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TMO haploidéntico en
Inmunodeficiencias
Combinadas Severas
Bioq. María Silvana Bertone
Bioq. María Mercedes Gallinger
Residencia de Inmunología para Bioquímicos.
Hospital Nacional de Pediatría “J. P. Garrahan”.
INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS
Grupo heterogéneo y poco frecuente de
enfermedades genéticas caracterizadas
por alteraciones cuantitativas y/o
cualitativas que comprometen en forma
individual o combinada a los distintos
componentes del sistema inmune:
El sistema B o humoral.
El sistema T o celular.
El sistema fagocítico (PMN y MN).
El sistema del complemento.
~
ℑ
INFECCIONES
Clasificación de las IDP
Comité de Expertos de la OMS se reúne desde 1971.
Revisión 2003.
Basada en el tipo de defecto predominante
1- Trastornos predominantemente humorales (defectos
de anticuerpos). ⇒ XLA.
2- Defectos combinados (celulares/humorales). ⇒ IDCS.
3- Otros síndromes de inmunodeficiencias bien
definidos. ⇒ S. de Wiskott-Aldrich.
4- Defectos de la fagocitosis. ⇒ EGC.
5- Defectos del sistema complemento. ⇒ Deficiencia de
C1 inhihidor.
Inmunodeficiencias Combinadas Severas
Edad de presentación: - Los síntomas en los defectos
de la inmunidad celular aparecen poco después del
nacimiento (< 6 meses)
Sexo: > incidencia en varones porque deficiencia de
cadena γ del R de IL-2 es ligada al cromosoma X.
Antecedentes familiares: muertes en < de 1 año por
infecciones severas.
Frecuencia: 1 en 500.000 RNV.
- IDP combinadas (celulares/humorales): 15% de las IDP
- IDCS: 10% de las IDP combinadas.
Clínica
Infecciones persistentes a pesar de tratamiento estándar.
Infecciones recurrentes.
recurrentes
Infecciones severas:
severas invasivas (meningitis, artritis séptica).
Infecciones oportunistas.
oportunistas
Ausencia de sombra tímica en Rx de tórax.
Enfermedad de injerto contra huésped por Li maternos o de
transfusiones no irradiadas.
Historia fliar. de ID o muertes tempranas por infecciones.
Agentes infecciosos
Bacterias GP y GN.
Virus:
Virus - Rotavirus y otros virus intestinales.
- VRS y otros virus respiratorios.
- CMV y otros virus herpes.
Hongos
Parásitos
Oportunistas:
Oportunistas como Pneumocystis y Bacilo
Calmette-Guerin (BCG) diseminado.
Anormalidades inmunológicas
Linfopenia T < 2200 (comparado con VN para la edad).
Pobre respuesta T a mitógenos y antígenos.
Células B ausentes o no funcionales.
Caída de los niveles de IgG y niveles muy bajos de IgA
e IgM.
Respuesta de Acs a Ags específicos ausente (ej.:
toxoide tetánico).
Infecciones
Diarrea
Desnutrición
GvHD
•Eczema
•Hepatoesplenomegalia
•Diarrea
BCG
•Local
•Regional
•Diseminada
IDCS
SIDA
Muguet
persistente
Examen físico
Historia familiar
Naturaleza, severidad y
frecuencia de infecciones, tasa de
crecimiento y desarrollo.
Muertes tempranas de causa
desconocida o infecciosa en la
familia.
Laboratorio
Hemograma.
Serología para HIV.
Poblaciones linfocitarias (Li T, Li B y NK).
Pruebas funcionales T: proliferación a mitógenos y Ags.
Cuantificación de Igs (IgG, IgA, IgM).
Pruebas funcionales B: Respuesta de Acs a inmunizaciones.
Estudios específicos orientados por el inmunólogo: determinación enzimática de
ADA, etc.
Test para Dx molecular de defectos genéticos específicos
γc, JAK3, RAG1 o RAG2, IL7RA, CD45, Artemis, CD3δ, ADA.
Mutaciones en nueve genes diferentes causan IDCS.
