................................................................66
3.2.1.3. Cultivo de las especies de Leishmania ...................................................................67
3.2.1.4. Infección de los macrófagos con Leishmania ........................................................67
3.2.1.5. Preparación de los cultivos para observación microscópica ..................................68
3.2.1.6. Contaje de la parasitación celular ...........................................................................68
3.2.1.7. Medida de la actividad arginasa .............................................................................68
3.2.1.8. Cuantificación de nitritos .......................................................................................69
3.2.1.9. Determinación de proteínas ...................................................................................70
3.2.1.10. Análisis de la viabilidad celular ...........................................................................70
3.2.1.11. Western blotting ...................................................................................................71
3.2.2. ESTUDIOS IN VIVO ..............................................................................................72
3.2.2.1. Infección de ratones con Leishmania major........................................................72
3.2.2.2. Recogida y procesado de datos y muestras .......................................................72
3.2.2.2.1. In vivo ............................................................................................................72
3.2.2.2.1.1. Evolución de los signos clínicos.............................................................72
3.2.2.2.1.2. Extracción y procesado de sangre ..........................................................73
3.2.2.2.2 Post mortem ....................................................................................................73
3.2.2.2.2.1. Procesado de extremidades infectadas ...................................................73
3.2.2.3. Técnicas de inmunodiagnóstico ..........................................................................74
3.2.2.3.1 Análisis de la respuesta inmune humoral (Técnica ELISA) .....................74
3.2.2.3.1.1. Obtención de los antígenos para tapizado ..............................................74
3.2.2.3.1.2. Desarrollo de la técnica ..........................................................................75
3.2.2.3.2. Análisis de la respuesta inmune celular: detección de citoquinas ...........77
III
ÍNDICE
3.2.2.4. Técnicas histológicas ............................................................................................77
3.2.2.4.1. Tinción Hematoxilina-Eosina .........................................................................78
3.2.2.4.2. Tinción Tricrómico de Masson.......................................................................79
3.2.2.5. Análisis de la actividad enzimática arginasa en tejidos infectados ..................80
3.2.2.5.1. Medida en homogeneizado de tejidos por el micrométodo ............................80
3.2.2.5.2. Detección por técnicas inmunohistoquímicas ...............................................80
4.- RESULTADOS ............................................................................................................85
4.1. ESTUDIOS IN VITRO ...............................................................................................85
4.1.1. Regulación del metabolismo de la L-arginina en macrófagos infectados con
Leishmania spp: comparación entre cepas murinas susceptibles y resistentes
al parásito ................................................................................................................85
4.1.1.1. Efecto de la activación con citoquinas Th1 .......................................................86
4.1.1.2. Efecto de las citoquinas Th2 en la proliferación intracelular de los
parásitos...................................................................................................................89
4.1.1.2.1. Inducción con IL-4 ..................................................................................92
4.1.1.2.2. Inducción con IL-10 ..............................................................................94
4.1.1.2.3. Inducción con TGF-β ..............................................................................95
4.1.2. Determinación de la isoforma de arginasa inducida en macrófagos infectados ............97
4.1.3. Efecto de la L-ornitina y de putrescina macrófagos infectados ...................................98
4.1.4. Análisis de la inhibición de la arginasa y de la iNOS sobre la parasitación
celular.......................................................................................................................100
4.1.4.1. Inhibición de la arginasa .........................................................................100
4.1.4.2. Inhibición del NO....................................................................................111
4.1.5. Caracterización de la enzima arginasa presente en promastigotes de Leishmania.....114
IV
ÍNDICE
4.2. ESTUDIOS IN VIVO ...............................................................................................115
4.2.1. Análisis de los signos clínicos: evolución de la lesión..........................................115
4.2.2. Análisis de la respuesta inmune ...........................................................................117
4.2.2.1.Respuesta inmune humoral ...................................................................................117
5.2.2.1.1. Respuesta inmune humoral frente a Proteína total (PT) de L. major............117
5.2.2.1.2.Respuesta inmune humoral frente al antígeno KMP-11
de L. infantum.................................................................................................120
5.2.2.1.3. Respuesta inmune humoral frente a Proteína Quimera (PQ) de L.
infantum.........................................................................................................121
4.2.2.2. Respuesta inmune celular .....................................................................................123
4.2.2.2.1. Determinación de los niveles de IL-4 en suero ...................................123
4.2.2.2.2. Determinación de los niveles de IL-12 en suero .................................125
4.2.3. Cuantificación de la inducción de la arginasa en las lesiones ....................................126
4.2.4. Estudio anatomopatológico de las lesiones..........................................................127
5.2.4.1. Infección en ratones sensibles BALB/c.....................................................127
5.2.4.2. Infección en ratones resistentes C57BL/6.................................................132
5.2.4.3. Resumen del análisis histopatológico en ambas cepas..............................134
4.2.5. Estudio inmunohistoquímico de las lesiones para detección de arginasa ................135
5.2.5.1. Infección en ratones sensibles BALB/c.....................................................135
5.2.5.2. Infección en ratones resistentes C57BL/6.................................................138
5.2.5.3. Resumen del análisis inmunohistoquímico en ambas cepas......................141
5.-DISCUSIÓN.............................................................................................................145
5.1. ESTUDIOS IN VITRO .............................................................................................145
5.1.1. Regulación del metabolismo de la L-arginina en macrófagos infectados con
Leishmania spp: comparación entre cepas murinas susceptibles y resistentes al
parásito.....................................................................................................................145
V
ÍNDICE
5.1.2. La arginasa I es la isoforma inducida en macrófagos infectados activados con
citoquinas Th2............................................................................................................150
5.1.3. La adición exógena de L-ornitina y putrescina favorece el crecimiento de amastigotes
intracelulares.........................................................................................................................150
5.1.4. La inhibición de la arginasa reduce la proliferación de Leishmania spp.............................151
5.2. ESTUDIOS IN VIVO ...............................................................................................158
5.2.1. Descripción de los signos clínicos y de las lesiones anatomopatológicas ............158
5.2.2. Evolución de la respuesta inmune humoral ...........................................................160
5.2.3. Influencia de la IL-4 e IL-12 en la progresión de la enfermedad ...........................166
5.2.4. Análisis de la inducción de la arginasa en las lesiones ..........................................169
6.- CONCLUSIONES.......................................................................................................177
7.- RESUMEN ..................................................................................................................181
8.- SUMMARY.................................................................................................................187
9.- BIBLIOGRAFÍA.........................................................................................................193
10.- LISTADO DE ABREVIATURAS...........................................................................237
11.- INDICE DE TABLAS Y FIGURAS ......................................................................243
12.- PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS.................................................251
13.- AGRADECIMIENTOS ...........................................................................................255
VI
1.
INTRODUCCIÓN
1.
Promastigotes en cultivo.
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
1.- INTRODUCCIÓN
La leishmaniosis es una enfermedad parasitaria producida por protozoos flagelados
pertenecientes al género Leishmania. Estos parásitos afectan a numerosas especies de
mamíferos incluido el hombre, siendo sus reservorios principales el perro y algunos
roedores. Su transmisión en la naturaleza se debe a la picadura infectante de un insecto
vector, el flebotomo. En el caso del hombre, las leishmaniosis corresponden a un grupo de
enfermedades que presentan diferentes formas clínicas: la leishmaniosis visceral (LV) o
“kala-azar”, las leishmaniosis cutáneas localizadas (LCL o“botón de oriente”) o difusas
(LCD) y la leishmaniosis mucocutánea (LMC) (Dedet, 1995).
Estas enfermedades están presentes en cuatro de los cinco continentes, afectando a la
población de 88 países del mundo, 72 de los cuales son subdesarrollados o en vías de
desarrollo. La incidencia anual mundial de la leishmaniosis, comprendiendo todas sus
formas clínicas, está estimada entre millón y medio y 2 millones de casos (Desjeux, 1999)
siendo la prevalencia de unos 12 millones, y 350 los millones de personas que están en
riesgo de contraer la infección. Sólo de leishmaniosis visceral se estiman entre 75.000 y
80.000 fallecimientos al año, considerándose, por su repercusión mundial, como una de las
tres enfermedades parasitarias englobadas en la Categoría I (emergentes e incontroladas).
