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EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE
CITOCINAS EN UN MODELO DE MACRÓFAGO U937 ESTIMULADOS CON ENDOTOXINAS DE Porphyromonas gingivalis.
Revista Colombiana de Investigación en
Odontología 2011; 1 (3): 31 - 41
1.
2.
3.
4.
Bernau Sebastian
Gualtero Escobar Diego Fernando
Lafaurie Gloria Ines
Castellanos Jaime
1. Biólogo Investigador instituto UIBO Universidad el Bosque.
2. OD. MS Bioquímica. Profesor asistente.
Facultad de odontología. Investigador
instituto UIBO - Universidad el Bosque
3. OD. Especialización Periodoncia.
Profesor
asociado.
Facultad
de
odontología.
Directora
UIBO
Universidad el Bosque.
4. OD. Doctor en Química. Profesor
asociado. Director del instituto de
virología - Universidad el Bosque
Recibido 26 de Mayo 2010/Enviado
para modificación 22 de Julio de 2010/
Aceptado 01 de Agosto 2010
EVALUATION OF THE EXPRESSION OF
CYTOKINES IN A MACROPHAGES U937
MODEL STIMULATED WITH Porphyromonas gingivalis ENDOTOXIN.
RESUMEN
Objetivo. Evaluar la expresión de seis citocinas
(TNFα, IL1β, IL-6, IL-8, IL-10 e IL- 12) expresadas por las células U937 estimuladas bajo
el estimulo de LPS de Porphyromonas gingivalis ATCC (33277) y de Escherichia coli ATCC
(12740). Métodos. En este estudio macrófagos
U937 fueron estimulados con LPS de P. gingivalis (ATCC33277) a diferentes tiempos y concentraciones y se estimulo con LPS de E.coli
(ATCC12740) como control. Las citocinas evaluadas fueron TNFα, IL1β, IL-6, IL-8, IL-10 e IL12 a nivel de mRNA por RT-PCR y electroforesis
en agarosa. Los niveles de expresión fueron determinados con el programa ImageJ con respecto al gen housekeeping β-actina. Resultados. Se
encontró que las células U937 expresaron IL-6,
IL1β e IL-8 hasta por 24 horas de estímulo con
LPS de P. gingivalis y E. coli a concentraciones
de 50 pg/ml y 100 ng/ml. TNF α solo fue inducido
por el LPS de P. gingivalis durante las primeras 6
horas de estímulo. Ninguno de los LPS indujo la
expresión de IL-10 e IL-12 en macrófagos U937.
Conclusiones. Los resultados indican que los
LPS a bajas concentraciones (50 pg/ml) inducen expresión de citocinas pro inflamatoria, lo
que sugiere su fuerte actividad en macrófagos.
PALABRAS
CLAVE;
LPS;
Porphyromonas gingivalis; periodontitis; macrófagos; citocinas; enfermedad cardiovascular.
32 | Revista Colombiana de Investigación en Odontología 2011; 1 (3)
ABSTRACT
Objective. Evaluate the expression of six cytokines ((TNFα, IL1β, IL-6, IL-8, IL-10 e IL- 12)
expressed by U937 cells stimulated with LPS of Porphyromonas gingivalis and Escherichia
coli ATCC. Methods. In this study, U937 macrophages were stimulated with LPS of P. gingivalis (ATCC33277) at different times and concentrations and stimulated with LPS of E. coli
(ATCC12740) as a control.. The cytokines tested were TNFalfa, IL1β, IL-6, IL-8, IL-10 and
IL-12 at mRNA level with RT-PCR and agarose electrophoresis. The expression levels were
determined with the ImageJ analysis software in comparison to β-actin housekeeping gene. Results. U937 cells expressed IL1β, IL-6 and IL-8 up to 24 hours stimulation with LPS of P. gingivalis and E. coli at 50 pg and 100 ng / ml. TNF-α was only induced by LPS from P. gingivalis
during the first 6 hours of stimulation. None of the LPS induced expression of IL-10 and IL-12
in U937 cells. Conclusions. The results indicate that LPS at low concentrations (50 pg / ml)
induces expression of pro-inflammatory cytokines, suggesting strong activity in macrophages.
