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INTRODUCCIÓN
El nitrógeno fue descubierto por el botánico escocés
Daniel Rutherford en 1772. Este científico observo que
cuando encerraba un ratón en un frasco sellado, el animal
consumía rápidamente el oxígeno y moría. Cuando se
eliminaba el aire fijo (CO2) del recipiente quedaba un aire
nocivo, el nitrógeno.
El nitrógeno constituye el 78% en volumen de la
atmósfera terrestre donde esta presente en forma de
moléculas de N2.
Propiedades:

Gas incoloro, inodoro, insípido compuesto por
moléculas de N2

Punto de fusión es de –210ºC

Punto de ebullición normal es de –196ºC

La molécula es muy poco reactiva a causa del fuerte enlace triple entre los
átomos de nitrógeno

El elemento exhibe todos los estadios de oxidación desde +5 hasta –3, los
estados +5, 0 y –3 son los mas comunes (HNO3, N2 y HN3 resp.) y estables.
El N es un elemento esencial para el ser humano, ya que es un componente de
casi todas las biomoléculas, como loas ácidos nucleicos y las proteínas. La mayoría
de los organismos vivos son incapaces de metabolizar el N2 debido a su inercia
química. Por lo tanto, la conversión de nitrógeno a formas metabolizables, como el
amoníaco, es esencial para el desarrollo y supervivencia de todos los organismos.
El NH3 se incorpora a los aminoácidos y proteínas y entran en la cadena
alimenticia. Los seres humanos
solo pueden sintetizar 11 de los
20 aminoácidos que se
necesitan para la síntesis de las
proteínas. Aquéllos que no se
pueden sintetizar de novo se
denominan aminoácidos
esenciales, ya que se deben de
obtener de la dieta. Además de
ser las unidades monoméricas
de las proteínas, los
aminoácidos son metabolitos
energéticos y son precursores
de muchos compuestos
conteniendo Nitrógeno, como el
grupo hemo, las aminas, el
glutatión, los nucleótidos y los
coenzimas nucleotídicos. El
exceso de aminoácidos no se
almacenan ni se excretan, se
1
convierten en precursores de otros metabolitos, como el Pyr, OAA y el αCG.
Por lo tanto los aminoácidos son también precursores de los ácidos grasos,
glucosa y cuerpos cetónicos, es decir, fuel metabólico.
Aunque es un elemento clave en los organismos vivos los compuestos de
nitrógeno no abundan en la corteza terrestre, los depósitos naturales de nitrógeno
son los de KNO3 en la India y NaNO3 en Chile y otras regiones desérticas de
América.
ADQUISICIÓN DEL
NITROGENO
El nitrógeno molecular, N2, es un macronutriente vital para todos los tipos de vida.
Casi todos los compuestos biológicamente activos con N lo contienen en forma
reducida, y por lo tanto, antes de que se pueda utilizar por los organismos, se tiene
que fijar, es decir, reducir desde N2 o [NO3]-hasta NH3 ([NH4]+), por los
microorganismos, plantas y descargas eléctricas en los relámpagos.
Las dos rutas para la adquisición del N en la biosfera son la asimilación del
nitrato y la fijación del nitrógeno. Ambas rutas dan lugar a la formación de amonio,
el cual es incorporado en los compuestos orgánicos.
La asimilación del nitrato ocurre en
dos pasos:
1) Reducción del nitrato en nitrito por 2 e-,
catalizado por la nitrato reductasa (dibujo), que
cataliza la reacción:
[NO3]- + 2[H]+ + 2e- → [NO2]- + H2O
La secuencia es la siguiente:
NADH → [-SH → FAD → cyt b557 → MoCo] →[ NO3]El coMo es un centro especial que contiene molibdeno. Las nitrato reductasas son
típicamente homodímeros 2 de 210-270 kD.
2) Reducción de nitrito en amonio por 6 e- catalizado por la nitrito reductasa:
[NO2]- + 8[H]+ + 6e- →
[NH4]+ + 2 H2O.
La secuencia es la siguiente:
Luz → 6 Fdred → [(4Fe-4S) → sirohemo] →[NO2]-
2
Las nitrito-reductasas son proteínas monoméricas de unos 63 kD con un sirohemo
y un grupo (4Fe-4S). En las plantas superiores la nitrito reductasa se encuentra en
los cloroplastos, donde está cerca de la ferredoxina que le proporciona los
electrones. La nitrato reductasa se encuentra en el citosol. Las nitrito reductasas
bacterianas son más complejas que las de las plantas superiores, pareciéndose a
las nitrato reductasas. La asimilación del nitrato es la forma predominante por la
cual los microorganismos, algas y plantas verdes adquieren el nitrógeno (99%).
La fijación de nitrógeno es la conversión del nitrógeno del aire (N2) a formas
distintas susceptibles de incorporarse a la composición del suelo o de los seres
vivos, como el ion amonio (NH4+) o los iones nitrito (NO2–) o nitrato (NO3–); y
también su conversión a sustancias atmosféricas químicamente activas, como el
dióxido de nitrógeno (NO2), que reaccionan fácilmente para originar alguna de las
anteriores. Menos del 1% del N asimilado en la biosfera pasa por esta vía. La
fijación de nitrógeno puede ser puramente abiótica o biológica:

Fijación abiótica: se forman óxidos como consecuencia de la combustión
de compuestos orgánicos, descargas eléctricas, etc., que son arrastrados al suelo
por la lluvia, o amonio por el proceso industrial Haber-Bosch.
Fijacion industrial
El principal proceso industrial de fijación de nitrógeno es el de producción de
amoníaco. Se realiza haciendo pasar una mezcla de nitrógeno atmosférico e
hidrógeno por un catalizador metálico a 500-600 °C. Después el amoníaco se oxida
a ácido nítrico, que al combinarse de nuevo con amoníaco rinde nitrato amónico,
que se utiliza como explosivo y como fertilizante.
La producción comercial de NH3 se lleva a cabo por el proceso Haber-Bosch:
N2 (g) + 3 H2 (g) → 2 NH3 (g)
La producción de cianamida es otro proceso industrial de fijación de nitrógeno y se
realiza haciendo pasar nitrógeno atmosférico sobre carburo de calcio caliente en
presencia de un catalizador. La cianamida se emplea como fertilizante y para
elaborar cianuro.