Desde el año 1976 la OMS la incluye en el Programa Especial PNUD/Banco Mundial/OMS
de Investigación y Enseñanza de las Enfermedades Tropicales.
El parásito, una vez se encuentra en el hospedador definitivo, se multiplica en las células
fagocíticas de la médula ósea, hígado, bazo, pulmón, piel, etc., condicionando la
degeneración y destrucción tisular, y provocando la consiguiente reacción inflamatoria y
alteración funcional de los órganos afectados. Además existen alteraciones inmunitarias que
afectan principalmente al número y función de las distintas subpoblaciones linfocitarias.
Los macrófagos, principales células hospedadoras de Leishmania, juegan un papel muy
destacado en la defensa del hospedador contra la invasión por una amplia variedad de
3
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
microorganismos, a los que destruyen mediante un proceso de fagocitosis y posterior lisis
intracelular. Además de poseer estas propiedades fagocíticas, desempeñan una importante
función como células presentadoras antígenos, intervienen en la activación de células T y
participan en la secreción de diversas sustancias, entre las que destacan las citoquinas por su
relevancia en el control de la respuesta inmune.
En el macrófago, el estado funcional y la capacidad para desarrollar una función efectora
vienen determinados en gran parte por el metabolismo de la L-arginina. Este aminoácido
puede metabolizarse en macrófagos por dos vías principales: la de la Óxido Nítrico Sintasa
Inducible (iNOS), que da lugar a la síntesis de Óxido Nítrico (NO) y citrulina, con un efecto
citostático y de inhibición de la proliferación de ciertos microrganismos intracelulares; y por
otra parte la vía de la Arginasa I, cuya función en los macrófagos no ha sido bien definida
hasta el momento. Esta enzima es conocida principalmente porque cataliza la última etapa
del ciclo de la urea en el hígado, hidrolizando la L-arginina a L-ornitina y urea. La
producción de esta sustancia es una forma de excrección de iones amonio derivados del
catabolismo de aminoácidos. El otro producto de la reacción, la ornitina, es un precursor de
la síntesis de aminoácidos como prolina y ácido glutámico así como de poliaminas, las
cuales juegan un papel importante en la división y diferenciación celulares.
El balance entre las dos enzimas (iNOS/Arginasa) en el macrófago es regulado
competitivamente por los linfocitos Th1 y Th2 a través de la secrección de citoquinas. Así,
una respuesta Th1 promueve la activación de la iNOS, mientras que una respuesta Th2
induce a la Arginasa I. Además, la inducción de cada una de estas enzimas va acompañada
de la supresión de la otra, lo cual es indicativo de dos estados competitivos en estas células.
En el presente trabajo nos proponemos analizar en profundidad el papel que desempeña
la inducción de la enzima Arginasa I en la capacidad defensiva de los macrófagos. Para ello
hemos tomado un modelo vivo de infección de estas células como es el protozoo
Leishmania, marcándonos en el estudio los siguientes objetivos:
4
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
OBJETIVOS DEL TRABAJO
1.- Estudio de la inducción de la Arginasa I en macrófagos infectados con las especies
Leishmania infantum y Leishmania major. Para ello se realizarán ensayos de activación
la enzima con citoquinas tipo Th2, y posteriormente se analizarán los parámetros de
infección con el parásito.
2.- Regulación de la infección vía inducción de la enzima Óxido Nítrico Sintasa inducible
(iNOS) con citoquinas activadoras e inhibidoras de esta ruta. Repercusión del
metabolismo del Óxido Nítrico (NO), producto de la reacción, sobre la supervivencia
de los parásitos.
3.- Ensayo de inhibidores enzimáticos de ambas rutas (Arginasa/iNOS) sobre la infección
in vitro de macrófagos con las dos especies de Leishmania.
4.- Análisis de la infección in vivo en ratones susceptibles (BALB/c) y resistentes
(C57BL/6) a la infección por Leishmania, con el fin de conocer el papel de la inducción
de la Arginasa y su relación con la sensibilidad/ resistencia a la enfermedad. Se
determinará en ambos casos la evolución de la infección, analizando tanto los cambios
patológicos como el desarrollo de la respuesta inmune humoral y celular. Para ello se
llevará a cabo un estudio seriado en el tiempo, determinando las subclases de IgG
frente a distintos antígenos del parásito a lo largo del curso de la enfermedad, y
relacionando esta respuesta con la inducción de citoquinas Th1 y Th2, así como
determinando la actividad de la arginasa I y las alteraciones histopatológicas de los
tejidos infectados.
5
2.
REVISIÓN
BIBLIOGRÁFICA
Cultivo de macrófagos infectados con Leishmania infantum.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.-REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. PARÁSITO
Los protozoos del género Leishmania son parásitos intracelulares que viven y se
multiplican en los macrófagos de mamíferos. Se transmiten por la picadura de un mosquito
de la subfamilia Phlebotominae, y son los causantes de una amplia gama de enfermedades
humanas y animales, que van desde situaciones que autocuran a múltiples formas
localizadas y diseminadas de la enfermedad.
2.1.1. Ciclo biológico
El ciclo de vida del parásito Leishmania es asexual y heteroxeno, es decir, tiene lugar en
dos hospedadores diferentes: uno intermediario (mosquito flebotomo), que actúa como
vector, y uno definitivo, que es un vertebrado casi siempre mamífero (roedores, cánidos y
hombre, principalmente).
A lo largo de su ciclo vital, el parásito presenta distintos tipos morfológicos que se
caracterizan por la posición relativa del kinetoplasto respecto al núcleo (Hoare y Wallace,
1966). Así, podemos encontrar en este género la forma promastigote en el intestino del
mosquito, caracterizándose morfológicamente por tener forma de huso y presentar un
flagelo en uno de sus extremos. El resto del ciclo se completa en los tejidos del mamífero,
donde se encuentra la forma amastigote, que carece de flagelo visible y tiene aspecto
redondeado.
El ciclo se inicia cuando el insecto vector ingiere, con su picadura, formas amastigote
de la piel del hospedador vertebrado. Los amastigotes se liberan en el intestino del
mosquito y se transforman en promastigotes. Estos, en su primera fase (estadio procíclico)
no son infectivos, tienen capacidad de dividirse y una alta adherencia a las células
epiteliales del tramo medio del tubo intestinal del insecto (Sacks y col., 1995). A partir de
los promastigotes procíclicos se desarrollan las formas maduras o promastigotes
9
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
metacíclicos (estadio infectivo), sin capacidad de dividirse, que muestran muy poca
adherencia a las células epiteliales (Lawyer y col., 1990), lo que les permite migrar a la
trompa del mosquito (Changa y col., 1985 y Evans, 1993). Otros cambios que ocurren en
el paso de forma procíclica a estadío metacíclico infectivo es el desarrollo de una serie de
procesos que incrementan en la resistencia a los mecanismos microbicidas del hospedador.
Así, la superficie del promastigote se altera para evitar la inserción del complejo lítico
C5b-C9 de ataque a la membrana o MAC del complemento sérico (Puentes y col., 1990).
Esto se correlaciona con la expresión de un lipofosfoglicano (LPG) modificado, que puede
actuar como una barrera para la inserción del MAC en la superficie del parásito (Mc
Conville y col., 1992). Otro cambio que ocurre durante el desarrollo de las formas
metacíclicas es la síntesis incrementada de la proteína de superficie gp63, la cual puede
cortar la C3b del complemento a la forma inactiva C3bi, y así prevenir la deposición del
complejo lítico C5b-C9 (Brittingham y col., 1995). Estudios recientes han concluído que
LPG y gp63 son factores de virulencia, ya que cepas mutantes de L. major que no expresan
estas moléculas son más sensibles a la lisis mediada por complemento y muestran una
virulencia reducida en ratones BALB/c (Spath y col., 2000; Joshi y col., 2002).
