Download Sistema de componentes de fase solida para T4

Diagnostics Division
13 Mountain View Avenue
Orangeburg, NY 10962
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Sistema de componentes
de fase solida para T4
Catalog No.: 06G-254011 (100 Tube)
06B-254029 (200 Tube)
06B-254030 (500 Tube)
RIA HOT LINE U.S. ONLY: 1-800-431-1237
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SISTEMA DE COMPONENTES DE FASE SÓLIDA PARA T 4
El Radioinmunoensayo de T4 Monoclonal de ICN Pharmaceuticals se realiza para la determinación
cuantitativa de los niveles de tiroxina total en suero o plasma.
Resumen y explicación de la prueba
La tiroxina, el aminoácido iodado 3,5,3',5'-tetraiodo-L-tironina (T4), es, cuantitativamente, la iodotironina
predominante segregada por el tiroides1. Al pasar a la sangre se une, fuertemente y casi en su totalidad,
a proteínas plasmáticas específicas, especialmente a la globulina fijadora de tiroxina (TBG). Normalmente,
debido a la gran afinidad de la TBG por la T4, más del 99,9% de la T4 está en forma ligada y menos del
0,1% en forma libre. La T4 que permanece libre penetra rápidamente dentro de las células, ejerce la acción
hormonal y sufre transformación metabólica. Siempre y cuando se tengan en cuenta las posibles anomalías
de las proteínas transportadoras, la concentración sérica de T4 total tiene un alto grado de exactitud (> 90%)
en el diagnóstico del Liper e hipotiroidismo.
Fundamentos de la prueba
En el radioinmunoensayo (RIA) el anticuerpo utilizado tiene que tener la misma afinidad por el estándar que
por el ligando presente en el suero del paciente. El ligando no marcado, compite con la sustancia marcada
por el número limitado de puntos de unión del anticuerpo, reduciendo así la cantidad de sustancia marcada
que se une al anticuerpo. El nivel de radiactividad fijada está, por lo tanto, en relación inversa con la
concentración del problema en el suero del paciente o en el estándar. Tras un período de incubación
adecuado, se separan las fracciones libre y fijada y se cuantifica la radiactividad. El sistema de ICN
Pharmaceuticals para radioinmunoensayo [125I] de T4 (tiroxina) en fase sólida emplea tubos recubiertos con
anticuerpo monoclonal anti-T4.
Reactivos
Sólo para uso diagnóstico in vitro
1.
Tubos recubiertos de anticuerpos anti-T 4, No de catálogo 06B263676. Tubos de plástico
recubiertos con anticuerpo monoclonal anti-T4 (raton); 100 tubos por bolsa. Conservación:
almacenar a temperatura ambiente (18-25°C), en un sitio seco. No mezclar tubos recubiertos de
lotes distintos. Volver a cerrar los tubos restantes en su envase. Estabilidad: referida en la fecha
de caducidad del envase. Estabilidad después de abrirlo: dos meses.
2.
Estándares para T 4, A-F, No de catálogo 06B263666. Conteniendo L-tiroxina en suero humano*
con azida sódica** al 0,1 y otro conservante: 1,5 ml/vial (volumen mínimo). Un vial de cada estándar.
Conservación: Refrigerar a 2-8°C. Estabilidad: Referida en la fecha de caducidad en el vial.
1
Estándar
T4, µg/dl
T4, nmol/l (SI)
N° de catálogo
A
B
C
D
E
F
0
2
4
8
12
20
0
25,7
51,5
103
154
257
06B263667
06B263668
06B263669
06B263670
06B263671
06B263672
3.
Solución trazadora [125I] de T 4, N° de catálogo 06B263673. Contiene menos de 9 uCi (333 kBq)
por envase de derivado [125I] de tiroxina en tampón, pH 7,9, con ANS, sustancia colorante, facilitador
de la decantación, azida sódica** al 0,1% y otro conservante. Un envase contiene 110 ml, suficiente
para 100 tubos. Conservación: Refrigerar a 2-8°C. Estabilidad: Referida en la fecha de
caducidad en el envase.
*
PRECAUCION: MANIPULAR COMO POSIBLE TRANSMISOR DE INFECCIONES: El material
original del que se ha obtenido este producto no reaccionaba frente a HBsAG y era negativo en
anticuerpos anti-HIV cuando se analizó con reactivos autorizados. No se conoce nigún método que
asegure que los productos derivados de sangre humana no sean infecciosos. Consultar CDC/NIH,
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Publicación HHS N° CDC 84-8395).
