Download SB-1 - Avicol

Actualidades en Enfermedades
Tumorales y su efecto en la
Producción de Huevo Comercial
Taylor Barbosa
DVM, MS, PhD, Dipl. ACPV
Sr. Manager, Tech Services Bio-Devices
Latin America
1
Enfermedades Tumorales en Avicultura
• Formación genética
– Edad
• Origen infeccioso
– Enfermedad de Marek
– Leucosis Aviar
– Reticuloendoteliosis
2
Enfermedad de Marek
• Enfermedad altamente infecciosa
– Inmunodepresión
– Signos nervosos: Parálisis
– Lesiones cutáneas
– Problemas locomotores
– Tumores en vísceras
• Impacto económico:
– La enfermedad avícola más
importante en el mundo
– Pérdidas económicas anuales
estimadas en 1.5 M Millones de
Euros (1% de la producción)
3
El virus
• Herpesviridae
• Alphaherpesvirus
• Cadena doble de DNA
• 140Kb
• 90 genes
• Asociado a células
• Latencia en linfocitos
• Gene oncogénico: meq
• Capacidad neoplásica
• Ubicuo
• Infecta primariamente a las gallinas
4
Patogenia de la Enfermedad de Marek
Virus libre
Folículo da pluma
Macrófagos del
Pulmón
Viremia
Bursa de Fabrícios
Latencia
T
Viremia
B
Citólisis
Inmunosupresión
5
Curso de la infección
1. Infección Citolítica (Síndrome Linfodegenerativa)
• Destrucción de células B
• Intensidad dependiente de la genética del ave/ virulencia de la cepa
• Parálisis temporaria (vasculitis y edema cerebral)
• Inmunodepresión transitoria
2. Latencia
• Ocurre simultáneamente a la segunda ola de infección citolítica
• Inmunodepresión permanente
3. Fase de Transformación
• MDV transforma principalmente células T CD4+
• Linfomas pueden ocurrir en cualquier tejido, observados
macroscópicamente a partir de 3 semanas
• Signos clínicos variables o inespecíficos (correspondiendo a
los órganos y sistemas afectados
6
Objetivos de la vacunación
• Brindar una respuesta inmune activa
sólida a partir de los primeros días de
edad
• Disminuir la intensidad de la fase citolitica
(3-6 días después de la infección por vía
respiratoria) y por consecuencia los
efectos de la inmunodepresión
• Limitar la viremia del vMDV asociado a los
linfocitos CD4+
• Prevenir la formación de tumores
7
Tipos de Vacunas
•
•
•
•
•
•
•
•
Serotipo 1 CVI-988 Rispens (bajo pasage)
Eficacia
Serotipo 1 CVI-988 Rispens (alto pasaje)
Bivalente (Serotipos 2+3)
Vacunas con cepas de campo atenuadas (productos
experimentales/ no disponibles comercialmente)
– Ejemplo: Md11/75C/R2
Serotipo 1 Clonado con pasaje reversa en aves
– Clone C/R6: 6 “back passages”
Serotipo 3 monovalente (HVT)
Serotipo 2 monovalente (SB1 o 301 B/1)
Serotipo 1 Clone C (no disponible)
8
Vacunas x Virus de Campo
Rispens
Bivalente
HVT
?
VV+
VV
Virulencia
Relativa
V
M
1940
1960
1980
2000
2020
R.L.Witter
9
% Protection
Eficacia de las vacunas:
% Protection contra 5 cepas vvMDV
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
CVI-988
HVT/301B/1
HVT
Clone C
Reto: 5 días de edad
R.L. Witter et al. 1992
10
Cambios en la vacuna asociados con el aumento del
nivel de pasaje del virus semilla (MSV)
Que es lo que AUMENTA?
Tamaño del PFU
Titulo de la vacuna
(facilidad del conteo)
Requerimientos para
Dosis Minima
Proporción de Virus
libre de celula
11
Eficacia de las vacunas:
Número de Pasajes MSV x Tamaño del PFU
0.6
0.5
(mm2)
0.4
0.3
0.2
0.1
0
SB-1 (11)
SB-1 (23)
Witter, Avian Diseases 31: 752-765
SB-1 (64)
SB-1 (98)
Control (HVT)
(PASAJE)
12
Cambios en la vacuna asociados con el
aumento del nivel de pasaje del virus semilla
Que es lo que DISMINUYE?