Cuando el insecto vector pica al mamífero, las formas metacíclicas son liberadas en el
punto de inoculación y están transitoriamente expuestas a los componentes potencialmente
letales del suero. En ese momento se enfrentan a moléculas del complemento, anticuerpos
y células fagocíticas, que van a ser capaces de eliminar hasta el 80% de los parásitos
inoculados en la picadura (Lewis y Peters, 1997). Sin embargo, un porcentaje de los
promastigotes evade la lisis mediada por complemento, usando la activación de éste como
mecanismo para alcanzar la célula hospedadora. Así, éstos inactivan la forma C3b y ésta
pasa C3bi, la cual opsoniza los parásitos para la fagocitosis a través de los receptores del
complemento CR3 y CR1,
dirigiendo al parásito su célula hospedadora (Mosser y
Edelson, 1985).
Como los promastigotes carecen de la maquinaria necesaria para la invasión activa de
10
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
las células, están limitados a la acción de los fagocitos profesionales (principalmente
macrófagos y células dendríticas), con algunas excepciones como fibroblastos y neutrófilos
(Rittig y Bodgan, 2000). El reconocimiento entre éstos y los parásitos está mediado por
varios receptores de membrana (Handman, 1999). Una vez reconocidos, los promastigotes
son internalizados y se localizan en los fagolisosomas. Dentro de ellos se transforman en
amastigotes, y se mantienen y replican con esta forma en el interior del hospedador. Para
sobrevivir a los mecanismos potencialmente destructivos de los que está equipado el
macrófago (radicales del oxígeno, óxido nítrico, enzimas lisosomales...), los amastigotes de
Leishmania deben defenderse mediante factores que inhiban o reduzcan el impacto de los
mismos (Wright y El Amin, 1989). Si los parásitos no son controlados por el macrófago,
los amastigotes se reproducen dentro de él, rompen la célula y se diseminan por todo el
sistema mononuclear fagocítico, causando los síntomas y patología asociados a la
enfermedad. El ciclo se completa cuando un mosquito no infectado ingiere macrófagos de
un hospedador vertebrado con amastigotes intracitoplasmáticos.
Así, el ciclo biológico de Leishmania puede resumirse en un paso alternado del parásito
de un mamífero a otro por la picadura de un flebotomo vector. En realidad, este esquema
general se compone de mecanismos de interacción parásito/hospedador de gran
complejidad.
11
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1.2. Clasificación de las especies de Leishmania
Todas las especies del género Leishmania son en la práctica indistinguibles desde el
punto de vista morfológico y estructural, en cualquiera que sea su estado, promastigote o
amastigote. Ello ha dado lugar a que se hayan desarrollado numerosos sistemas de
identificación a lo largo del tiempo. Los primeros estuvieron tradicionalmente basados en
criterios poco fiables, como el aspecto clínico o la distribución geográfica. Más tarde se
propusieron distintas clasificaciones atendiendo al comportamiento tanto en cultivo como
en animales de laboratorio o vectores, igualmente poco satisfactorias.
Posteriormente se llevaron a cabo intensos estudios sobre quimiotaxonomía en este
parásito (Gardener y col., 1974), lo que llevó a la clasificación que es aceptada actualmente
por la mayoría de los autores: la electroforesis de isoenzimas. Ésta constituye hoy en día la
técnica de referencia para la clasificación automática de género y la identificación a nivel
específico o infraespecífico. Está basada en la determinación de los perfiles enzimáticos de
las distintas cepas; así, los parásitos de la misma especie que poseen idéntico patrón
enzimático pertenecen al mismo zimodema (Lumsden, 1977), denominado con el acrónimo
“MON” según la nomenclatura aceptada (Chance, 1982, 1986).
Tras la creación del género Leishmania por Ross en 1903, el número de especies
descritas no cesa de crecer. La organización sistemática éstas ha originado clasificaciones
regularmente revisadas y corregidas (Pratlong y Lanotte, 1999). En la práctica, el género
Leishmania está dividido en dos subgéneros:
•
Leishmania sensu stricto, presente en el Viejo y el Nuevo Mundo
•
Viannia, subgénero del Nuevo Mundo
De esta forma, y basándose en la caracterización de isoenzimas (Dedet, 1993; Rioux y
col., 1990, Thomaz-Soccol y col., 1993), la clasificación más reciente del género
Leishmania queda reflejada en el siguiente cuadro (Tabla 1):
12
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
SUBGÉNERO
Leishmania
(Ross, 1903)
ESPECIES
L. donovani, L. archibaldi
L. infantum (syn. L. chagasi)
L. tropica
L. killicki
L. major
L. gerbilli
L. mexicana (syn. L. pifanoi)
L. amazonensis (syn. L. garnhami), L. aristidesi
L. enrietti
L. hertigi, L. deanei
L. turanica*
L. venezuelensis*
L. braziliensis
L. peruviana
L. guyanensis, L. panamensis, L. shawi
Viannia
L. lainsoni
(Lainson y Shaw, 1987) L. naiffi
L. colombiensis*
L. equatorensis*
* Especies sometidas a reclasificación
Tabla 1: Clasificación del género Leishmania, basada en la electroforesis de isoenzimas (adaptada
de Alvar, 2001).
Los últimos avances están permitiendo el desarrollo de métodos de caracterización
intrínsecos aún más precisos, basados en el análisis del propio genotipo del parásito
mediante sondas de DNA y amplificación del genoma. Estas técnicas tienen la ventaja de
que actúan sobre un material que permanece invariable a lo largo de la vida del parásito, y
que es independiente de los cambios morfológicos del protozoo a lo largo de su ciclo
biológico y ajeno a la respuesta inmune del hospedador.
13
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2. PATOGÉNESIS DE LA LEISHMANIOSIS
2.2.1. FORMAS CLÍNICAS
La inoculación intradérmica de promastigotes metacíclicos de Leishmania induce, en el
sitio mismo de la picadura, una lesión que pasa generalmente desapercibida en el hombre,
pero que está bien descrita en el perro (Vidor y col., 1991).
Tras la multiplicación intracelular de amastigotes localizados en los macrófagos y las
células dendríticas en el sitio de inoculación, las reacciones celulares generadas y las
diversas citoquinas producidas dan lugar al desarrollo de una lesión cutánea localizada
(LCL). A partir de ahí, los parásitos pueden ser transportados a los ganglios linfáticos de
drenaje y difundirse a distintas zonas de la piel, dando lugar a una leishmaniosis cutánea
difusa (LCD) o a las mucosas de la cara, originando una leishmaniosis mucocutánea
(LMC). En otros casos, los parásitos se extienden a todos los órganos del sistema
mononuclear fagocítico, provocando una leishmaniosis visceral (LV).
De esta manera, la expresión clínica de las leishmaniosis depende de la localización del
parásito en los tegumentos o en otros órganos profundos del sujeto, lo cual está
directamente ligado al tropismo de la especie de Leishmania causante. A nivel práctico, las
leishmanias pueden ser agrupadas según su tropismo en tres grandes bloques (Tabla 2).
TROPISMO
ESPECIES
Visceral
L. donovani, L. infantum
Dérmico
Mucutáneo
L. major, L. tropica, L. killicki,, L. mexicana L. amazonensis,
L. peruviana, L. guyanensis, L. naiffi, L. lainsoni, etc.
L. braziliensis, L. panamensis
Tabla 2: Tropismo habitual de las especies de Leishmania (adaptada de Dedet, 2000).
14
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Sin embargo, este tropismo por un determinado órgano no es absoluto. Por ejemplo, en
el
caso
de
las
especies
indudablemente
viscerotropas,
existen
excepciones
independientemente del estado inmunitario del individuo, donde la población del parásito
causa lesiones cutáneas localizadas sin signo de alteración visceral. En el caso de la
especie L. infantum, por ejemplo, el zimodema MON-1 es claramente responsable de la
leishmaniosis visceral en la Cuenca Mediterránea, no sólo en el hombre sino también en el
perro. Pero el mismo zimodema puede provocar más raramente la leishmaniosis cutánea
localizada (Rioux, 1985). Otros zimodemas de L. infantum, como el MON-11, MON-24,
MON-29, MON-33 y MON-78, son calificados de dermotrópicos por ser responsables de
leishmaniosis cutánea localizada en pacientes inmunocompetentes (Pratlong, 1989;
Gallego y col., 2001).
