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Medición de corrientes de Calcio en la sinapsis de Held por patch clamp.
Objetivos: Evaluar las corrientes de Ca2+ voltaje dependientes y los potenciales excitatorios post
sinápticos en la sinapsis de Held utilizando la técnica de patch clamp
Introducción:
Aspectos generales de la transmisión sináptica
El término sinapsis define las zonas de contacto entre dos neuronas o entre una célula nerviosa y una
célula efectora (e.g. célula muscular, glándula), como el punto en el cual se produce la transmisión
(eléctrica o química) de información de una célula a la otra. El potencial de acción (PA) es el cambio
activo en el potencial de membrana producido por un movimiento de iones a través de ella (la entrada de
Na+ despolariza la membrana y la salida de K+ posterior la repolariza restaurando la distribución inicial
de cargas, Hodgkin y Huxley, 1952). En los axones los potenciales de acción son breves, viajan a
velocidad constante y mantienen una amplitud constante (Hille, 1984). La despolarización del terminal
presináptico causada por el arribo de un PA abre los canales de calcio activados por voltaje (VACC). La
entrada de calcio a través de ellos hace que las vesículas se fusionen con la membrana presináptica y
liberen el neurotransmisor (exocitosis). El neurotransmisor se liga a los receptores moleculares
postsinápticos provocando la apertura de canales y dando como respuesta una corriente postsináptica
excitatoria ó inhibitoria (EPSC ó IPSC).
Los canales de calcio
Los canales de calcio dependientes de voltaje (VACC) median la entrada de calcio a las células inducida
por despolarización de la membrana celular, actuando de esta manera como transductores de señales
eléctricas en señales químicas. En el sistema nervioso, estos canales controlan la mayoría de los procesos
dependientes de calcio, incluyendo la exocitosis de vesículas sinápticas (liberación de neurotransmisor),
la endocitosis, la excitabilidad y la plasticidad neuronal, la expresión génica dependiente de actividad, el
crecimiento de neuritas, la sinaptogénesis y la diferenciación y la supervivencia neuronales (Pietrobon,
2005).
Los VACC están compuestos por una subunidad transmembrana (formadora del poro) denominada α1, la
cual se asocia con subunidades auxiliares: una subunidad intracelular β y una subunidad extracelular α2
que se encuentra unida por puentes disulfuro con una subunidad transmembrana δ. La subunidad α1 está
estructuralmente organizada en cuatro dominios (I-IV), cada uno de los cuales contiene seis regiones
transmembrana (S1-S6) y un "loop" asociado a la membrana entre los segmentos S5 y S6 que tapiza la
cara interna del poro del canal (Catterall, 1998). Los dominios están conectados unos con otros por loops
peptídicos, los cuales son zonas aptas para interacciones proteína-proteína y, por lo tanto, para la
modulación del canal, para el direccionamiento del canal hacia su lugar de inserción final y para el
agrupamiento de distintos canales entre sí. El clonado de las subunidades del canal de calcio ha
identificado diez genes diferentes (CaV1.1 hasta CaV3.3) que codifican para la subunidad α1 (llamadas α1A,
α1B,....., α1S) en humanos. Las dos de mayor relevancia en términos de transmisión sináptica central son la
subunidad 1A de los canales neuronales P/Q (CaV2.1, codificada por el gen CACNA1A) y la subunidad
1B del canal neuronal N (CaV2.2, codificada por el gen CACNA1B) (Catterall, 1998).
Numerosos estudios de la relación estructura-función de las subunidades formadoras del poro han
permitido la identificación en cada segmento homólogo del segmento S4 como el sensor de voltaje
involucrado en la activación del canal.