Inmunogenicidad
Capacidad de
Replicación “in vivo”
Transmisión lateral
Tiempo para
formación de placas
13
Eficacia de las vacunas:
Número de Pasajes MSV x %Protección
100
SB-1 (23)
90
SB-1 (64)
80
SB-1 (98)
70
%
Protection
60
50
40
30
20
10
0
JM/102W
Witter, Avian Diseases 31: 752-765
MD5
Virus de Desafío
14
Diagnostico y monitoria de la enfermedad
• Procedimientos de vacunación
• PCR de pluma
• Necropsias de rutina
15
Feather PCR
Prueba Cuantitativa
– Real Time PCR amplifica una secuencia blanco en el genoma viral:
• Meq gene: especifico de los MDV-1
• sORF1:
especifico del HVT
– Reacción PCR duplex: concentración del DNA del ave x DNA viral
Prueba Cualitativa
– Diferencia entre cepas vacúnales (Rispens) vs cepas de campo
MDV-1 Virus de campo:
1 o 2 “repeats”, 1 banda
MDV-1 vacuna RISPENS:
•3 a 8 repeats, “Ladder” patrón
16
Feather PCR: Procedimiento de toma de
muestras
• Bazo: sitio predominante de replicación del MDV
• La carga de genoma viral en las plumas presenta
correlación directa con la del bazo*
• Método de muestreo conveniente y no invasivo
– Aves con 2 a 4 semanas
– 10 plumas de tracto axilar
– Seleccionar plumas en crecimiento que llevan pulpa
– Colocar las muestras en tubos individuales
– 20- 50 aves por lote
* Baigent SJ, Smith LP, Currie RJ, Nair VK : “Replication kinetics of Marek's disease vaccine virus in feathers and
lymphoid tissues using PCR and virus isolation.” J Gen Virol. 86(11):2989-2998
17
Feather PCR:
Ejemplos de aplicación práctica
• Estudios Inmunológicos:
– Intensidad de la respuesta inmune
– Efecto de una misma vacuna en distintas líneas genéticas
– Efecto de distintas vacunas en una misma línea genética
– Eficacia de distintos planes vacúnales
• Estudios epidemiológicos
• Estudios comparativos:
– Incrementos en la dosis
– Revacunación
– Doble vacunación
18
Feather PCR:
Ejemplos de aplicación práctica
Mean MDV copy no/million cells
Fort Dodge
4 GENETICAS
x 1 vaccine
VACUNA
4 000 000
3 500 000
3 000 000
2 500 000
2 000 000
1 500 000
1 000 000
500 000
0
0
10
20
30
Broiler breed 1
Broiler breed 2
Layer breed 1
Layer breed 2
40
50
19
Feather PCR:
Ejemplos de aplicación práctica
Mean MDV copy no/million cells
1 GENETICA PONEDORAS x 3 VACUNAs
4.000.000
3.500.000
3.000.000
2.500.000
2.000.000
1.500.000
1.000.000
500.000
0
0
10
20
Vacc 1
Vacc 2
30
40
50
Vacc 3
20
Diagnostico
• Diferenciar enfermedad vs Infección
• MDV causa varías síndromes
- No neoplásica (Síndrome linfodegenerativa - Inmunosupresión)
- Neoplásica
• Edad del ave
- clásico hasta las 18 sem, pero hay caso en ponedoras viejas
(>80sem)
• Histórico del lote y de la raza
21
Enfermedad de Marek: Comentarios finales
• La incidencia de la enfermedad en pollos de engorde en general ha
disminuido en muchos países (hay excepciones !)