KEYWORDS: Lipopolysaccharides (LPS); Porphyromonas gingivalis; periodontitis; cytokines; macrophages; cardiovascular risk.
INTRODUCCIÓN
La Periodontitis se ha definido como una
enfermedad infecciosa crónica de los tejidos de soporte del diente, caracterizada
por un proceso de destrucción inflamatorio
que afecta los tejidos periodontales, lo que
causa pérdida del hueso alveolar, formación
de bolsas y la pérdida de los dientes (1).
Diversos estudios epidemiológicos han encontrado una asociación de riesgo entre enfermedades infecciosas con un riesgo aumentado a enfermedad cardiovascular (2).
El paso de bacterias viables a la circulación
periférica y su degradación en el plasma con
la posterior exposición del lipopolisacárido
parece ser crítico en el modelo de riesgo (3-6).
Se ha establecido que endotoxemias (lipopolisacaridos en circulación) a concentraciones
iguales o superiores a 50 pg/ml son consideradas como de riesgo cardiovacular para
sufrir aterosclerosis en población sana (7).
a la capacidad secretora de los monocitos. Algunos individuos pueden responder a los componentes bacterianos tal como LPS con una
respuesta inflamatoria exagerada que se refleja
en la producción de altos niveles de mediadores
proinflamatorios como PGE2, TNF-α e IL-1β,
así como moléculas de adhesión (VCAM-1 y
ICAM-1) y quimiocinas (IL-8). La expresión
de estas moléculas atraen monocitos que penetran el tejido endotelial permeabilizado, son
estimulados a diferenciarse en macrofagos y
se transforman en células espumosas al captar LDL oxidado presente en circulación. Las
células espumosas se acumulan y las células
del musculo liso proliferan, lo que conduce
a la formación de placa ateromatosa. (10,11)
La relación entre riesgo cardiovascular y la
enfermedad periodontal parece estar fuertemente determinada por la sobreexpresión
de mediadores inflamatorios inducidos por
endotoxinas, entre los más estudiados se encuentra IL1-β, IL-6, IL-8 y TNFα (12, 13,
14). Así mismo LPS es capaza de inducir la
El monocito y el macrófago son células ampli- formación de células espumosas, acumulaamente investigadas en cuanto a su activación ción de esteres de colesterol (14), prostaglanmediada por LPS Beck (8) y Offenbacher (9) dina E2 y metaloproteinasa-9 (MMP9) (12).
han definido que existe una marcada diferencia en la respuesta del huésped al reto bacteri- Las citocinas son moléculas que actúan como
ano dependiente del repertorio de células T y mensajeros transmitiendo señales a las células
Sebastian - Evaluación de la expresión de citocinas | 33
para iniciar y mantener la respuesta inflamatoria, la respuesta inmune y la regulación
del crecimiento y diferenciación celular, así
como su papel en la activación de la reacción de fase aguda como mecanismo regulatorio del proceso infeccioso en el organismo
que tiene como objetivo recuperar la homeostasis y neutralizar el agente causal (10).
tración de endotoxina más alta que las reportadas en estudios clínicos (6,7). Esto sugiere que
deben hacerse valoraciones in vitro de dichas
concentraciones (50pg/ml) para valorar la expresión de mediadores inflamatorios y tener
un mayor acercamiento al modelo in-vivo.
El propósito de este estudio fue evaluar el
modelo de macrófago humano para la valoración de citocinas proinflamamtorias en
Se ha reportado que pacientes con enfermedad respuesta a LPS a diferentes concentraciones
periodontal expresan altos niveles séricos de y tiempos, incluyendo concentraciones bajas
citocinas proinflamatorias como la IL-1, IL-6 que han sido reportadas en estudios clínicos.
y TNF-α (15,16) y un aumento en estos marcadores sistémicos se han correlacionado con MATERIALES Y MÉTODO
un aumento del riesgo cardiovascular (17,18).