En los modelos experimentales murinos de infección con L. major, también se ha
comprobado que la subcepa de Leishmania utilizada influye determinantemente en el
desarrollo de la enfermedad (Noben-Trauth y col., 1999), así como el tiempo que las
formas promastigote permanezcan en cultivo o el número de pases rutinarios en el mismo,
ya que largos periodos o elevado número de pases provocan que estas cepas puedan sufrir
variaciones espontáneas. Las más usadas en los ensayos laboratoriales pueden derivar de
aislados humanos o de roedores, y se clasifican generalmente en cuanto a su origen
geográfico. Algunas de las más comunes que se utilizan en el modelo murino son Friedin
(Jordan Valley, WHOM/IL/80/FN), IR173 (Irán, WHOM/IR/-173), LV39/Neal (Sur de
Rusia, MRHO/SU/59/P), NIH/Seidman (Oeste de África, MHOM/SN/74/S), World Health
Organization reference strain 5-ASKH (Turmenskaya, MHOM/SU/73/5-ASKH) y CC-1
(Irán, MHOM/IR/83/LT52).
Tras todos estos datos, se puede concluir que las formas clínicas de leishmaniosis
dependen fundamentalmente de dos factores: las características genéticas de los parásitos y
el estado inmunitario de los sujetos infectados.
15
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2.2. RESPUESTA INMUNE FRENTE A Leishmania
En la leishmaniosis destaca la importancia y complejidad de la respuesta inmunitaria del
hospedador frente al parásito. Aparecen procesos inmunológicos diferentes, tanto
humorales como celulares, y se observa también un amplio espectro de desórdenes y
alteraciones inmunitarias (Carvalho y col.; 1987).
Esta respuesta inmune se descubrió desde los primeros momentos en que se estudió la
enfermedad, y ha sido revisada en numerosas ocasiones (Maüel y Behin, 1981; Pearson y
col., 1983; Behin y Louis., 1984; Howard, 1985 y Liew y O´Donnel, 1993).
2.2.2.1. Respuesta inmune humoral
El tipo de respuesta humoral depende de la especie parásita y la forma de leishmaniosis.
En las formas viscerales se observa una elevada respuesta de anticuerpos, con altos niveles
de inmunoglobulinas y complejos inmunes circulantes (Liew y O´Donell, 1993), mientras
que en las afecciones cutáneas los títulos de anticuerpos séricos son normalmente bajos y
directamente relacionados con la gravedad del proceso (Howard, 1985; Liew y O´Donell,
1993).
La producción de anticuerpos específicos anti-Leishmania está determinada por la
sensibilización y activación de los linfocitos B, observándose, desde las primeras fases de
la infección, células plasmáticas productoras de anticuerpos en distintos órganos
(Moriearty y col., 1982; Ridley y Ridley, 1983). Diversas experiencias han demostrado que
esa activación en la leishmaniosis visceral se produce como una estimulación policlonal de
las células B (Ghose y col., 1980; Bunn-Moreno y col., 1985), que conduce a una elevada
producción de inmunoglobulinas específicas e inespecíficas. Parte de las imunoglobulinas
inespecíficas que aparecen son anticuerpos frente a ácidos nucleicos, tubulinas y factores
reumatoides (Carvalho y col., 1983; Galvao-Castro y col., 1984). Analizando los
anticuerpos específicos, se comprueba su reactividad frente a distintos componentes
16
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
antigénicos del parásito (Ray y Ghose, 1986; Santos y col., 1987).
En este sentido, cabe destacar la respuesta humoral detectable frente a distintos
antígenos recombinantes de Leishmania. En concreto, y para el caso de L. infantum,
señalaremos la Proteína Quimera (PQ). Se trata de un péptido de 38 KDa de peso
molecular con un punto isoeléctrico de 7.37,
constituido por diversos determinantes
antigénicos de distintos antígenos de L. infantum. Los epítopos seleccionados derivan de
las proteínas ribosomales LiP2a, LiP2b, LiP0 y de la histona H2A (Soto y col, 1998).
Todos los componentes antigénicos de la proteína Q son, por separado, reconocidos por un
alto porcentaje de sueros caninos provenientes de animales con leishmaniosis visceral
(Soto y col, 1995b). Esto hace de la PQ una molécula muy específica y apropiada para el
serodiagnóstico de la leishmaniosis visceral canina (Soto y col., 2002) fundamentalmente
dirigida al diagnóstico de la patología inducida por la infección, ya que varios de sus
componentes inducen inmunocomplejos y se depositan en tejidos como riñón, bazo e
hígado (Molano y col., 2003).
Otra proteína recombinante que debe ser mencionada es la Kinetoplastid Membrane
Protein o KMP-11, que ha sido utilizada con éxito en ensayos de protección frente al
protozoo Trypanosoma cruzi en ratones (Planelles y col., 2001). El análisis de su
antigenicidad ha sido llevado a cabo por varios autores y para distintos tipos de
leishmaniosis. En este sentido, se ha visto que la respuesta frente a KMP-11 en infecciones
experimentales con L. infantum en el modelo hámster (Mesocricetus auratus) muestra un
cierta asociación con el desarrollo de la infección (Requena y col., 2000), siendo
reconocida sólo por los sueros de hámsters que no mostraron ningún signo externo de
enfermedad hasta el final del estudio. Otros ensayos, llevados a cabo por Berberich y col.
en 1997, demuestran que este antígeno de L. infantum es reconocido por un 96% de perros
con leishmaniosis visceral, aunque se observa una gran variabilidad en la respuesta inmune
17
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
entre los diferentes animales. Más tarde se demostró de forma experimental en perro (Nieto
y col., 1999) que la proteína KMP-11 desarrolla una respuesta de anticuerpos de forma
muy precoz -a las pocas semanas de producirse la infección-, existiendo casos de
seroconversión en animales que no desarrollan la enfermedad. La alta reactividad que
aparece en el suero de algunos de los perros sugiere que la proteína puede también actuar
como un potente inmunógeno de células B durante la LV natural. Por otra parte, ensayos
realizados con sueros humanos (Berberich y col., 1997), indicaron que el 70% de los
sueros humanos con LV también reconocieron esta proteína, mostrando algunos de ellos
niveles muy elevados de anticuerpos anti-KMP-11. Esto apunta a que la KMP-11 puede
ser un buen marcador de infección, que complemente a otros antígenos específicos en tests
serológicos para LV tanto en humanos como en perros. Por el contrario, y para el caso de
L. braziliensis (Carmelo y col., 2002), el reconocimiento de la KMP-11 recombinante por
parte de los sueros de enfermos con LC y LMC es bajo, de acuerdo con la escasa respuesta
humoral que presentan estos pacientes.
La respuesta humoral frente a Leishmania está constituida básicamente por IgG, con
una pequeña proporción de IgM y en ocasiones de IgA (Ghose y col., 1980). Los niveles
de IgG circulantes se corresponden, por lo general, con la intensidad de la infección
(Morsy y col., 1987, Mimory y col., 1987), reflejando el grado y la duración de la
estimulación antigénica determinada por la carga parasitaria (Howard, 1985). De cualquier
forma se detectan, por gran variedad de técnicas serológicas, elevados títulos de
anticuerpos específicos (Martínez-Moreno, 1991; Nieto y col., 1992). En la leishmaniosis
visceral, el subtipo IgG2a -asociado a una respuesta Th1 (Germann y col, 1995)- es
mayoritario, aunque otros subtipos como la IgG1 (propio de un respuesta Th2) están
aumentados (Deplazes y col., 1995). En los trabajos que se han llevado a cabo hasta ahora
para intentar esclarecer el papel de cada una de las subclases de IgG en la respuesta
específica anti-Leishmania (Elassad y col.; 1994, Ulrich y col., 1995; Deplazes y col.,
18
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
1995), los resultados son poco concluyentes.