• Brotes en ponedoras comerciales siguen siendo frecuentes
• La casuística de la forma clásica con formación tumoral ha sido
relativamente bien controlada por los planes de vacunación actuales:
– Movimientos de regreso al uso de dosis completa
– Tendencia de reducción en la dilución de las vacunas
– Equipos de vacunación SC más calibrados (SOP’s)
– Avanzo en la adopción de la tecnología IN-OVO
– Elección de cepas con bajo pasaje
• La presión por la selección de nuevos patotipos del MDV en campo es
un riesgo siempre presente en la avicultura moderna
22
Retrovírus
Leucosis Aviar
Reticuloendoteliosis
23
Retroviroses
• Grande familia de virus cubiertos
• Dos copias de ssRNA
– 7 kb a 12kb
– Linear, no-segmentado
• 80 – 120 nm de diámetro
• Transcriptasa reversa
– De ssRNA para dsDNA
• Integración del dsDNA en el genoma celular “pro-vírus”
24
Classificacion de los Retrovírus
Exogenous
Alpharetrovirus
Leucosis Aviar
Endogenous
Retroviridae
Betaretrovirus
Virus Tumor Mamario
del ratón
Gammaretrovirus
Reticuloendoteliosis
virus
Deltaretrovirus
Virus Leucemia Bovinos
Epsilonretrovirus
Sarcoma de los peces
Walleye
Lentivirus
HIV
Spumavirus
Virus esponjoso del
Chimpance (foamy virus)
25
Leucosis Aviar
26
Clasificación
Exógenos
◦ Mayoría es competente para replicación
◦ Subgrupos
Basado en la proteína del cubiertos y en la capacidad de reconocimiento del
receptor celular
A
B
C
D
J
Endógenos
◦ Secuencias virales integradas en el cromosoma de la mayoría de las
aves (gallinas)
◦ Antes de la domesticación de la especie
Subgrupo E
27
Clasificación
Sub-grupo
Tipo
Espécie
Obs
A
Exogenos
Pollos
Mas comunes en Leghorns
B
Exogenos
Pollos
Segundo mas comun
C
Exogenos
Pollos
Raro
D
Exogenos
Pollos
Raro
E
Endogenos
Pollos
Herencia Mendeliana
F
Endogenos
Faisões
G
Endogenos
Faisões
H
Endogenos
Perdiz
I
Endogenos
Codonices
J
Exogenos
Pollos
Lineas pesadas
28
Impacto económico
• Mortalidad asociada con presencia de tumores
• Mortalidad en Machos con o sin tumores
• Aves adultas
– Diminución del tamaño de producción de huevos
• Pollitos
– Desuniformidad
– Mortalidad
– Inmunosupresión
29
Transmisión
• Vertical
– Genética
• Endógenos
• Cromosoma
– Congénita
• Exógenos
• Albumina
• Horizontal
– Contacto con animales infectados o secreciones
30
Patogénesis
• Tipo de virus
• Dosis
• Rota de infección
• Edad de exposición
• Forma de transmisión
• Infección doble
• Estado inmune de la ave
• Sexo de la ave
31
Patogénesis
Leucosis linfoide (Células B)
Eritroblastosis (eritrocitos inmaturos)
Mieloblastosis (macrófagos inmaturos)
Mielocitomatosis (macrófagos inmaturos)
Nefroma (células renales inmaduras)
Tumores de tejido conjuntivo
Fibrosarcomas y Mixosarcomas
Tumores epiteliales
Osteopetrosis
Endoteliomas
32
Lesiones ALV - Linfóide
Hígado
Bursa
® G. Zavala
33
Lesiones – ALV-J
Riñon
Hígado
® G. Zavala
34
Diagnóstico
• Lesiones macroscópicas
• Histopatología
• Aislamiento viral
– Plasma, suero, meconio, hisopos, tumores
• Fibroblastos de linajes susceptibles
• 7-9 días de incubación
• ELISA de captura
• Neutralización viral
• Detección de RNA/DNA
• Serología
35
Control
Definición de los objetivos
◦ Controlar, Reducir o Erradicar
Valor económico
◦ Elevado número de muestras, diversas etapas da crianza
◦ Disminución del estoque genético
Principal punto es romper el ciclo de transmisión congénita
◦ Muestras siempre individuales
◦ Eliminación de aves positivas
◦ Mantener aves en grupos pequeños
Evitar transmisión horizontal
36
Reticuloendoteliosis
37
REV - Clasificación
Gamaretrovírus
◦ Retrovirus simples
Origen desconocida, mas probablemente adaptación de retrovirus
endógenos de mamíferos
Ausencia de formas endógenas
Único serogrupo
◦ Pequeña variación entre aislados
Antígeno específico
◦ p30
38
REV – Importancia económica
• Alta mortalidad
– Tumores
• Retraso en crecimiento
– Enanismo
• Problemas de emplume
– Síndrome Nakanuke
• Barreras internacionales
– Todas aves destinadas a exportación deben ser libres de