Se ha descrito que el proceso inflamatorio Cultivo y mantenimiento celular.
ocasiona una disminución en la expresión
de la oxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) Se utilizaron macrófagos humanos U937, una
y ciclo-oxigenasa tipo I (COX-1) (19,20) línea celular obtenida a partir de fluido pleural
lo cual incrementa la apoptosis de células de un paciente con linfoma histiocítico difuso.
endoteliales (21), aumenta la expresión de Esta línea es importante ya que exhibe muchas
moléculas de adhesión (22), e incrementa la características monocíticas y ha servido como
actividad de la NADPH oxidasa con aumento un modelo para la diferenciación de monocien la producción radicales libres como el su- tos a macrófagos in-vitro (27), así como para
peroxido (O2-) y peroxinitrito (ONOO-) (23). estudios relacionados con la expresión de facEs por estos mecanismos que se desarrolla la tores dependientes de estímulos (28). Al inidisfunción endotelial, caracterizada por un ciar los ensayos, las células se encontraban
incremento en la migración de leucocitos y congeladas en nitrógeno liquido, estas fueron
agregación plaquetaria, favoreciendo el desar- sacadas y puestas a baño María previamente
rollo de la placa ateroesclerotica y trombosis. calentado a 20ºC, por 5 minutos y fueron resuspendidas en 5ml de RPMI completo (10%
La activación de macrófagos también es un suero fetal bovino (SFB), 1% antibiótico
proceso de alto interés para entender la relación (penicilina-estreptomicina)) y fueron pasadas
entre riesgo cardiovascular y la enfermedad a cajas de cultivo de 75 cm2, en las cuales se
periodontal, ya que se ha reportado que en llevo a cabo los pases y las resiembras de las
presencia de lipoproteína de baja densidad células. Para los diferentes modelos de es(LDL) en estado oxidado y la presencia de LPS timulación, se utilizaron placas de 6 pozos.
a nivel sistémico aumentan la manifestación
de ateroesclerosis, debido a que LPS altera el Estado y obtención de los lipopolisacáridos
comportamiento del factor de transcripción κβ (LPS).
y este regula varios un grupos grande de genes
encargados de varios procesos celulares im- El LPS de E. coli (ATCC 12740) utilizado
portantes a nivel sistémico como proliferación, en todas las pruebas fue conseguido comermigración y supervivencia celular (24-26). cialmente de Sigma® (USA). El LPS de P.
gingivalis fue purificado por cromatografía
Bodet et.al;(12) (2004) ha evaluado la acti- de exclusión por tamaño (Sephacryl S200) y
vación de monocitos mediante el estímulo de extraído con Fenol-agua a partir del cultivo
LPS de Porphyromonas gingivalis, sin embar- celular de la cepa ATCC 33277 en el instigo, este estudio valora la activación a concen- tuto UIBO de la Universidad El Bosque (29).
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Modelo de estimulación por LPS de macrófagos U937.
Diseño de primers.
La especificidad de los primers fue confirmaPara este modelo, se utilizaron placas de 6 da bioinformáticamente realizando un alineapozos, sembradas con 300.000 células cada miento contra bases de datos de RNA humano
uno, las cuales tuvieron un periodo de esta- usando el programa BLASTN disponible en:
blecimiento de 24h. Posterior a este tiempo http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerse cambio el medio por uno que incluía el blast/index.cgi?LINK_LOC= BlastHomeAd).
estímulo con LPS (100 ng/ml) y se llevo a
cabo extracción de RNA a diferentes tiempos de estimulación (3h, 6h, 12h y 24h).
También se valoraron diferentes concentraciones del estimulo (100 ng/ml y 50 pg/
ml) a 6 horas de estimulación. Cada uno de
los tratamientos fue realizado por duplicado.
Tabla 1. Secuencia de los primers utilizados y el peso del producto esperado
Extracción de RNA, RT-PCR y PCR.
minutos a 4ºC, luego se tomo la fase acuosa
y se le agregaron 500 μl de isopropanol y se
A partir de la monocapa de células con LPS sometió a una nueva centrifugación. Se realizó
de P. gingivalis ATCC (33277), de E. coli un lavado con 1 ml de etanol seguido de cenATCC (12740) o sin estimulo, se extrajo el trifugación. Finalmente, el RNA fue resusRNA total utilizando el reactivo TRIzol® pendido en 30 μl de agua tratada previamente
1ml/pozo (Invitrogen. USA). Las muestras se con dietilpirocarbonato (DEPC) para inactiincubaron por 5 minutos a temperatura ambi- var cualquier RNAsa y almacenado a -80ºC.
ente, luego se adicionaron 200 μl de cloroformo y se incubó por 3 minutos a tempera- La transcripción reversa se hizo usando
tura ambiente, se centrifugó a 12000 g por 15 un primer oligo (dT) (Promega, USA) y la
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enzima transcriptasa reversa MMLV (Promega, USA) durante una hora a 42ºC.