Sin embargo, en estudios realizados en el modelo canino, con perros infectados tanto de
forma natural (Deplazes y col., 1995) como experimentalmente (Nieto y col., 1999), se
determinan que se produce una respuesta dual o dicotómica y se evidencia una correlación
entre los niveles de isotipos de IgG y la progresión de la enfermedad. Así, se observa que
la IgG1 es indetectable en animales regresivos u oligosintomaticos, mientras que es alta en
animales que desarrollan enfermedad activa. En estos mismos ensayos, se comprobó que la
aparición de anticuerpos anti-histonas estaba asociada a la progresión del estado de
infección al de enfermedad, y que el antígeno KMP-11 fue reconocido por el suero de
todos los perros infectados.
En el modelo de infección por L. major en ratón, existen dos cepas bien caracterizadas
de acuerdo a su susceptibilidad y resistencia: BALB/c y C57BL/6, respectivamente.
Honoré y colaboradores (1998) utilizaron estos dos modelos murinos para estudiar la
respuesta de IgG específica frente a la infección por L. infantum. En sus ensayos,
detectaron anticuerpos específicos frente a la Proteína Total soluble del parásito (PT) en
suero desde el día 22 post-infección en ambas cepas. En BALB/c,el isotipo predominante
fue la IgG1, cuya cinética corrió paralela a la de IgG total, mientras que los anticuerpos
IgG2a permanecieron indetectables. La respuesta de isotipos en C57BL/6, por el contrario,
se caracterizó por la producción de ambas IgG1 e IgG2a, cuya cinética fue paralela a la
respuesta de IgG total. Así, la distribución de anticuerpos muestra que la cepa BALB/c
tiene una respuesta predominantemente Th2, mientras que los ratones C57BL/6 presentan
una respuesta mixta Th1/Th2. Esta cinética de anticuerpos, en cambio, no ha sido
caracterizada aún en profundidad para el caso de la infección por L. major.
Se han demostrado diferentes mecanismos de actuación de estos anticuerpos. Por una
parte provocan la destrucción directa del parásito en conjunción con el complemento, al
19
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
unirse con las fracciones C3 y C5 a la membrana plasmática del parásito (DebonsGuillemin y col., 1986). También actúan como opsonizadores, promoviendo la fagocitosis
del parásito por macrófagos y neutrófilos (Reis y col., 1987) y su posterior destrucción
intracelular (Handman y Hocking, 1982; Madeira y col., 1985).
Aunque es innegable su papel en los mecanismos de acción contra el parásito, parece
ser que la función de los anticuerpos in vivo para promover protección es limitada (Howard
y col.,1987; Liew y O´Donell, 1993). Sin embargo, su presencia sí contribuye como
inmunomoduladora de la respuesta celular (Bourdeau, 1988). En este sentido, se ha
señalado una importante función de los linfocitos B sensibilizados, ya que intervienen en la
producción de linfocitos T, imprescindibles para la resolución del proceso como
mediadores de la respuesta inmune celular efectiva contra el parásito (Scott y col., 1986).
Los estudios sobre los mecanismos reguladores de la respuesta celular mediada por
anticuerpos, así como su participación en el control o patología de la enfermedad, son
todavía muy escasos, siendo necesarias, por tanto, nuevas investigaciones en este campo de
la inmunología.
2.2.2.2. Respuesta inmune celular
En la infección por Leishmania, una vez que los amastigotes se encuentran en el
interior de los macrófagos, la resolución de la infección depende predominantemente de
los mecanismos inmunes mediados por células (Pearson y col., 1983; Coutinho y col.,
1987; Kubba y col., 1988). La respuesta celular viene determinada por la acción conjunta
de macrófagos y células dendriticas, células Natural Killer (NK), células B, distintas
subpoblaciones de células T y las diferentes linfoquinas secretadas por todos ellos.
En humanos, la leishmaniosis visceral o kala-azar se caracteriza por una debilitada o
ausente respuesta celular, detectable tanto por la ausencia de hipersensibilidad retardada o
DTH (Turk y Bricesson, 1971), como por métodos de proliferación de células T incluso
frente a mitógenos como la concavalina A o fitohemaglutinina (Reiner y Finke, 1983;
20
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Martínez Moreno, 1991) e inhibición de la producción de IL-12 por parte de las células T
estimuladas (Reiner y Finke, 1983; Carvalho y col., 1985).
La respuesta inmune celular en la leishmaniosis cutánea es muy variable, pues va a
depender de su forma clínica de presentación. Así, en la más común o LCL, existe una
marcada respuesta mediada por células (Convit y col., 1993), detectable tanto in vivo
(pruebas de hipersensibilidad retardada o DTH) como in vitro. Sin embargo, en la LCD
aparece una anergia selectiva en la inmunidad celular (Convit y col., 1993; Castés y col.,
1988). Por último, la LMC se caracteriza por una exacerbada respuesta de base celular que
provoca lesiones destructivas (Convit y Pinardi, 1974; Castés y col., 1988).
2.2.2.2.1. Linfocitos
2.2.2.2.1.1. Linfocitos Th (CD4+)
En el modelo ratón, la población de linfocitos T (Fenotipo CD4+) es heterogénea y se
puede dividir al menos en dos subpoblaciones según las linfoquinas que producen
(Morsman y Coffman, 1987). Estas células, tal y como determinaron Liew y O´Donell en
1993, son esenciales en el desarrollo de inmunidad protectora de leishmaniosis cutánea
(subpoblación Th1), y al mismo tiempo pueden contribuir a la supresión de la misma
(subpoblación Th2), generando un modelo alternativo de respuesta favorable para
Leishmania.
Debido a que las subpoblaciones de células T CD4+ están implicadas en la resistencia
adquirida a L. major, su papel crucial en la infección ha sido un hallazgo consistente
(Belkaid y col., 2000). Así, los linfocitos T inducidos en ratones resistentes C57BL/6 o
ratones susceptibles BALB/c curados, son predominantemente del tipo Th1, mientras que
las células de BALB/c no curados son del tipo Th2 (Heinzel y col., 1991). En general, las
linfoquinas secretadas por estas células favorecen el desarrollo de la línea celular que las
produce y tienen un efecto antagónico en el desarrollo la subpoblación contraria (Reiner y
21
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Locksley, 1993). De esta manera, la IL-4 y la IL-10, producidas por las células Th2,
contribuyen a la progresión de la infección, favoreciendo el desarrollo de esta
subpoblación celular. Además, pueden actuar directamente sobre el macrófago impidiendo
su activación.
En ratones genéticamente resistentes, se ha observado que la ausencia de la expresión
de los genes para IFN-γ o su receptor (Swihart y col., 1995), CD40 o el ligando de CD40,
aumenta la susceptibilidad a la infección (Campbell y col., 1996; Kamanaka y col., 1996;
Soong y col., 1996). La interacción de CD40 y su ligando es necesaria para la producción
de IL-12. Esta citoquina, producida en estadíos tempranos de la infección, induce la
secreción de IFN-γ necesaria para dirigir la respuesta hacia el modo Th1. Los ratones con
una base genética resistente, que desarrollan una respuesta de este tipo, se transforman en
susceptibles si son deficientes en la expresión de IL-12, generando una respuesta Th2
(Mattner y col., 1996). Datos recientes sugieren también que la ausencia de IL-4 puede
evitar la respuesta Th2 (Guler y col., 1996).
Aunque en la leishmaniosis cutánea por L. major el papel de las subpoblaciones Th1
como protectora y Th2 como promotora de enfermedad parece bastante bien demostrado
(Liew y O´Donell, 1993), en la infección por L. donovani (leishmaniosis visceral) esta
relación no está tan claramente establecida (Kaye y col., 1991; Murray y col., 1992),
comprobándose que hay otras subpoblaciones de células T implicadas en el proceso (Liew
y O´Donnell, 1993), tales como los linfocitos T citotóxicos (CD8+). De todas maneras, las
investigaciones más recientes en el modelo L. major-ratón también están encaminadas
hacia el estudio del papel de otras células inmunes distintas de las CD4+ en la infección por
este parásito (Sacks y Noben-Trauth, 2002).