Basándose en sus propiedades farmacológicas y en sus perfiles biofísicos, los VACC han sido
clasificados en los tipos T (transitorios), que son activados a bajos voltajes (-70 a -50 mV) y se inactivan
muy rápidamente (Akaike et al., 1989; Bean, 1989; Takahashi et al., 1991) y por otro lado, la familia de
los canales de calcio activados a potenciales de membrana más altos (-50 a -40 mV), que incluye a los
tipos L, N, P/Q y R (Catterall, 2000; Fox et al., 1987). La nomenclatura actual para designarlos los agrupa
en tres familias: CaV1 (a la que pertenecen los tres subtipos de canales L); CaV2 (a la que pertenecen los
canales P/Q, N y R) y CaV3 (a la que pertenecen los canales de tipo T) (Ertel et al., 2000). Los canales de
tipo N y P/Q muestran su mayor nivel de expresión en terminales presinápticos y están directamente
acoplados a la liberación de neurotransmisor (Wheeler et al., 1994; Westenbrook et al., 1992; 1995). Los
canales de tipo R se expresan en dendritas proximales y pueden, en ciertas neuronas, participar de la
liberación de neurotransmisor (Hanson y Smith, 2002).
Tabla 1. Nomenclatura para los canales de calcio activados por voltaje (VACC) conformados por las
subunidades 1
Activados a voltajes
altos
Activados a voltajes
bajos
Canal nativo
Subunidad 1
Sensibilidad
farmacológica
L-type
Cav 1.1
1S
dihydropyridines
Cav 1.2
1C
Cav 1.3
1D
Cav 1.4
1F
P/Q-type
Cav 2.1
1A
-agatoxin IVa
N-type
Cav 2.2
1B
-conotoxin gVIa
R-type
Cav 2.3
1E
snx-482
T-type
Cav 3.1
1C
mibefradil
Cav 3.2
1H
Cav 3.3
1I
Canales de calcio tipo P/Q y la liberación de neurotransmisores.
Los canales de calcio están localizados en alta densidad en los terminales nerviosos presinápticos y
median la entrada de calcio responsable de la liberación de neurotransmisores. Interactúan en forma
directa con proteínas de la maquinaria de anclado, fusión y liberación de vesículas sinápticas. Diferentes
tipos de la subunidad 1 se ligan, con distinta afinidad y dependencia al calcio, a proteínas sinápticas
como sintaxina, SNAP-25 y sinaptotagmina. Esto confiere diferentes propiedades regulatorias en la
liberación de transmisores mediada por distinta clase de canales de calcio (Catteral, 1999). Si bien varios
tipos de canales están involucrados en distintas sinapsis, durante el desarrollo se produce un cambio que
privilegia los canales de calcio tipo P/Q en la transmisión de la mayoría de las sinapsis centrales y
periféricas en mamíferos.
La sinapsis del cáliz de Held
El cáliz de Held es un terminal presináptico gigante en el tallo cerebral de mamíferos, perteneciente al
sistema auditivo, que forma una sinapsis glutamatérgica axo-somática sobre las neuronas principales del
núcleo medio del cuerpo trapezoidal (MNTB). Por su gran tamaño es posible acceder a él para realizar
registros electrofisiológicos y por ello ofrece una oportunidad única para profundizar el estudio de la
transmisión sináptica en neuronas del sistema nervioso central.
Materiales y métodos:
Se utilizan ratones de 11 a 15 días. Luego de la decapitación, su cerebro es removido y sumergido en un
fluido cerebroespinal artificial (aCSF) con bajo contenido de sodio, a 4°C. El tallo encefálico se fija con
pegamento a una platina, y se introduce ésta en la cámara refrigerante Peltier de un vibrátomo
(Integraslice 7550PSDS, Campden Instruments Limited, UK) con pegamento. Se cortan secuencialmente
rodajas transversales de 200-300 μm de espesor, conteniendo el MNTB ), y se las transfiere a una cámara
conteniendo aCSF normal, con bajo calcio y alto magnesio (0.1mM CaCl2 and 2.9mM MgCl2). Los
cortes se incuban durante 1 hora a 37°C y luego se dejan enfriar a temperatura ambiente. La solución
normal contiene (en mM): NaCl 125, KCl 2.5, NaHCO3 26, NaH2PO4 1.25, glucose 10, ascorbic acid 0.5,
myo inositol 3, sodium pyruvate 2, MgCl2 1 y CaCl2 2. En la solución de bajo sodio el NaCl es
reemplazado por 250 mM de sucrosa y las concentraciones de MgCl2 y CaCl2 son 2.9 mM y 0.1 mM
respectivamente. El pH es 7.4 cuando se lo gasifica con 95% O2 - 5% CO2.