**
ATENCION: Los reactivos contienen azida sódica. Esta puede reaccionar con las tuberías de
cobre y plomo, formando azidas metálicas, altamente explosivas. Cuando se desechen déjese
correr un gran volumen de agua para evitar la formación de dichas azidas. Muito tóxico em caso de
ingestao. Em contacto com ácido liberta um gaz muito tóxic. Após contacto com a pele, lavar
imediata e abundantemente com de agua.
Atencion: Contiene Material Radiactivo
Este sistema en fase sólida de ICN Pharmaceuticals contiene < 9 microcurios (333 kilobecquerelios) de
[125 I] por vial de trazador. Este material radiactivo sólo puede ser recibido, adquirido, poseido y utilizado
por médicos, laboratorios clínicos u hospitales para análisis clínicos y de laboratorio in vitro que no
impliquen la administración interna o externa del material o la irradiación, a partir del mismo, de personas
o animales. Su recepción, adquisición, posesión, uso y transferencia están sujetos a las normas y
regulaciones de la legislación española.
ICN Pharmaceuticals, Inc.
La adhesión a las reglas básicas de seguridad radiactiva proporciona adecuada protección. El usuario
puede dirigirse al National Bureau of Standards Handbook N° 92, "Safe Handling of Radioactive Material",
publicado el 9 de Marzo de 1964, Superintendent of Documents, U.S. Government. Printing Office,
Washington, D.C. 20402. A continuación se expone un resumen:
Ë No comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos cuando se utiliza material radiactivo. Ë No pipetear
soluciones radiactivas con la boca. Ë Evitar el contacto directo con cualquier material radiactivo, utilícense
artículos protectores como batas de laboratorio y guantes desechables. Ë Todo el trabajo radiológico debe
hacerse en áreas especiales, apartadas del paso de personas. Ë El material radiactivo debe ser conservado en sus contenedores originales en un área destinada a ello. Ë Debe existir un libro registro de
2
recepción y desecho de todo el material radiactivo. Ë Los aparatos de laboratorio y el material de vidrio
contaminados deben ser separados del resto del material para evitar la contaminación cruzada con
diferentes radioisótopos.
Ë Las salpicaduras deben procesarse inmediatamente, de acuerdo con los procedimientos establecidos.
Ë Todo el material radiactivo debe ser desechado de acuerdo con las normas establecidas por las
entidades correspondientes. Ë Los contenedores no contaminados pueden ser desechados como material
no radiactivo quitando las etiquetas.
Equipo y material necesario no suministrado
1.
Tubos de vidrio con vacío.
2.
Aspirador
3.
Pipetas semiautomáticas que puedan dispensar 25 µl y 1,0 ml o un pipeteador-diluidor automático.
4.
Contador gamma para [125I].
5.
Papel de gráficas adecuado: lineal, semilogarítmico o logit-log.
Extracción de la muestra
No se necesita preparación especial del paciente.
1.
Preparación de muestra para el análisis. Extraer la sangre en un tubo de 5 o 10 ml. Déjese
coagular la sangre a temperatura ambiente. Centrifugar 10 minutos y separar el suero o plasma.
2.
Envío de muestras: El suero, cuidadosamente empaquetado, debe transportarse a 2-8°C. Si el
transporte excede de 48 horas se debe congelar la muestra.
3.
Almacenamiento: Se puede almacenar el suero hasta 6 horas antes de analizarlo, a temperatura
ambiente (< 30°C), y hasta 48 horas entre 2 y 8°C. Si se piensa que el almacenamiento va a
superar las 48 horas hay que congelar la muestra (< 20°C). Evitar la congelación y descongelación
repetida.
Procedimiento
Llévense los reactivos y muestras a temperatura ambiente antes de utilizarlos pero, con el fin de minimizar
el deterioro, no deben ser mantenidos a esta temperatura más tiempo del necesario. No utilizar más
reactivos que los de este juego. Si se utiliza un pipeteador automático deben seguirse escrupulosamente
las instrucciones del fabricante para evitar la contaminación de una muestra a otra. Se deben analizar los
sueros controles simultáneamente, y de forma idéntica a las muestras de los pacientes. Se deben
hacer simultáneamente la preparación de la curva estándar y las determinaciones clínicas.
3
1.
Numerar una cantidad de tubos recubiertos de anticuerpo para la curva estándar y muestras de los
pacientes.
2.