22
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2.2.2.1.2. Linfocitos Tc (CD8+)
Las células T citotóxicas producen IFN-γ y TNF-α (Fong y Mosmann, 1990; Muller y
col., 1994), importantes en la activación de los macrófagos para la destrucción de
Leishmania (Liew y Dhaliwal, 1987; Liew y col., 1990b). Además, se ha comprobado
recientemente que, cuando se retan ratones con L. major usando un sistema que reproduce
dos hechos clave de la infección natural (baja dosis e inoculación intradérmica), el
resultado de dicha infección en animales tratados con anticuerpos anti-CD8+ o deficientes
en estas células muestra que las T CD8+, además de las T CD4+, son necesarias para el
control de la infección primaria de L. major en la piel (Belkaid y col., 2002).
Estudios clínicos en humanos han demostrado que existe un gran número de células T
CD8+ específicas de antígeno en lesiones y sangre periférica, durante el estadío agudo de la
formación de la lesión y durante el proceso de curación (Da-Cruz y col., 1994; Gaafar y
col., 1999).
Aunque se asume que la principal función protectora de estos linfocitos en el caso de la
infección por L. major es contribuir a la liberación de IFN-γ en la dermis, la citolisis que
producen en células hospedadoras infectadas incapaces de lisar los parásitos, contribuye a
liberar éstos y hacerlos disponibles para ser captados por células que respondan mejor a las
señales de activación.
2.2.2.2.2. Células NK
Es ampliamente conocido que los eventos responsables de la resistencia o
susceptibilidad a Leishmania ocurren en los primeros estadíos de la infección, y parecen
implicar a los elementos de la respuesta inmune innata, la cual precede al desarrollo de una
respuesta específica de células Th1 y Th2 (Sypek y col., 1993). Las células NK, activadas
por la IL-12 procedente de macrófagos o células dendríticas, son la fuente principal de la
secrección temprana de IFN-γ. Esta citoquina no sólo juega un importante papel en
23
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
controlar la resistencia inicial en las infecciones por L. major, sino que también influye en
el inicio de la diferenciación hacia Th1 en ratones resistentes (Scharton-Kersten y col.,
1995) y puede optimizar la producción de IL-12 por las células dendríticas y la expresión
de IL-12R por las células T activadas.
En concreto, y para el caso de L. major, el rápido desarrollo de una respuesta Th1 y el
control temprano de la infección en los ratones C3H, se asocia con una respuesta temprana
de las células NK, mientras que ratones C57BL/6 y BALB/c que carecen de esta respuesta
precoz de células NK tienen un desarrollo tardío o ausente de respuesta Th1,
respectivamente (Scharton y Scott, 1993).
Está claro, sin embargo, que aunque una actividad precoz de estas células puede
influenciar la cinética de la respuesta Th1, estas células no se requieren en ultima instancia
para la resistencia (Liew y O´Donell, 1993), ya que ratones que carecen selectivamente de
células NK tienen una producción eficiente de IL-12 independiente de IFN-γ por las
células T CD4+ y curan sus lesiones (Wakil y col., 1998; Satoskar y col., 1999).
Por otra parte, las células NK pueden desarrollar un papel importante en la respuesta
contra la leishmaniosis visceral, ya que se piensa que contribuyen a la eliminación del
parásito en la fase de resistencia adquirida tras la infección de L. donovani en el ratón
(Kirkpatrick y col., 1985).
2.2.2.2.3. Células dendríticas
Se sabe que las células dendríticas murinas (inclusive las de Langerhans epidérmicas),
y para el caso de la infección por L. major, captan los parásitos, adquieren el fenotipo
maduro y liberan IL-12 p40 in vitro (Konecny y col., 1999). Su papel en la producción de
IL-12 in vivo y en la promoción del desarrollo de respuesta inmune específica Th1 frente a
L. major ha sido también demostrada por varios autores (Moll y Flohe, 1997; Belkaid y
col., 2000).
24
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
La capacidad de las células de Langerhans para transportar L. major de la piel infectada
hasta los nódulos linfáticos de drenaje (Moll y col., 1993) se piensa que se debe, al menos
en parte, a la expresión del receptor 2 de quimoquinas (CCR2), ya que ratones de fondo
resistente deficientes en CCR2 son altamente susceptibles a la infección por L. major, y la
migración de las células de Langerhans está marcadamente dañada en dichos animales
(Sato y col., 2000).
El papel clave de las células de Langerhans en el desarrollo de los diferentes tipos de
leishmaniosis cutánea, queda señalado en los estudios de Cáceres-Dittmar y col. (1992).
Según estos autores, la cascada de eventos que ocurren en la reacción inflamatoria de la
piel durante la LC, varía dependiendo de las diferentes formas clínicas de la misma. Así, y
tal como confirman Tapia y col. (1994), la LCL se caracteriza por la generación de una
respuesta Th1 y por presentar muchos de los componentes de un procesos inflamatorio
activo, entre los que destacan abundantes células de Langerhans. Estas células, por el
contrario, están ausentes en la LMC, y aparecen muy escasamente en la LCD.
2.2.2.2.4. Macrófagos
2.2.2.2.4.1.Generalidades
2.2.2.2.4.1.1. FUNCIONES GENERALES
Los macrófagos se originan en la médula ósea a partir de un progenitor denominado
Unidad Formadora de Colonias Granulocito-Macrofágicas, del cual se forman el
monoblasto, los promonocitos y los monocitos. Estos últimos, tras permanecer en la
médula un máximo de 24 h, pasan al torrente circulatorio. La migración de los monocitos
hacia los tejidos se efectúa a través de los endotelios vasculares, y una vez han llegado al
órgano diana se diferencian a macrófagos y no vuelven a la circulación, sino que
permanecen en los tejidos como “macrófagos residentes”. Éstos están ampliamente
distribuidos por todo el organismo, localizándose en órganos linfoides, hígado (donde se
25
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
denominan células de Kupffer), pulmón, tracto gastrointestinal, sistema nervioso central,
huesos, líquido sinovial y piel.
Los macrófagos juegan un papel muy importante en la defensa del hospedador contra la
invasión por una amplia variedad de agentes patógenos, que incluyen bacterias, virus,
hongos y protozoos. Se trasladan hacia ellos guiados por un gradiente de moléculas
quimiotácticas que secretan los microorganismos. Después de la fagocitosis o
internalización, se inicia el proceso de destrucción microbiana. Sin embargo, existen
ciertos patógenos intracelulares que pueden replicarse dentro de él, como Listeria,
Salmonella, Mycobacterias, Toxoplasma o Leishmania (Nathan y col., 1980).
Ha sido ampliamente demostrado que los macrófagos, además de sus propiedades
fagocíticas, de presentación de antígenos y de activación de las células T, tienen una
extensa capacidad secretora. Se han descrito más de 100 sustancias secretadas por los
fagocitos mononucleares, con pesos moleculares que oscilan entre los 32 KD de los
radicales superóxido, hasta los 440.000 de la fibronectina (Nathan, 1987). La secrección
incluye tanto la liberación de estas sustancias al medio extracelular como la descarga de
estos materiales en la vacuola fagocítica. En base a lo afirmado por Henson y col. en 1988,
alguno de los productos como la lisozima, componentes del complemento y
apolipoproteína E, son sintetizados y secretados continuamente (secreción constitutiva),
mientras que otros sólo se secretan bajo un estímulo apropiado (secreción inducida o
regulada). De los productos de secreción de los macrófagos, hay que destacar las
citoquinas por su importancia en el control y en la especificidad de la respuesta inmune.
Entre ellas se encuentran el IFN-γ (Fairchild and Moorhead, 1985), así como la IL-1, IL-6,
IL-8, IL-10, IL-12, TNFα, TNFβ, IFNα, IFNβ, PDGF, TGF-β, GM-CSF, M-CSF, y el
inhibidor de la IL-1 (Adams y Hamilton, 1988).
Avances recientes en inmunología han reforzado la idea, ya bien establecida, de que los
26
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
macrófagos tienen una función esencial en el sistema inmune, como reguladores de la
homeostasis y como células efectoras en infección, crecimiento de tumores y reparación de
tejidos.