Estos codifican para distintas proteínas:
Componentes de receptores de citoquinas:
- IL-2Rγ, JAK-3: T(-)B(+)NK(-)
- IL-7Rα: T(-)B(+)NK(+)
Mutaciones en nueve genes diferentes causan SCID.
Estos codifican para distintas proteínas:
Componentes de receptores de citoquinas:
- IL-2RG, JAK-3: T(-)B(+)NK(-)
- IL-7Rα: T(-)B(+)NK(+)
Proteínas necesarias para rearreglo somático de receptores
de Ag de Li T y Li B:
- RAG1, RAG2 y ARTEMIS: T(-)B(-)NK(+)
RAG 1 y 2
Artemis
Mutaciones en nueve genes diferentes causan SCID.
Estos codifican para distintas proteínas:
Componentes de receptores de citoquinas:
- IL-2RG, JAK-3: T(-)B(+)NK(-)
- IL-7Rα: T(-)B(+)NK(+)
Proteínas necesarias para rearreglo somático de receptores
de Ag de Li T y Li B:
- RAG1, RAG2 y ARTEMIS: T(-)B(-)NK(+)
Componente del complejo TCR:
- CD3δ: T(-)B(+)NK(+)
Molécula coestimulatoria de células inmunes:
- CD45: T(-)B(+)NK(-)
COMPLEJO TCR
Mutaciones en nueve genes diferentes causan SCID.
Estos codifican para distintas proteínas:
Componentes de receptores de citoquinas:
- IL-2RG, JAK-3: T(-)B(+)NK(-)
- IL-7Rα: T(-)B(+)NK(+)
Proteínas necesarias para rearreglo somático de receptores
de Ag de Li T y Li B:
- RAG1, RAG2 y ARTEMIS: T(-)B(-)NK(+)
Componente del complejo TCR:
- CD3δ: T(-)B(+)NK(+)
Molécula coestimulatoria de células inmunes:
- CD45: T(-)B(+)NK(-)
Enzima involucrada en el metabolismo de las purinas:
- adenosina deaminasa (ADA): T(-)B(-)NK(-)
ADN
2´-deoxiadenosina
d-ATP
dCydK
ADA
2´-deoxiinosina
Tratamiento IDCS
TRANSPLANTE
• HLA idéntico:
- Médula Ósea
- SCSP movilizadas
- Sangre de cordón
• HLA haplo-idéntico
Depleción T
- Aglutinación con Lectina de Soja y Roseteo
- Anticuerpos anti-Li T
- Columnas de Selección de CD34
TERAPIA GÉNICA
Transplante haploidéntico
Donante:
Padre
Madre
A1
A7
A3
A8
B5
B9
B4
B2
DR10
DR2
DR6
DR11
Receptor:
Hijo
A1
A3
B5
B4
DR10
DR6
Mismatch en 3 de 6 Antígenos HLA
Depleción de células T
Un poquito de historia...
1968 - Descubrimiento del sistema HLA.
- Primeros transplantes exitosos en IDP letales de hermanos
HLA-idénticos.
Fines de 1970s: Estudios en ratones mostraron que MO
alogeneicas con CMH no idéntico, depletadas de células T lograban
restaurar la función linfohematopoyética de los animales receptores
previamente letalmente irradiados sin causar GvHD.
Principios de 1980s: Reisner et al. demostraron que removiendo las
células T maduras de MO de padres haploidénticos se lograba una
reconstitución del sistema inmne exitosa en niños IDCS, sin GvHD.
En todos estos años se han logrado progresos importantes para un
tratamiento exitoso de las IDCS.
IDCS: Defecto
inmunológico
No pueden rechazar
aloinjertos
TMO HLA idéntico
TMO HLA haplo-idéntico DCT
Generalmente no requieren
condicionamiento
quimioterápico previo.
Generalmente no
requieren profilaxis para
GvHD post-TMO.
Depleción de células T por
Aglutinación con Lectina de Soja
y Roseteo
3 pasos:
Depleción eritrocitaria.
Aglutinación con lectina de soja.
