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PRACTICA 8: FIJACIÓN DE NITRÓGENO MOLECULAR (CARACTERIZACIÓN DE Azotobacter spp.
–Técnica de gránulos de suelo)
LAURA VELEZ
FARDY DIAZ
RESUMEN
Con el fin de aislar y caracterizar bacterias del genero azotobacter se realizo un muestreo de suelo de
tierra fértil, el aislamiento se realizo en medios Ashby sacarosa libre nitrógeno. Apartir del crecimiento de
los granulosy de la determinación de los granulos positivos de cada caja se realizo una segunda
siembras por aislamiento sobre una caja de pretri de Agar Ashby – benzoato se deja incubar por 7 dias,
se pueden observar crecimiento morfológico, macro y miscroscopica luego de realizar una tinción de
gram, para observar un bacilo gram negativo.
Azotobacter es un microorganismo habitante regular del suelo, fijador de nitrógeno y productor de
sustancias de crecimiento vegetal. Se encuentra asociado a la rizósfera (zona de raíces) y a las hojas
(filósfera) de muchas plantas, donde forma unas estructuras especiales llamadas ‘quistes’. Azotobacter se
puede aislar (extraer) del suelo cercano a las raíces de las plantas con técnicas y medios de cultivos ya
mencionados; en los medios de cultivo se caracteriza por presentar gránulos con pigmentos de color
marrones.
ABSTRACT
In order to isolate and to characterize bacteria of the kind azotobacter I realize a sampling soil of fertile
land, the isolation I realize in means Ashby saccharose free nitrogen. Apartir of the growth of the
granulosy of the determination of the positive granules of every box I realize a second you sow for
isolation on a box of pretri of Agar Ashby - benzoato it is left to incubate for 7 days, morphologic growth
can be observed, macro and miscroscopica after realizing a tint of gram, to observe a bacillus gram
negatively.
Azotobacter is a microorganism regular inhabitant of the soil, fastener of nitrogen and producer of
substances of vegetable growth. It is associated with the rizósfera (zone of roots) and with the leaves
(filósfera) of many plants, where it forms a few special structures called 'cysts'. Azotobacter can isolate (be
(extracted) from the soil near to the roots of the plants by technologies and means of already mentioned
cultures; in the means of culture it is characterized for presenting granules with brown pigments of color.
Palabras claves: azotobacter, ashby benzoate, ashby sacarosa.
OBJETIVO GENERAL
Aislar bacterias de vida libre del género
Azotobacter propias para la fijación de nitrógeno
a través de la técnica de gránulos de suelo.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Conocer los beneficios de la
especie de bacterias Azotobacter
para el desarrollo de las plantas.
METODOLOGIA
2. Recolectar muestras de suelo en
donde se encuentren bacterias
Azotobacter.
3. Realizar la técnica de gránulos de
suelo en el laboratorio.
4. Conocer
sobre
los
microorganismos fijadores de
nitrógeno.
5. Preparar el agar Ashby para el
desarrollo de Azotobacter.
Preparar sobre el agar Ashby con el asa caliente, pozos adecuados para
cada gránulo de suelo.
Aproximadamente 20 pozos
Realizar una siembra por
Aislamiento sobre una
Caja de petri de Agar Ashby
Benzoato.
Sobre cada pozo armado
Colocar un gránulo de suelo
Haciendo una leve presión
Hacia el fondo.