2.2.2.2.4.1.2. MECANISMOS DE ACTIVACIÓN
Según la definición de Adams y Hamilton (1984), la activación del macrófago es el
resultado de la expresión aumentada y /o disminuida de varios genes que codifican para
proteínas clave en la función que está siendo activada. Es importante resaltar que esta
activación está regulada no sólo por señales inductoras, sino también por señales
supresoras.
La mayoría de las funciones llevadas a cabo por los macrófagos, incluyendo la
destrucción de parásitos intracelulares y de células malignas in vitro, están incrementadas
por la activación debida a citoquinas. La acción de cada una de estas moléculas sobre
dichas células queda reflejada en la Tabla 3.
Activación de macrófagos por células Th1
Los linfocitos Th1 producen citoquinas asociadas en muchos aspectos con la inmunidad
celular clásica, como son IFNγ , IL-12, IL-3, GM-CSF y TNFα y TNFβ.
El IFNγ es el factor activador más importante de los macrófagos, y también aumenta la
expresión de moléculas de clase II (CMH II); induce la producción de Radicales de
Oxígeno Inorgánico (ROI), de óxido nítrico (NO), y además tiene otras funciones
inmunorreguladoras como la de inducir en las células B la secrección de IgG2a, que es un
importante anticuerpo opsonizante. Finalmente, bloquea los efectos proliferativos de la IL4 sobre las células Th2, previniendo la expresión de esta subpoblación de células T (Suk y
col., 1993).
Los TNFα y β activan al macrófago para producir NO y ROI (aunque esto último no
está aceptado por todos los investigadores).
27
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
La IL-3, por su parte, también tiene funciones activadoras de macrófago, que
principalmente se basan en incrementar la presentación y el procesamiento de antígenos,
aumentando la expresión de moléculas del MHC II y de interacción celular (Frendl y col.,
1990).
La IL-2 aumenta el crecimiento y la diferenciación de las mismas células Th1 que las
producen. El IFNγ y la IL-2 estimulan a los macrófagos para producir TNF-α, que a su vez
los activa.
Por último, el Factor Estimulador de Colonias Granulocito-Macrofágicas (GM-CSF),
una citoquina asociada principalmente con la estimulación y el crecimiento de las colonias
de macrófagos y neutrófilos, también activa a los macrófagos a niveles microbicidas en
conjunción con otras citoquinas, especialmente con el IFNγ (Sadick, 1992).
Activación de macrófagos por células Th2
La IL-4 y su homóloga la IL-13 provocan una estimulación alternativa en el macrófago
(Gordon, 2002), inhibiendo su activación mediada por IFNγ (Suk y col., 1993). Asimismo
produce un aumento de la expresión de CMH de clase II y de presentación de antígeno.
La IL-10 en el macrófago da lugar a una disminución de la expresión del CMH II,
reduce la endocitosis e inhibe la producción de las citoquinas proinflamatorias y la
generación de NO.
El TGF-β provoca una inmunosupresión que conlleva la desactivación del macrófago e
inhibe el desarrollo de otras células Th1.
En definitiva, el patrón de las interacciones entre los dos subtipos de células T es la
regulación recíproca; una respuesta inmune en la cual las Th1 están estimuladas
significaría una regulación negativa de la estimulación de las Th2 y viceversa.
28
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
CITOQ.
FUENTE
ACCIÓN SOBRE EL MACRÓFAGO
IL-1
Macrófagos
Liberación de IL-1, TNF, CSF
IL-3
Células T
Crecimiento y diferenciación
IL-4
IL-10
Células Th2,
Células NK
Macrófagos,
Células Th2
Activación alternativa, aumento de la expresión
de CMH de clase II, presentación de antígeno,
fusión
Disminución de CMHII, reducción de la
endocitosis, inhibición de la producción de
citoquinas Th1
Aumento de la expresión de CMH II,
IL-13
Células Th2
estimulación de la endocitosis y presentación de
antígeno
TNF-α
Macrófagos
M-CSF
Fibroblastos, Macrófagos
GM-CSF
CélulasT, macrófagos,
células endoteliales
Liberación de IL-1, FAP, PGE2, quimiotaxis
Crecimiento y diferenciación,
inducción uroquinasa
Crecimiento, diferenciación y activación
IFN-α
Leucocitos
Antiviral y activación
IFN-β
Fibroblastos
Antiviral y activación
IFN-γ
Células T, células NK
Antiviral y activación
TGF-β
Plaquetas, macrófagos
Quimiotaxis, liberación de factores de
crecimiento, desactivación de macrófagos
Tabla 3: Principales efectos de las distintas citoquinas sobre la actividad de los macrófagos
29
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2.3.2.4.2. El macrófago en infecciones por Leishmania
La captación de Leishmania por los macrófagos se lleva a cabo según la vía
convencional, es decir, fagocitosis mediada por receptor, que implica a una gran diversidad
de receptores opsonicos o del patrón de reconocimiento, como CR3, CR1 y receptores de
manosa-fucosa (Alexander y Russel, 1992), que son utilizados dependiendo de las especies
y estado de los parásitos y de la presencia o ausencia de suero fresco. Los promastigotes
metacíclicos y amastigotes de Leishmania no parecen remodelar el fagosoma en gran
manera, porque rápidamente (en 30 minutos) se fusionan con endosomas o lisosomas
(Courret y col., 2002), generando una vacuola parasitófora que mantiene un pH muy acido
y una gran actividad hidrolítica. Ha sido demostrado que las unidades repetidas de LPG
pueden transitoriamente inhibir la maduración del fagosoma, y que este retraso es
favorable para permitir a los promastigotes tener el tiempo suficiente para diferenciarse a
amastigotes, los cuales son más resistentes a las hidrolasas (Desjardins y Descoteaux,
1997; Dermine y col., 2000).
En el interior del macrófago, los amastigotes sobreviven a la digestión por las enzimas
lisosomales gracias a la expresión de glicoesfingolípidos en la superficie. La parasitación
también evita en el macrófago la puesta en marcha del estallido respiratorio, mediante la
inhibición de la actividad de la Proteína Quinasa C (Moore y col., 1993) y la eliminación
del radical O2- por parte de la superóxido dismutasa (SOD) presente en el parásito (Russell,
1995) completando así los mecanismos de escape de Leishmania a la digestión celular.
El macrófago parasitado procesa los antígenos de Leishmania y los expresa en su
superficie por un proceso mediado por el CMH-II, dado que los parásitos se encuentran en
los fagolisosomas y los antígenos no son mediados en su presentación por el retículo
endoplásmico. Leishmania es capaz de reducir en estas células los niveles del CMH
(Overath, 1999), e inhibir la apoptosis celular para prolongar su prevalencia en el
hospedador (Moore y Matlasheuwsky, 1994). Además, los parásitos regulan la síntesis de
citoquinas hacia aquéllas que suprimen la capacidad lítica de los macrófagos. En este
30
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
contexto, el mecanismo más importante analizado hasta la fecha parece ser la inhibición de
la síntesis de IL-12 en células infectadas por Leishmania, lo cual disminuye o bloquea la
secreción de IFN-γ (Carrera y col., 1996). Además, se ha demostrado que la infección por
Leishmania induce la síntesis de IL-10 y TGF-β, previniendo la activación del macrófago.
La acción sinérgica del IFN-γ y del TNF-α sobre los macrófagos infectados produce la
activación de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), generándose NO (Titus y col.,
1989; Green y col., 1990a; Liew y col., 1990a-1990b; Bodgan y col., 1990; Theodos y col.,
1991), responsable de la destrucción intracelular del parásito (Green y col., 1990b; Liew y
col., 1991; Assreuy y col., 1994). Esta activación de la producción de NO por parte del
macrófago se reproduce in vitro por adición de IFN-γ y lipopolisacáridos (LPS). En estas
condiciones, los macrófagos así estimulados son totalmente capaces de destruir L. major
(Cunha y col., 1993). Por otro lado, el IFN-γ inhibe la proliferación de las células Th2,
activa al macrófago mediando respuestas de hipersensibilidad retardada y estimula la
síntesis de TNF-α en las células infectadas (Green y col., 1990a).