Formación de rosetas E con glóbulos
rojos de carnero
Depleción eritrocitaria
Homogeneizar
+
MO
(800(800-1200 mL)
40 min
Plasma rico
en leucocitos
(UNSEP)
UNSEP)
Gelatina 3%
en SF
GR/GB:
2,9-7,3:1
Lavar PBS 1% ASH
x 2
1 a 4x108 cél.
nucleadas/mL
COBE 2991
Aglutinación con lectina de soja
FUNDAMENTO
LS
LS
N-acetilgalactosamina
N-acetilgalactosamina
LS
LS
N-acetilgalactosamina
N-acetilgalactosamina
Remueve GR y 60-80% de células nucleadas maduras
linfoides, mieloides y del estroma.
Aglutinación con lectina de soja
PROCEDIMIENTO
SBA
UNSEP
Células inmaduras
(SBA -)
SBA -
Células aglutinadas
(SBA +)
Gradiente de
BSA 5%
Lavar PBS 0,2 M Gal
Lavar TC 199 1% ASH
Depleciona a la MO en un 90% de las cé
células T
Li T residuales > 1x105/kg de peso : 50%
probabilidad de GvHD agudo grado I y II
COBE 2991
Roseteo de la fracción SBA- con GR de carnero
tratados con AET (aminoetil isotionuronium)
FUNDAMENTO
CD2
CD58
Roseteo de la fracción SBA- con GR de carnero
PROCEDIMIENTO
GR de
carnero
4° C
1 hora
SBA -
Ficoll
SBA – E -
Hypaque
resuspender
Li en
rosetas
Resuspender en
Ringer lactato
SBA – E COBE 2991
Rosetas E
Células T, B y NK como porcentaje de los
linfocitos totales en los sucesivos pasos
de la DCT
100
80
% Cél. T
% Cél. B
% Cél. NK
60
40
20
0
1
2
3
1: Médula Osea
2: SBA3: SBA- E4: SBA- E- E-
4
Fenotipo de células T en los sucesivos pasos
de DCT
100
% CD4
80
% CD8
60
% gamma/delta
40
20
0
1
2
3
1: Médula Osea
2: SBA3: SBA- E4: SBA- E- E-
4
SP normal
Interpretación de gráfico
de puntos
Análisis de la expresión de CD2 en Li T y NK pre y post DCT
R1
R1
R2
R2
R4
R4
R2*R3: LYMPHOCYTES
R5
R5
R3
R3
R2*R3*R4: T CELLS
% CD3+()/CD2(-): 84%
CD2 MFI: 80
R2*R3*R4: T CELLS
CD2 MFI: 764
R2*R3*R5: NK CELLS
CD2 MFI: 452
R2*R3*R5: NK CELLS
CD2 MFI : 70
Cinética de Reconstitución Celular
Post-TMO
%
100
90
80
70
60
Histoidéntico
50
40
30
20
10
0
15
30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 225 240
días post trasplante
%
Células B
Células NK
100
90
80
70
Haploidéntico
Células T
60
50
40
30
20
10
0
15
30
45
60
75
90
105
120
135
150
165
180
días post trasplante
195
210 225 240
¿Cómo se educa en el receptor la stem cell del
donante?