Luego de esto las muestras de cDNA
(ADN copia) fueron almacenadas a -20ºC.
A partir del cDNA (2.5μl) se hizo PCR , la
cual contenía Cloruro de magnesio (1.5 mM),
dNTP’s (0.2mM), GoTaq polimerasa, primers de citocinas (sentido y antisentido 0.5 μM)
y agua grado 1 estéril para un volumen final
de 25 μl por reacción. Las condiciones de
amplificación fueron realizadas en un termociclador (MyCycler Thermal Cucler System,
Bio-Rad) las cuales fueron, una fase inicial
de desnaturalización de 2 minutos a 94°C,
30 ciclos de 45 segundos a 94ºC, 30 segundos a 60ºC, y 30 segundos a 72ºC y una
fase final de extensión de 3 minutos a 72ºC.
Análisis electroforéticos
Se tomaron 10ul de los productos de amplificación y se separaron electroforéticamente
en geles de agarosa al 2%, corridos a 80V
durante 45 min (Biorad Power Pac 300, Cat.
No 165-5050) y teñidos con bromuro de
etidio (Promega, USA). Luego se fotografiaron los geles en la cámara de UV al 70%
de intensidad con la cámara Leica D-Lux
3 de formato 16:9 nativo y 10 megapíxeles (1/1,65”). El peso molecular de las bandas fue determinado usando el marcador de
peso molecular de 100pb (Promega, USA).
disuelto en RPMI a una concentración final
de 1mg/ml y se incubo a 37ºC por 2 horas;
luego de la corroboración microscópica de
la formación de cristales de formazán, estos
se solubilizaron con la adición de 100μl de
dimetilsulfóxido (DMSO) y se cuantifico la
absorbancia de cada uno de los pozos a temperatura ambiente a una longitud de onda de
570 nm y una sustracción del ruido de fondo
a 630 nm en el lector de elisa StarFox2100,
Awareness. Adicional a esta prueba de viabilidad, se hizo el ensayo de exclusión azul de
tripán. Las Células U937 se estimularon bajo
las mismas condiciones anteriores y fueron
tratadas con azul tripán 0.25% en RPMI (1:1),
100 μl por pozo, el cual se incubó durante
5 minutos a temperatura ambiente, se retiro este medio y se observó al microscopio.
RESULTADOS
Cultivo de macrófagos humanos U-937.
El establecimiento del cultivo celular permitió
la observación de la monocapa de U937 fuertemente adherente y saludable. Para todos
los experimentos se usaron células entre los
pasajes 2 y pasaje 4, los cuales conservaban
las características propias de la línea celular y
mantenían una tasa eficiente de proliferación.
Para evaluar el efecto de los LPS sobre la viaLa intensidad de las bandas fueron anali- bilidad celular, las células U937 fueron cultizadas por medio del programa ImageJ vadas y estimuladas con 100ng/ml con LPS
(disponible
online:
http://rsb.info.nih. de E. coli y P. gingivalis, y posteriormente
gov/ij/download.html), en donde se nor- fueron medidos viabilidad con azul de Tripán
malizaron los valores de las intensidades y MTT. El resultado con azul de tripán y con
de cada una de las bandas de los tratamien- la prueba MTT muestra una alta viabilidad en
tos con respecto al housekeeping β-actina todos los tratamientos (datos no mostrados).
y se compararon directamente entre ellos. Por ende, se puede afirmar que los LPS en este
estudio no alteran la viabilidad de las células.