Añadir 25 µl de estándar de T4 o muestra, según se expone en el esquema siguiente.
3.
Añadir 1,0 ml de trazador [125I] de T4 a cada tubo.
4.
Incubar a temperatura ambiente (18-25°C) durante 60 minutos.
5.
Al final del tiempo requerido de incubación aspirar totalmente el líquido de cada tubo o decantar,
dejándolos escurrir en posición invertida al menos durante 1 minuto. Sacudir y secar con papel de
filtro el líquido residual del borde de los tubos.
6.
Contar la radiactividad de los tubos, en orden, durante 0,5 minutos o más en un contador gamma.
El tiempo de recuento necesario para un nivel acumulado de Trazador (Estándar A) de 20.000 60.000 indicará el tiempo necesario en el contador gamma del usuario.
Radioinmunoensayo de [125I] T4 en fase sólida
Tubo
1, 2
3, 4
5, 6
7, 8
9,10
11,12
Muestra
paciente
Estándares
T4
25 µl A
25 µl B
25 µl C
25 µl D
25 µl E
25 µl F
Suero
paciente
-------------
---
25 µl
Trazador
Incubar
Añadir 1000 µl a
todos los tubos
Incubar todos
los tubos a
temperatura
ambiente 60
minutos
Aspirar o
decantar
Aspirar o
decantar todos
los tubos
Contar la radiactividad en todos los tubos.
Hacer los cálculos.
Dibujar la curva estándar y determinar los valores del paciente.
Cálculo de los resultados
Nota: No es obligatorio expresar el recuento en cuentas por minuto (cpm). Sin embargo el tiempo de
recuento debe ser constante en todos los tubos.
1.
Obtener la media de cuentas de los tubos 1 y 2 para obtener el "nivel de cuentas del Trazador" en
cada análisis.
2.
Dividir las cuentas de cada tubo por las del Nivel de cuentas del Trazador para obtener el % de Nivel
del Trazador para cada tubo.
4
3.
La curva estándar se puede representar utilizando papel logit-log, representado % del Nivel del
Trazador respecto a µg/dl de T4 estándar en la escala logarítmica. En la Tabla 1 se dan los datos
de recuento típicos. En la Figura 1 se muestra la representación de la curva estándar para estos
datos.
4.
La concentración de T4 del paciente se determina por interpolación en la curva estándar del % de
Nivel del Trazador en relación con los µg/dl de T4 (Figura 1).
5.
Se pueden utilizar métodos alternativos para representar una curva estándar, como cuentas por
minuto en relación con µg/dl de T4.
Limitaciones del procedimiento
1.
Hay que suspender el tratamiento tiroideo un mes antes del análisis si se quiere determinar el nivel
basal verdadero de T4.
2.
Muchas drogas y enfermedades coincidentes afectarán el nivel de T4 en el suero. Por tanto, los
niveles deben de ser interpretados segun la situación clinica del paciente.
3.
Los efectos fisiológicos de la T4 se basan en la concentración sérica de la fracción libre de T4, una
fración pequeña de la T4 total. La T4 total deberia ser siempre combinada con un ensayo de fijación
para contabilizar las anormalidades en las proteinas fijadoras a la T4 en suero.
4.
Las muestras clínicas que contengan radiactividad endógena pueden dar lugar a resultados
erróneos.
5.
Las muestras con valores superiores a 20 µg/dl deben diluirse 1/1 utilizando Estándar A de T4 para
obtener resultados más exactos.
Valores normales
Se analizó sangre de 205 individuos normales para T4 en el Radioinmunoensayo de ICN Pharmaceuticals
T4 MAb. También se analizaron sueros de pacientes clinicamente diagnosticados hipotiroides (n = 57) e
Lipertiroideos. Se obtuvieron los siguientes rangos ± 2SD:
Poblacón
Normal
Hipotiroidea
Hipertiroidea
Media
Rango
8,33 µg/dl
2,21 µg/dl
15,6 µg/dl
5 - 12 µg/dl
0 - 4,8 µg/dl
11,7 - 19,5 µg/dl
Los inividuos tratados con estrogeno y embarazadas han mostrado valores de T4 más altos que los
esperados para individuos eutiroideos.
Cada laboratorio deberia definir sus valores normales propios en un grupo de individuos entiroideos.
5
Si los datos de laboratorio son conflictivos con los hallazgos o impresiones clínicas, se debe seguir el juicio
clínico y realizar un nuevo análisis.
Características específicas del análisis
1.
2.
3.