Observar alrededor de los
Gránulos colonias translúcidas
Y mucilaginosas
Observar crecimiento, morfología
Macro y microscópica (realizar
Tinción de Gram) y observación
De producción de pigmentos (en el
Medio Ashby--‐benzoato)
RESULTADOS
Imagen 1: Vista Azotobacter microscopio
Imagen 3: Muetras de suelo
Imagen 2: Gránulos sembrados en agar Ashby
Algunos trabajos de investigación con la utilización de
Azotobacter spp. han demostrado las bondades de este
género: reducción de la fertilización nitrogenada del 40%
e incremento de los rendimientos en 25 a 50% en
hortalizas; aumentos de 11% en el rendimiento de
zanahoria; de 44% en maíz; de 8% en arroz y
de 16% en cebada; así mismo,
se han demostrado efectos positivos en tomate,
ANALISIS DE RESULTADOS
Las bacterias nitrificantes constituyen un
conjunto muy diverso de bacterias. La segunda
edición del manual de Bergey situa los generos
nitrificantes en tres clases y varias familias:
Nitrobacter
en
Bradyrhizobyaceae,
alfaproteobacteria: Nitrosomonas y Nitrosospira en
Nitrosomonadaceae,,
Aunque
todos
los
organismos Gram negativos aerobios sin endo
espopras, capaces de oxidar amoniaco o nitriro se
diferencian de forma considerable. (Prescott, M)
Las bacterias encontradas en el microscopio no
presentasn enndoesporas, son gram negativas,
ahora bien las bacterias del genero Azotobacter no
requirieron nitrógeno para desarrollarse.
Orden Pseudomonadales
El genero Pseudomonas es el mas importante del
orden
Pseudomonadales,
familia
Pseudomonadaceae . El genero Pseudomonas
contiene bacilos gram negativos rectos o ligeramente
curvados, de una longitud de 1.5 a 5.0 micras, que
se despalzan mediante uno o varios flagelos polares
y carecen de prostecas o vainas. Estas bacterias
quicio heterotrofas son aerobiasy llevan a cabo un
metabolismo respiratorio utilizando oxigeno y a veces
nitrato como aceptor de electrones. (Prescott, M)
Las bacterias vistas en el microscopio del laboratorio
son bacilos gram negativos rectos, del genero
Azotobacter, porque las muestras para este
laboratorio fueron tomadas de suelos principalmente
al lado de las raíces de las plantas, también porque
estas bacterias contribuyen al crecimiento de las
plantas, facilitándoles el nitrógeno atmosférico.
El género Azotobacter tambien puede clasificarse en
la familia Pseudomonadaceae . Este género
contienen bacterias grandes y ovoides, de 1.5 a 2.0
micras de diámetro, que pueden ser móviles por la
presencia de flagelos peritricos. A menudo son
células pleomorfas, cuyas formas varían entre
bacilos y cocos, y forman cistos a medida que el
cultivo madura. (Prescott, M)
trigo, papa y girasol.
En el microscopio se pudo observar bacterias
ovoides, no se pudo estrablecer si habia
presencia de flgelos peritricos
Clasificación Taxonómica de Azotobacter
Joint Genome Institute (2009) y Uniprot
Consortium (2009) ubican a las bacterias del
género Azotobacter dentro de la siguiente
clasificación taxonómica
Dominio: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Pseudomonadales
Familia: Pseudomonadaceae
Genero: Azotobacter
Especies: A. vinelandii, A. chroococcum, A.
beijerinckii
Caracteristicas del genero Azotobacter
Azotobacter es un género de bacterias de vida
libre y que fijan nitrógeno atmosférico, que
pertenece a la clase Gammaproteobacteria.
Este género ha sido estudiado por más de cien
años, por científicos de todo el mundo (Setubal
2009)
Porque son bacterias o microorganismos
procariotas tienen una estructura morfológica
más simple que las bacterias eucariotas,
también son de las pocas bacterias con la
capacidad de fijar el nitrogeno atmosferico y
llevarselo a la biomasa vegetal para su
beneficio.
Estas son bacterias de vida libre que crecen
adecuadamente en medios sin nitrógeno. Utilizan el
nitrógeno atmosférico para la síntesis de sus proteínas
celulares. La proteína celular se mineraliza después de
la muerte de la célula, por tanto, contribuye a la
disponibilidad de nitrógeno para las plantas silvestres y
los cultivos agrícolas (Agronet Sofware Pvt, 2004)
Esto genera un proceso mas acelerado de crecimiento
de las plantas y en los cultivos agrícolas que también
los beneficia mucho, el uso de estas bacterias se
podría optimizar en la biotecnología agrícola por sus
propiedades ecológicas ya que no contamina el
medio ambiente y es un proceso natural.