Proliferación
Región
subcapsular
CD3-CD4-CD8-
Corteza
CD3+CD4+CD8+
Selección positiva
CD3+CD4+
CD3+CD8+
Región
corticomedular
Selección negativa
Apoptosis
Médula
CD3+CD4+
CD3+CD8+
PERIFERIA
Cinética de reconstitución de células T
post-TMO en IDCS
NEJM, Vol 342, N° 18, 1325-1332
Cinética de función tímica post-TMO en IDCS
NEJM, Vol 342, N° 18, 1325-1332
paciente SCID con deficiencia de cadena
gamma del Receptor de IL2
poblaciones linfocitarias al diagnostico
R1
R2
% T : neg
% B: 99%
% NK: <1%
cultivos linfocitarios:
PHA: no prolifera
PHA+IL2: no prolifera
Día +10 post-TMO
R1
R2
Quadrant Statistics
File: PAEZ POSTMO 27/12/02.002
Sample ID:
Tube:
Acquisition Date: 27-Dec-02
Gated Events: 34613
X Parameter: FL1-H CD45 FITC (Log)
Quad Location: 9, 11
R3
Quad
UL
UR
LL
LR
Events
% Gated
0
0.00
94
0.27
0
0.00
34519
99.73
% Total
0.00
0.17
0.00
62.37
Log Data Units: Linear Values
Patient ID:
Panel:
Gate: G9
Total Events: 55343
Y Parameter: FL2-H CD3 PE (Log)
X Mean
***
908.97
***
720.58
X Geo Mean
***
857.88
***
697.62
Y Mean
***
709.61
***
1.11
Y Geo Mean
dia + 112 postmo
R2
R1
% B: 48%
% T : 45%
100% T:
CD4:18%
CD8: 69%
DN: 8%
% NK: 5%
cultivos linfocitarios: PHA 80.000 cpm
PHA+IL2: 156.000 cpm
normal:150.000 cpm
Repertorio de TCR post-TMO DCT
% of CD4
Q.J. day +90
DCT
Q.J. day +160
DCT
Normal Range
Vβ
β2
16.0
10.96
10.6+/-1.32
Vβ
β 5.1
8.51
5.84
5.83+/-1.27
Vβ
β8
0
4.80
4.72+/-0.68
Vβ
β9
0
5.02
2.90+/-0.84
Vβ
β 13.1
4.17
3.28
3.10+/-0.62
Vβ
β 13.6
9.0
2.50
1.74+/-0.57
Vβ
β 14
5.31
3.30
2.42+/-0.82
Vβ
β 17
8.06
4.91
5.50+/-1.62
Vβ
β 22
3.95
4.14
3.46+/-0.59
Vβ
β 23
0
2.95
0.39+/-0.28
Pacientes y Tipo de Trasplante
Paciente
Edad /Sexo
Diagnóstico
Trasplante
Cond.
Reconstitución T
Estado Actual
T. T.
2.5 años/F
Def. HLA Clase II
Haploidéntico DCT +
Sangre de Cordón
+
+
viva + 11 años
A. M.
5 meses/M
Ligada al X
Haploidéntico DCT
-
+
vivo? + 14 años
L. A.
9 meses/M
Ligada al X
Haploidéntico DCT
+
+
vivo + 10 años
P .A.
7 meses/M
Ligada al X
Haploidéntico DCT
+
-
fallecido
M. M.
3 meses/M
ADA -
Haploidéntico DCT
+
+
fallecido
B. B.
6 meses/F
Desconocida
Haploidéntico DCT
+
+
fallecida
Q. J.
8 meses/M
Desconocida
Haploidéntico DCT
+
+
vivo + 6.5 años
S. L.
7 meses/M
Ligada al X
Haploidéntico DCT
+
+
fallecido
G. O.
9 meses/M
Desconocida
Haploidéntico DCT
-
-
fallecido
N. S.
1 año/M
Desconocida
Haploidéntico DCT
+
+
vivo + 5 años
F. A.
10 meses/M
Ligada al X
Haploidéntico DCT
-
-
fallecido
B. J.
8 meses/M
Desconocida
Haploidéntico DCT
+
+
vivo + 5 meses
B. A.
2 meses/F
Desconocida
Haploidéntico DCT
-
+
fallecida
L. L.
9 meses/M
Ligada al X
Haploidéntico DCT
-
-
fallecido
I. L.
5.5 meses/M
Heterocigota RAG1
Haploidéntico DCT
+
+
vivo + 4 años
S. A.
3.5 meses/M
Heterocigota RAG1
Haploidéntico DCT
+
+
vivo + 4 meses
P. A.
26 días/M
Ligada al X
Haploidéntico DCT
-
+
Vivo + 3 años
M. J.
1,5 años
Cartílago-Pelo
Haploidéntico DCT
+
-
fallecida
R. T.
3 meses
Ligada al X
Haploidéntico DCT
-
+
Vivo + 16 meses
S. S.
3 meses
Def. HLA Clase II
Haploidéntico DCT +
sangre de cordón
+
+
Vivo + 12 meses
¡MUCHAS
GRACIAS!!!