Se ha demostrado que la IL-10 inhibe la síntesis de citoquinas Th1, especialmente del
IFN- γ (Fiorentino y col., 1991; Chatelein y col., 1992), y por tanto la producción de NO
en el macrófago (Cunha y col, 1992). Esto explica, en parte, el papel inmunosupresor y
potenciador de la enfermedad atribuido a esta citoquina (Ghalib y col., 1993; Holaday y
col., 1993).
De esta forma, parece ser que al menos en el modelo ratón, la activación de macrófagos
por las citoquinas derivadas de células T es un requerimiento imprescindible para controlar
la infección y la progresión de la enfermedad. Así, la inhibición de la división de
Leishmania está mediada por la producción de NO, inducida a su vez por el IFN-γ y otras
citoquinas que actúan sinérgicamente, como el TNF-α e IL-12 (Ding y col., 1988;
Belosevic y col., 1990).
31
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2.3. Susceptibilidad y resistencia a la infección por Leishmania
2.2.3.1. Modelo L. major / ratón
La relación entre el sistema inmunitario y la evolución de la infección en leishmaniosis
está bien estudiada en el modelo experimental murino (Solbach, 1995). Este es, en efecto,
el caso de la infección experimental por L. major. En ella se determina que la evolución de
la leishmaniosis cutánea depende del balance de los fenotipos funcionales de los linfocitos
T CD4+. La respuesta de tipo Th1 corresponde a una lesión localizada, benigna y que se
resuelve espontáneamente; la respuesta Th2 implica una lesión severa, extensa y que no
cura de forma espontánea.
La transmisión natural de la leishmaniosis cutánea por L. major se lleva a cabo a través
del mosquito vector Phlebotomus papatasi, el cual inocula en la piel un pequeño número
(100 - 1000) de promastigotes metacíclicos en fase infectiva. L. major está ampliamente
distribuida en todo el norte de África, Oriente Medio y Asia Central. La infección de los
reservorios naturales roedores y hospedadores humanos, conlleva invariablemente al
desarrollo de lesiones cutáneas localizadas que eventualmente curan, y a la generación de
una inmunidad duradera frente a reinfecciones.
En el laboratorio, muchos genotipos murinos (cepas C57BL/6, C57BL/10, B10.D2,
C3H, A/J, DBA/1, AKR, CBA, NZB y STS/A) controlan también la infección por L.
major, la cual es iniciada típicamente por una inoculación de un gran número (104-107) de
parásitos en zonas subcutáneas, como la planta del pie o la base de la cola. Por otra parte,
ciertas estirpes (BALB/c y SWR/J) fallan en el control de la infección y desarrollan
lesiones progresivas y enfermedad sistémica.
Hay que precisar, sin embargo, que en este modelo experimental se han introducido
diversas variables que, en algunos casos, pueden alterar el resultado de la infección de una
u otra manera. Entre ellos se incluyen el estado de desarrollo de los parásitos utilizados
para la inyección -promastigotes metacíclicos purificados o bien poblaciones heterogéneas
32
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
de promastigotes en fase estacionaria (Sacks y col., 1985)-, la inyección de un bajo número
de parásitos (Bretscher y col., 1992), rutas alternativas de inoculación -incluyendo las vías
intravenosa, intradérmica e intranasal (Belkaid y col., 2000; Nabors y col., 1995; Constant
y col., 2000)- y formas naturales de infección usando el insecto vector (Kamhawi y col.,
2000). En este sentido, se ha podido comprobar que el sitio de distribución del antígeno
puede influenciar la preactivación de las células T. De esta manera, cuando los parásitos se
distribuyen intravenosamente o intranasalmente pueden provocar respuestas Th2
sostenidas y producir infecciones no curativas en ratones normalmente resistentes (Nabors
y col., 1995; Constant y col., 2000). También se ha podido observar que ratones BALB/c
desarrollan una resistencia estable a pequeños inóculos de parásitos en áreas subcutáneas
(Bretscher y col., 1992). Así, la administración de una baja dosis infectiva a estos ratones
parece mimetizar los eventos que normalmente ocurren en animales resistentes, en los
cuales no hay diseminación de parásitos más allá de los nódulos linfáticos de drenaje.
Aunque ciertos estudios han señalado que algunos antígenos de Leishmania dirigen la
respuesta hacia el tipo Th2 en ratones susceptibles (Scott y col., 1986), existe evidencia de
que la mayoría de las células T vírgenes pueden dar lugar hacia uno u otro tipo de
linfocitos Th, y que las citoquinas administradas o inducidas al tiempo de la infección
median esta diferenciación (Seder y Paul, 1994). Es muy probable que la susceptibilidad
genética de BALB/c a L. major se origine por un reconocimiento aberrante de epítopos del
parásito y generación de CD4+ Th2, tal que la IL-4 llega a ser tan abundante y temprana
que induce la pérdida de IL-12 (Locksley y col., 1999). De esta manera, la predisposición
genética para la susceptibilidad o resistencia a la infección por L. major, se correlaciona
con la dominancia de una respuesta Th2 dirigida por IL-4 que causa enfermedad, o una
respuesta dominante Th1 dirigida por IFN-γ que promueve curación y supresión de los
parásitos, respectivamente.
La manera en que se produce la diseminación de los parásitos desde el sitio de
inoculación hasta los nódulos linfáticos de drenaje y órganos viscerales es sustancialmente
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REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
diferente en ambas cepas. Así, en ratones susceptibles, la forma cutánea por L. major
provoca una enfermedad progresiva con rápida diseminación visceral (Laskay y col.,
1995), que está asociada a la aparición de células Th2 específicas del parásito. Como
resultado de esta diseminación, se pueden encontrar células T CD4+ que producen
espontáneamente IL-4 in vitro en nódulos linfáticos, hígado y bazo de BALB/c dos
semanas después de la infección, mientras que no aparecen en las vísceras de los C57BL/6
(Yamashita y col., 1999). Los ratones resistentes de esta cepa y de otras como la CBA o
C3H, controlan la infección y desarrollan una fuerte respuesta asociada a la aparición de
células Th1, observándose en ellos una contención temprana de los parásitos en la
almohadilla plantar del pie y nódulos linfáticos regionales (Laskay y col., 1995).
El hecho de que L. major sea secuestrada en fibroblastos (Bodgan y col., 2000) y
células dendríticas (Moll y col., 1995) se ha ofrecido como explicación al mantenimiento
de infecciones latentes después de la curación clínica en ratones resistentes (Aebischer y
col., 1993). A pesar de ser incapaces de alcanzar la esterilidad, los ratones curados
mantienen
una inmunidad duradera frente a reinfecciones. La presión inmunológica
durante la fase crónica es mantenida por las células T CD4+ y CD8+, y también por la IL12, IFN-γ y iNOS, pues ha sido demostrado que el deterioro de estas respuestas durante la
latencia promueve el crecimiento de los parásitos y la reaparición de lesiones (Stenger y
col., 1996; Stobie y col., 2000).
Estas diferencias inherentes a la cepa de hospedador, se corresponden con el dato de que
al menos seis loci genéticos murinos contribuyen a la resistencia frente a L. major (Beebe y
col., 1997; Lipoldova y col., 2000). Dichos genes operan sobre ciertas subpoblaciones de
macrófagos y sobre la programación precoz de linfocitos T y su modulación desde el
fenotipo 0 hacia los fenotipos Th1 o Th2 (Gorham, 1996).
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REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.2.3.1.1. Susceptibilidad y respuesta Th2
La aparente resolución de la infección con L. major en ratones BALB/c tratados a lo
largo de la infección con anticuerpo monoclonal anti-IL-4 (Sadick y col., 1990; Chatelain
y col., 1992) o en ratones BALB/c deficientes en IL-4 (Kopf y col., 1996; Mohrs y col.,
1999), ayudó a establecer la idea de que la producción temprana de IL-4 conduce a una
respuesta polarizada Th2. Esta respuesta está estrictamente limitada a una población
oligoclonal de células T