Prueba de viabilidad celular MTT y el
método de exclusión azul de Tripán. La estimulación de U937 con LPS induce
Para cuantificar la viabilidad se llevó a cabo una respuesta diferencial.
una prueba de MTT (30). Las células fueron
sembradas en cajas de 96 pozos y luego de Debido a que los macrófagos son células
ser sometidas a la estimulación del LPS du- sensibles a patrones moleculares asociados a
rante 6 horas, se remplazó el medio por MTT patógenos (PAMP), se analizó la expresión
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del RNAm (TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10,
IL-12p40) bajo las condiciones de estimulación por LPS de P. gingivalis y E. coli durante 3, 6, 12 y 24h a 100ng/ml y 6h a 0.05ng .
Las células U937 fueron cultivadas en placas
de 6 pozos con medio RPMI suplementado
con suero fetal bovino (10 %) y antibiótico e
incubadas a 37°C y 8 % de CO2 hasta alcanzar
una confluencia (90%). La respuesta de U937
tras la estimulación por 3, 6, 12 y 24h con LPS
de P. gingivalis, indujo la expresión de las citocinas TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-8, mientras que
no se observó la expresión de IL-10 ni IL-12.
De acuerdo al análisis por imageJ, la variación
más importante durante la expresión inducida
por este LPS, son los valores obtenidos para
TNF-α que presenta la mayor expresión obte-
nida a las 3 horas de estimulación y luego decae
su expresión, Por otro lado esta la expresión
fuerte de IL8 a las 6 horas que se mantien constante hasta las 12 h y luego decae (figura 1.A).
Para el caso de E. coli existen cambios
apreciables en los resultados; la desaparición de la expresión de TNF-α, y una expresión más marcada a través del tiempo
para IL-8 en presencia del LPS (figura 1.B).
El resto de citocinas (IL-1, IL-6) para los
dos tratamientos se comportan de manera
muy similar entre tratamientos y controles,
lo que imposibilita un análisis más detallado
de su comportamiento a través del tiempo.
Fig. 1. Cinética de citocinas en macrófagos humanos u937 por LPS de P.gingivalis y
E.coli. Expresión relativa analizada con ImageJ a diferentes tiempos de estimulación
con LPS de P.gingivalis y E.coli. LPS:muestras tratadas con 100ng de LPS. O:
muestras sin estimulo.
Sebastian - Evaluación de la expresión de citocinas | 37
Por último, se logró apreciar niveles de esta débil y dejando claro que la expresión
expresión de IL-1, IL-6 e IL-8 a 6h post de dichas citocinas están mediadas por
estímulo con 50pg de LPS de E. coli y la concentración del estímulo (figura 2).
P.gingivalis, donde se encontró una respu-
Fig.2. Expresión de citocinas en macrófagos humanos u937 por LPS de E.coli
y P.gingivalis a 50pg/ml. Expresión relativa analizada con ImageJ a diferentes tiempos de estimulación con LPS de E.coli.PG: estimulación con LPS
de P.gingivalis. EC: estimulación con LPS de E.coli. O: sin estimulo de LPS.
DISCUSIÓN
Los esfuerzos por entender la asociación entre
la enfermedad periodontal con el riesgo cardiovascular no solo han revelado el nivel de
relación entre ellas, sino además, las complicaciones que desarrolla dicha enfermedad en
nuestro organismo (9). La línea celular U937
ha sido utilizada recientemente como modelo
de estudio de respuesta a antígenos virales y
a alergénos (31,32), pero no ha sido valorada
completamente en respuesta a factores de virulencia bacterianos. Es por esto que la idea de
valorarla in vitro resulta fundamental y ayuda
a la comprensión del efecto del sistema inmune
frente a los diferentes factores de virulencia.
Muchos estudios realizados sobre macrófagos,
sugieren que el LPS es una fuente inductora de
respuesta, y no un factor que induce muerte celular. Ferrari et. Al (33) (1990) demostraron por
ensayos de citotoxicidad MTT que la estimulación con LPS induce a la activación fagocítica
de los macrófagos en vez de inducir su muerte.