REV
• Pruebas para producción de vacunas y lotes SPF
– Contaminación relacionada en algunas ocasiones
39
REV - Epidemiologia
2006
2002
M
2002
1994
2006
J
M
M
2004
2006
2004
M
M
1980´s
J
= ALV-J+REV
® Dr. Zavala
= Contaminación vacuna
= Brote natural
M
= MDV+REV
40
Síndromes
1. Neoplasia reticular aguda
2. Enanismo
3. Síndrome neoplásico (tumores)
–
Linfocitos B e T
41
1. Neoplasia reticular aguda
• Cepa T
– Aislada de pavos
• Histórico de linfomas
– Defectuosa
• Necesita de un virus auxiliar para replicar
– Induce alta mortalidad (>6 días)
• Probablemente o mas patogénicos de todos los retrovirus
– Aumento en hígado y riñón
DNA Pro-viral de cepa defectiva (REV-T)
LTR
LTR
gag
pol/env
v-rel
env
42
2. Enanismo
• Inducido por varias cepas de REV
• Cepas no defectuosas
• Disminución del crecimiento
• Problemas de emplume
• Puede causar linfomas en las aves sobrevivientes
• Inmunosupresión
• Proventriculitis
® T.Barbosa
43
® Dr. Zavala
3. Síndrome neoplásico
• Inducido por varias cepas de REV
• Cepas no defectuosas
• Linfomas de células B
– Bursa involucrada
– Linfomas en vísceras
• Linfomas de células T
– Descrito en experimentos
– Normalmente por activación c-myc
Bazo- pollo
® Dr. Zavala
• Virus de Marek serotipo 2 puede potencializar la formación
de linfomas
44
Lesiones Macroscopicas – Experimental
Codornices 17
semanas
Infectado
Normal
® T.Barbosa
45
Lesiones microscópicas
Bursa- Pavo
PâncreasCodornices
Rinon-APC
® Dr. Zavala
46
Inmunosupresión
REV causa:
◦
Disminución de blastogénesis linfocitaria
◦
Interferencia con el sistema inmune
◦
Desregulación de citokinas
Disminución de la respuesta humoral
47
Genoma REV APC-566
48
Barbosa, et al. 2007
Secuencia del peptídeo de inmunosupresión
LTR
gag
pol
env
10
1
10
1
10
10
10
10
10
1
1
1
10
10
10
1
1
1
4
1
1
1
1
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1
1
1
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apc-566.pro
APC-745-ISP.seq
APC-793.pro
APC-782-ISP.seq
APC-853-ISP.seq
APC-854-ISP.seq
APC-947-ISP.seq
APC-951-ISP.seq
APC-976.pro
APC-1006.pro
APC-1011.pro
GPC-G99-ISP.seq
PMX-16-ISP.seq
PMX-19-ISP.seq
REV 397 A.pro
REV-A.pro
SNV.pro
AF246698 REV in Pox.pro
REV China.pro
MPMV.pro
AKV-murine endogenous.pro
MMCF.pro
AMCF.pro
FriendLV.pro
Gross LV.pro
FeLV.pro
MoLV.pro
HTLV-II.pro
HTLV-I.pro
CKS-17.pro
APC/GPC
Pollo /broiler
PAVOS
Pollos/Viruela
Retrovírus
Mamíferos
49
Barbosa, et al., 2007.
REV APC-566 Inmunosupresión
120
Anticuerpos (GMT)
100
ELISA
IBD
NDV
REV
NDV
HI
Sin Vac
5c
1b
1b
5c
REV
5c
1b
6034a
5c
REV+Vac
175b
112b
3949ª
54b
Vac
683a
867a
1b
149a
80
60
40
PM
REV+PM
REV+Vacina+PM
Vacina+PM
20
0
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Dia 4
Dia 5
Vacunacion y desafio PM
Respuesta vacuna inactivada
50
Diagnostico
• Similar a Leucosis
• Lesiones macroscópicas
– Involucra a la bursa o no
– Involucra dos nervios o no
– Linfomas de células B o T
• Aislamiento viral e identificación
– Fibroblastos
– Cultivar mínimo por 7 días
– IF, PCR, IHC
• RT-PCR o PCR de los tumores
® T.Barbosa
51
Control
• Muestrear los animales varias veces
• Infecciones en los primeros días
– Puede causar tolerancia
– Desarrollo de tumores
• Infecciones tardías
– Producción de anticuerpos
– Sin transmisión del virus
• Vacunar para Viruela
• Controlar insectos
52
Como saber cual enfermedad?
53
Diagnóstico diferencial
REV
Leucosis
Enfermedad de Marek
54
Diagnóstico diferencial
Leucose
REV
Enfermedad de Marek
55
Diagnóstico diferencial
ALV-J
REV
REV
ALV-A
ALV-A
ALV-B
ALV-C
ALV-C
ALV-D
ALV-J
ALV-C
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Diagnóstico diferencial
Histórico
Lesiones macroscópicas
Ojos y niervos
Histopatología
Población heteróloga (MD, REV no bursal)
Pobación homogénea (LL, REV bursal)
Imunohistoquímica
Técnicas Moleculares
Mas seguras y definitivas
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Muchas gracias !!!
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