Para realizar los registros, cada corte se traslada a la cámara de registro montada en un microscopio
vertical (BX50WI, Olympus, Japón). El microscopio está equipado con un sistema óptico de contraste por
interferencia Nomarski y las células se visualizan con un objetivo 40X ó 60X de inmersión en agua, más
una cámara de video CCD para infrarrojo cercano (IR-1000, DAGE-MTI).
Electrofisiología
Se utiliza la técnica llamada patch-clamp en configuración whole-cell. Básicamente, se accede a la
membrana celular con una micropipeta de vidrio y se forma un sello de alta resistencia (del orden de
varios G) y estabilidad mecánica. Luego el sello se rompe por succión accediéndose al interior de toda
la célula (configuración “whole cell”). Esto permite el intercambio de moléculas entre el citoplasma y la
solución interna con la cual se llena la pipeta. Las micropipetas se fabrican estirando capilares de
borosilicato (Harvard Apparatus, GC150F-15). La resistencia de las pipetas es de 3 a 4 M, cuando se las
llena con una solución interna que imita al citoplasma, particularmente en lo concerniente a sustancias
sujetas a transporte y metabolismo celular. Dicha solución contiene (en mM): CsCl 110, Hepes 40, TEACl 10, fosfocreatina 12, EGTA 1, MgATP 2, LiGTP 0.5 y MgCl2 1. El pH se ajusta a 7.3 con CsOH. Para
bloquear las corrientes de Na+ y evitar potenciales de acción postsinápticos, se agrega 10 mM N-(2,6diethylphenylcarbamoylmethyl)-triethyl-ammonium chloride (QX-314). Se añade también Lucifer
Yellow para visualizar el terminal presináptico por fluorescencia.
El sistema de medición consiste esencialmente en un amplificador operacional regenerativo Axopatch
200B (Axon Instruments, Union City, CA) que permite controlar el potencial de membrana (“voltaje
clamp”), y un conversor digital-analógico / analógico-digital (Digidata 1320, Axon Instruments) que
permite enviar las señales de potencial adecuadas al amplificador y digitalizar las señales de corriente
recibidas de éste. El control de instrumentos y registro de señales se realiza mediante el software pClamp
9.0 (Axon Instruments). La datos se adquieren a una frecuencia de 20-100 kHz y se filtran a 4-6 kHz
(Low pass Bessel).
Las corrientes de Ca2+ presinápticas (IpCa) son evocadas por depolarización de la membrana a distintos
potenciales, desde su potencial de reposo (-70 mV aproximadamente). Para aislar las IpCa se añade a la
solución externa inhibidores de los canales de Na+ (TTX, 1 mM) y de K+ (TEA-Cl, 10 mM).
Las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) son evocadas por estimulación de los axones que
atraviesan la línea media del MNTB, utilizando un electrodo bipolar de platino al que se le aplica una
diferencia de potencial (estímulos de 0.1 ms de duración, 4-7 mV) mediante una unidad de estimulación
aisladora.
Resultados e Informe de TP
En función de los datos obtenidos a distintos Vm deberán evaluar la relación entre corriente y voltaje para
los CCVV.
Evaluar las propiedades de activación de los CCVV
Evaluar los fenómenos de depresión de corto termino de las EPSCs por estimulación repetitiva