En este estudio se encontró la expresión de
mRNA de IL-1β, IL-6, IL-8 y TNF-α en la
línea celular U937 bajo estímulo de LPS de
P. gingivalis, mientras que no se encontró
la expresión de TNF-α tras el estímulo con
LPS de E.coli. Agarwal et. al;(34)(1995) encontraron concordancia entre la expresión de
mensajeros para IL-1β, IL-6, IL-8 y TNF-α en
monocitos humanos estimulados con LPS de
P. gingivalis y E. coli bajos las mismas con-
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diciones, mostrando una expresión más marcada de dichos mensajeros bajo el estímulo
de P. gingivitis esto muestrala tendencia por
parte de los monocitos a tener una mayor inducción de respuesta en presencia de altas
concentraciones de LPS, lo que explica el
comportamiento diferencial en la expresión
de mensajeros de citocinas (IL-1β, IL-6, IL-8
y TNF-α) cuando fueron valoradas con diferentes concentraciones de LPS. Además, existieron diferencias en la inducción de respuesta
en las células U937 entre los LPS analizados;
esto sugiere que la estimulación por LPS con
estructura clásica (E.coli) induce una repuesta diferente a la de los LPS con estructura
no clásica (P. gingivalis), ya que esto dependerá de la configuración estructural del LPS
inherente a una especie (35-37). El TNF-α
es un marcador de respuesta inmune innata
característico a estímulo por LPS de E. coli,
sin embargo bajo las condiciones experimentales del presente trabajo esta citocina no fue
expresada por las U937 con LPS de E. coli.
Sin embargo cuando se valoró la expresión de
esta citocina por monocitos aislados de sangre
periférica se demostró que el LPS de E. coli a
una concentración de 100ng/ml inducia la expresión de TNFα luego de 6 horas de estimulo
(datos no mostrados). Estos resultados siguieren que el modelo de macrófago de U937
debido tal vez a su naturaleza tumoral, presenta alguna alteración molecular que le impide responder a este LPS secretando TNFα.
concentraciones de 50 pg/ml. Estas concentraciones bajas de LPS a nivel sistémico son
consideradas como de riesgo cardiovascular (39). Por tanto la expresión de citocinas
por macrófagos a están concentraciones resaltarían el papel de endotoxemias causadas
por microorganismos periodontopaticos y
su intervención en la enfermedad cardiovascular en pacientes con periodontitis como
ha sido sugerido en otros estudios (40).
El resultado de la no expresión de TNF-α
bajo el estimulo de LPS de E.coli, puede estar reafirmando lo mostrado el trabajo de
Sharif et.al;(24)(2007), quienes plantean
que la línea de macrófagos humanos U937
se diferencian de la línea THP-1 del mismo tipo celular con respecto a la regulación
y expresión de ciertos genes controlados
por el factor NF-κβ, principal factor transcripcional que regula la respuesta a LPS.
Con referencia a los diferentes tiempos de evaluación, Cassatella et.al;(38)(1993) afirma que
cada tipo de célula inmune, expresa de manera
diferencial las citocinas dependiendo de su rol
en el sistema, así mismo varia la intensidad de
la señal dependiendo del tiempo de exposición,
concentración y tipo de estímulo. Los resultados aquí mostrados difieren de esta idea para
IL-1β e IL-6 pero reflejan lo obtenido para
TNF-α e IL-8. Esto puede explicarse debido
a la posibilidad de tener la presencia de interferencias en los medios de cultivo utilizados.
Por último cabe destacar la capacidad de las
U937 de inducir la transcripción de genes de
citocinas proinflamatorias tras el estímulo a
CONCLUSIONES
Basándose en esta evidencia y aclarando
que la línea THP-1 se asimila mas al modelo in-vivo de macrófago, podemos afirmar
que la línea U937 podría tener algunas características aberrantes (proveniente de una
línea celular tumoral) que limitan la evaluación de algunas citocinas al tener ciertos
dominios o proteínas alteradas que la diferencian de su par. Esto podría ser una sugerencia para resolver lo encontrado en el caso
de TNF-α por estimulo de LPS de E.coli.
La línea celular de macrófago U937 es útil
para el estudio de la expresión de citocinas bajo el estímulo de lipopolisacáridos de
bacterias periodontopáticas. La línea celular de macrófago U937 expresa citocinas
aun en bajas concentraciones de LPS consideradas como de riesgo cardiovascular.
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