Se han realizado estudios de recuperación mediante la adición de cantidades crecientes de Ltiroxina a una pequeña cantidad de mezcla de sueros.
T4 endógena
µg/dl
T4 añadida
µg/dl
T4 total
encontrada µg/dl
% de T4
recuperada
5,34
5,34
5,34
5,34
2,0
4,0
6,0
8,0
7,41
9,04
10,8
13,0
103
92
92
96
Los estudios de paralelismo se han realizado diluyendo una muestra clínica con estándar A de T4.
% Dilución
µg/dl esperados
µg/dl encontrados
diluyendo con estándar A
0
25
50
75
87,5
15,6
12,4
8,56
4,07
1,94
--106
110
104
99
Se analizaron muestras de 42 pacientes clinicamente diagnosticados Li- pertiroideos hipotiroideos
y de 70 voluntarios sanos, en el Radioinmunoensayo de ICN Pharmaceuticals: T4 Anticuerpo
Monoclonal en Fase Sólida y en otro kit de radioinmunoensayo de T4 disponible comercialmente.
Se obtuvieron los siguientes parámetros de correlación:
N = 111
Coeficiente de Correlación (r) = 0,974
Pendiente (b) = 0,76
Y-Intercesión = 0,71 µg/dl
En la Figura 2, se muestra un gràfics de regresión linear de estos datos.
6
Precisión:
1. Precisión intra-ensayo:
Muestras
Muestra n°
1
N° de determinaciones
Media µg/dl
D.S.
% CV
2.
2
20
8,88
0,51
5,7
20
2,84
0,23
8,1
3
4
20
10,4
0,45
4,3
20
14,3
0,47
3,3
Precisión inter-ensayo
Muestras
Muestra n°
1
N° de determinaciones
Media µg/dl
D.S.
% CV
2
150
2,82
0,32
11,3
150
8,78
0,61
7,0
3
150
14,0
0,74
5,3
Sensibilidad:
Sensibilidad, determinada por la concentración de veinte determinaciones de B o - 2 D.S. es 0,76 µg/dl de
T4
Especificidad:
El cero estándar para el ensayo fue analizado con varias cantidades de sustancias potencialmente
interferentes listadas abajo y analizado en el ensayo de la T4 Monoclonal. Se construyó y comparó una
curva estándar del reactante cruzado con una curva estándar de T4 realizada al mismo tiempo. El
porcentajè de reactividad cruzada mostrado abajo se calculó como la proporción de concentraciones al
cincuenta por ciento de fijación.
Compuesto
% reactividad cruzada
L-Tiroxina
D-Tiroxina
3,3'5-Triiodo-L-Tironina
3,5-Diiodo-L-Tironina
3,5-Diiodo-L-Tirosina
3-Iodo-L-Tirosina
Fenitoína
100
30,9
1,0
<0,002
<0,002
<0,002
<0,002
7
TABLE 1
[125I] T4 Monoclonal Solid Phase Radioimmunoassay
Tabulated Data
Tube No.
Trace
Level
Clinical
Sample
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Counts
per
Minute
A
43208
43222
35198
35669
28718
28537
19402
19976
15266
15236
9968
10715
Average
Counts
B
% of Trace
Level
A/B x 100
T4
µg/dL
T4
nmol/L
81.4
82.5
66.5
66.0
44.9
46.2
35.3
35.3
23.1
24.8
0
0
2
2
4
4
8
8
12
12
20
20
0
0
25.7
25.7
51.5
51.5
103
103
154
154
257
257
45.2
46.0
8.48
8.23
109
106
43215
19516
19885
8
Figure 1
Figure 2
9
REFERENCES
1. Chopra, I. J., Nature, source and biologic significance of thyroid hormones in blood. The Thyroid 4th ed.,
edited by S.C. Werner and S.H. Ingbar, Harper & Row, Hagerstown, 1978 p. 100.
2. Data on file at ICN Pharmaceuticals, Orangeburg, N.Y.
3. Chopra, I. J., A radioimmunoassay for measurement of thyroxine in unextracted serum. J. Clin.
Endocrinol. Metab., 34, 938-947, 1972.
4. Larsen, P.R., Dockalova, J., Sipula, D. and Wu, F.M., Immunoassay of thyroxine in unextracted human
serum. J. Clin. Endocrinol. Metab,. 37, 177-182, 1973.
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FAX 05651/921-151
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Tel: 0180/2306160
FAX 0130/868366
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QER 97-699
10
Revised 1/98
11