Caracterización de Azotobacter
Para la caracterización macroscópica y
microscópica de los aislamientos para confirmar la
morfología típica de bacterias del género
Azotobacter. Paralelamente y como criterio de
selección, se evaluó el crecimiento en agar Ashbybenzoato luego de 36 horas y la estabilidad
de la pigmentación luego de tres pases sucesivos.
Se obtuvieron 15 aislamientos a partir de los
gránulos de suelo, de los cuales solamente dos
cumplieron con los criterios establecidos,
Solo salieron positivos dos puntos, de los cales
uno solamente se observo en el microscopio, de
pronto hubo errores en la costuccion de las cams
para los granos en las cjas de petri
CONCLUSIONES
1. Para la planta tener en su medio
Azotobacter, le genera beneficios tales
como: potenciar el crecimiento de las
plantas, también porque las bacterias
contribuyen al enriquecimiento de nitrógeno
de la planta, es decir facilitan la captación
de nitrógeno.
2. En los suelos alcalinos se pueden encontrar
a Azotobacter que son fijadores libres de
nitrógeno
es decir lo captan
independientemente sin que este asociado con
otro organismo, y lo liberan al medio en donde
las plantas lo captan.
3. La formación de halos transparentes es la
principal característica de bacterias en agar
Ashby, es decir se presencia el crecimiento de
colonias mucoides.
4. Después del ciclo del carbono, el 4 ciclo del
nitrógeno es la segunda ruta metabólica mas
importante para que halla vida en la tierra, ahora
bien la fijación del nitrógeno es hecho por pocos
microorganismos que son procariotas.
5. El agar Ashby-sacarosa y Ashby-benzoato son
claves en el desarrollo de Azotobacter , porque
tienen componentes claves en su estructura
quimica que brinda el nitrogeno suficiente para
que la cepa se desarrolle exitosamente
BIBLIOGRAFIA
1. Prescott M, Microbiología. 5ed.
Madrid, McGraw Hill, 540 -545p.
2. Egas, J. (2010)Efecto de la inoculación
de Azotobacter sp. En el Crecimiento
De Plantas Injertadas De Cacao
(Theobroma caco), Genotipo Nacional,
En La Provincia De Esmeraldas,
Escuela Politécnica Nacional, Quito,
Pag 16 – 20
3. Borda, D., Pardo, J., Martínez, M.,
Montaña J.(2009) Producción de un
biofertilizante a partir de un aislamiento
de Azotobacter nigricans Obtenido de
un cultivo de Stevia rebaudiana.
Pontificia Universidad Javeriana,
Bogota Pag 72 – 73
CUESTIONARIO
1. Investigue y a través de un gráfico explique el ciclo del
nitrógeno.
2. A través de consulta bibliográfica, proponga detalladamente
una metodología de identificación bioquímica, y una
metodología de identificación molecular del microorganismo
en estudio.
3. Explique el comportamiento Bioquímico y Fisiológico de la
enzima nitrogenada.
La reserva principal de nitrógeno es la atmósfera (el nitrógeno
representa el 78 % de los gases atmosféricos). La mayoría de
los seres vivos no pueden utilizar el nitrógeno elemental de la
atmósfera para elaborar aminoácidos ni otros compuestos metaloproteínas, la ferroproteína o nitrogenasa reductasa, y la
nitrogenados, de modo que dependen del nitrógeno que ferromolibdoproteína o nitrogenasa. La primera es un
existe en las sales minerales del suelo.
