Download procedimiento para reactivos externos

Actualizado el 21.5.04 por Alberto Crespo Guardo
PROCEDIMIENTO PARA REACTIVOS EXTERNOS
Cuando llega material externo (plásmidos, monoclonales, etc.) hay que operar sistemáticamente del
siguiente modo:
1º) ¿Tiene MTA? El MTA (Material Transfer Agreement) es un documento que limita el uso del
material a los trabajos del propio laboratorio al que ha sido enviado. Si viene acompañado de este
documento, archivadlo en la carpeta correspondiente con su acuerdo firmado.
2º) La documentación adicional (mapas, especificaciones, etc.) archivadla en la carpeta
correspondiente, anotando la localización física del material en la misma:
- Plásmidos
- Anticuerpos monoclonales
Hay que revisar esta documentación y actualizar los cambios que se lleven a cabo en el momento.
3º) Plásmidos:
Deben ir acompañados de una ficha resumen con los siguientes datos:
MTA: Si/No
Fecha: 01/01/2004
Nombre: e.g. hTERT
Origen: nombre de la persona que lo dona y lugar de trabajo
Uso: para tincion, citofluorometría, etc.
Cantidad: cuantos l
Condiciones de almacenaje (Storage): temperatura e.g. –20ºC
Persona responsable
Además de esta ficha, debe llevar el albaran de entrega junto al Data Sheet (o
información adicional). También es conveniente que vaya acompañado de un
PAPER en el que se explique la utilidad del reactivo en cuestión.
Elución de plásmidos:
- Cortar el circulito
- Añadir 50 l de 10 mM Tris pH 7,6
- Agitar en vortex y dejar rehidratar 5 minutos
- Centrifugar y recoger el sobrenadante.
 Para preparar 50 ml de Tris 10 mM:
121,14 g/mol * 0,01 mol/ ml * 50 ml = 0,06 g de Tris
Transformación bacteriana:
- Dejar descongelar en hielo, cuando están líquidas las bacterias se le agrega
el plásmido
- Mezclar las bacterias con DNA 30 minutos en hielo
- 2 minutos a 42 grados
- 3 minutos en hielo
- Se añade un ml de LB y se pone a 37 ºC, durante 1hora
- Se cogen 100 ml y se plaquea, extendiendo con un asa de Winogradsky
Creación de bacterias competentes:
- Crecer a la llama bacterias exponenciales (Xl1 Blue) en 10 ml de LB sin
antibiótico en un Falcon de 50 ml, toda la noche (overnight)
- Incubar 0,5 ml de este cultivo en 200 ml de LB sin antibiótico y crecer a
37ºC hasta que alcancen la densidad de 5*107 céls/ml. En ese momento la
Absorbancia 550 es de 0,3 – 0,4, medir cada 30 minutos y poner en aguahielo 10 minutos.
- Alicuotar en 4 Falcon de 50 ml y centrifugar 4000 g, 10 minutos a 4ºC.
- Descartar el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet celular en 10
ml de una solución estéril:
0,1 M MOPS (pH: 6,5)
50 mM CaCL2
10 mM RbCl2
- Colocar la suspensión bacteriana en hielo durante 15 minutos
- Recuperar las células por centrifugaciuón 4000 g, 10 minutos a 4ºC.
- Secar tanto como sea posible y resuspender en 0,2 ml (por cada mililitro de
partida) de estéril:
0,1 M MOPS (pH 6,5)
50 mM CaCL2
10 mM RbCl2
15% glicerol
- Alicuotar de 100 a 200 ml y congelar a –80ºC
4ª) Anticuerpos monoclonales:
Deben ir acompañados de una ficha resumen con los siguientes datos:
MTA: Si/No
Fecha: 01/01/2004
Anticuerpo: nomenclatura e.g. RW2-8C8
Especificidad e isotipo: e.g. -TCR, IgG1
Origen: nombre de la persona que lo dona y lugar de trabajo
Uso: para tincion, citofluorometría, etc.
Cantidad: cuantos l
Condiciones de almacenaje (Storage): temperatura e.g. –20ºC
Persona responsable
Además de esta ficha, debe llevar el albaran de entrega junto al Data Sheet (o
información adicional). También es conveniente que vaya acompañado de un
PAPER en el que se explique la utilidad del anticuerpo en cuestión.