homodímero (alpha:alpha). Y la segunda un tretámero
(alpha:alpha:beta:beta) que contiene dos grupos P (PPor lo tanto, a pesar de la abundancia de nitrógeno en la
clusters), uno, (8Fe-7S) y el otro, (Mo:7Fe-9S): homocitrato,
biosfera, muchas veces el factor principal que limita el
crecimiento vegetal es la escasez de nitrógeno en el que constituye el cofactor conocido como FeMoco (cofactor
suelo. El proceso por el cual esta cantidad limitada de hierro molibdeno) a nivel del cual ocurre la reducción del N2
nitrógeno circula sin cesar por el mundo de los aunque se desconoce cómo y dónde se une el substrato y es
organismos vivos se conoce como ciclo del nitrógeno.
activado. La Feproteína, activada por ATP-Mg, transfiere los
electrones a la nitrogenasa que a su vez los distribuye entre
Amonificación
N2 y protones para dar amonio e hidrógeno. Esta reducción de
protones es siempre concomitante con la producción de
Gran parte del nitrógeno del suelo proviene de la
amonio. Supone una pérdida de eficiencia del proceso por la
descomposición de
la
materia
orgánica. Estos
compuestos suelen ser degradados a compuestos parte correspondiente de energía que consume (un 25 por
simples por los organismos que viven en el suelo ciento). Algunas especies y cepas microbianas estan provistas
(bacterias y hongos). Estos microorganismos utilizan las de una actividad hidrogenasa que recicla en parte la energía
proteínas y aminoácidos para formar las proteínas que perdida por la liberación de hidrógeno. La enzima nitrogensa
necesitan y liberar el exceso de nitrógeno como es facilmente inactivada por oxígeno, de tal forma que todos
amoníaco (NH3) o amonio (NH+4).
los sistemas fijadores han desarrollado estrategias especiales
para protegerse de concentraciones elevadas de este
Nitrificación
elemento y evitar su inactivación si es que se ha sintetizado,
Algunas bacterias comunes en los suelos oxidan el pues la expresión de los genes nif está estrictamente
amoníaco o el amonio. En ella se libera energía, que es regulada, tanto por oxígeno como por nitrógeno combinado a
utilizada por las bacterias como fuente energética. Un través del sistema Ntr-NifA. Estas estrategias van desde la
grupo de bacterias oxida el amoníaco (o amonio) a anaerobiosis total, como en Clostridium, a la producción de
nitrito (NO-2).
gran cantidad de polisacásridos extracelulares que hacen de
filtro para el oxígeno, exclusión metabólica (Azotobacter) o la
Otras bacterias oxidan el nitrito a nitrato, que es la forma
compartimentación, caso de las cianobacterias. En la
en que la mayor parte del nitrógeno pasa del suelo a las
simbiosis Rhizobium-leguminosa, la estructura del nódulo crea
raíces.
el ambiente microaerobio adecuado y la leghemoglobina
facilita el transporte de oxígeno al bacteroide para soportar el
Asimilación
metabolismo aerobio requerido para obtener la energía
Una vez que el nitrato está dentro de la célula de la necesaria para la reducción del N2. Los requerimientos de la
planta, se reduce de nuevo a amonio. Este proceso se fijación por el molibdeno fue ya señalada en los años 30 por
denomina asimilación y requiere energía. Los iones de Bortels, pero recientemente se han decrito nitrogenasas
amonio así formados se transfieren a compuestos que
alternativas en ausencia de molibdeno en el medio, que
contienen carbono para producir aminoácidos y otras
moléculas orgánicas nitrogenadas que la planta necesita. contienen otros elementos de transición, como vanadio o
hierro. Una vez descifrada la química de la fijación se podría
Los compuestos nitrogenados de las plantas terrestres abrir la posibilidad de un proceso industrial alternativo al de
vuelven al suelo cuando mueren las plantas o los Haber Bosch para la obtención de fertilizante nitrogenado.
animales que las han consumido; así, de nuevo, vuelven
a ser captados por las raíces como nitrato disuelto en el
agua del suelo y se vuelven a convertir en compuestos
orgánicos.
Enzima Nitrogenasa
La enzima nitrogenasa o nitrogenasa que cataliza la
reducción de N2 a amonio está constituida por dos