Fijación biológica de nitrógeno: Es un fenómeno fundamental que
depende de la habilidad metabólica de unos pocos organismos, llamados
diazotrofos en relación a esta habilidad, para tomar N2 y reducirlo a nitrógeno
orgánico:
N2 + 8H+ + 8e− + 16 ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16 Pi
La fijación biológica la realizan tres grupos de microorganismos diazotrofos:
1) Bacterias gramnegativas de vida libre en el suelo, de géneros como
Azotobacter, Klebsiella o el fotosintetizador Rhodospirillum, una bacteria purpúrea.
3
En el caso de bacterias del suelo, como Clostridium y Azotobacter, el amoniaco
queda fijado en él. La acción de los descomponedores sobre los cadáveres y los
productos de desecho del metabolismo también enriquecen el suelo en amoniaco
mediante un proceso que se denomina amonificación.
(
(Clostridium)
(Azotobacter)
2) Bacterias simbióticas de algunas plantas, en las que
viven de manera generalmente endosimbiótica en nódulos,
principalmente localizados en las raíces. Hay multitud de
especies encuadradas en el género Rhizobium, que
guardan una relación muy específica con el hospedador, de
manera que cada especie alberga la suya.
Rhizobium leguminosarum (foto) es una bacteria
simbiótica que se encuentra en unos nódulos que hay en las
raíces de las leguminosas; parte del nitrógeno que fija lo
cede a las plantas en forma de un componente soluble en el
citoplasma celular.
3) Cianobacterias de vida libre o simbiótica. Las cianobacterias de vida libre
son muy abundantes en el plancton marino y son los principales fijadores en el mar.
Además hay casos de simbiosis, como el de la cianobacteria Anabaena en
cavidades subestomáticas de helechos acuáticos del género Azolla, o el de algunas
especies de Nostoc que crecen dentro de antoceros y otras plantas.
A continuación se puede observar de manera aproximada las toneladas de N
fijadas por año:
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Y con esto entramos en el denominado ciclo del nitrógeno (fig. 1).
Fig. 1.- Ciclo del nitrógeno
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Casi todo el amoniaco que llega al suelo es pasado a ion nitrato por la acción de
otras bacterias. Este proceso (llamado nitrificación) se realiza en dos
partes:primero unas bacterias del género Nitrosomonas (dibujo 1) transforman el
amoniaco en ion nitrito (NH3 → [NO2]-) por nitrosación, y luego las del género
Nitrobacter (dibujo 2)
transforman
el
nitrito en nitrato por
nitratación
([NO2]→[NO3]-).
El nitrato constituye
la fuente principal de
nitrógeno disponible
en el suelo para las
plantas
superiores.
Existe otro proceso llamado desnitrificación, que transforma el nitrato en nitrito y
este en nitrógeno molecular, que vuelve a la atmósfera cerrándose así el ciclo. Este
proceso lo realizan las bacterias desnitrificantes, como las del género
Pseudomonas.
(Pseudomonas)
Todos estos sistemas requieren:
1. La nitrogenasa, la enzima que cataliza la reducción del N2 en amonio
2. Un reductor fuerte, i.e., ferredoxina
3. ATP
4. Condiciones anaeróbias
5. Controles regulatorios
En una primera aproximación, dos son los controles más importantes: ADP, que
inhibe a la enzima, por lo tanto la relación ATP/ADP regula la actividad de la
enzima, y el [NH4]+, que reprime la expresión de los genes nif (se conocen más de
20), los genes que codifican las proteínas del sistema fijador.
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ESTRUCTURA Y
PROPIEDADES DE LA
NITROGENASA
La nitrogenasa es un sistema bastante complejo, que está constituido por
dos proteínas separadas, ambas imprescindibles para la acción enzimática, y que
se denominan:
a) Componente I o nitrogenasa propiamente dicha; un tretámero () que
contiene dos grupos P (P-clusters), uno, (8Fe-7S) y el otro, (Mo:7Fe-9S)homocitrato, que constituye el cofactor conocido como co-FeMo (cofactor hierro
molibdeno) a nivel del cual ocurre la reducción del N2 aunque se desconoce cómo y
dónde se une el substrato y es activado. Es muy sensible al O 2. La enzima es muy
lenta: 12 pares de electrones por segundo y por enzima, o tres N 2 por segundo. Ya
que la actividad es tan baja, las células que fijan nitrógeno tienen una gran cantidad
de enzima, aproximadamente el 5% de la proteína total de la célula.
b) Componente II o nitrogenasa-reductasa, es un homodímero () que posee
átomos de Fe acomplejados con S de determinadas cisteínas (por lo que este
componente se denomina a veces ferroproteína). Es muy sensible al O 2. Se
requieren 4ATP por cada par de electrones transferidos. Como se necesitan 4 pares
de electrones, se consumen 16 ATP por N2 reducido. La necesidad de ATP es
paradójica, ya que la reducción del N2 a [NH4]+ es favorable termodinámicamente.
La solución está en la fuerza de la unión N≡N (225 kcal/mol) y por tanto se necesita
energía
para
romperlo.
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Mecanismo:
La Feproteína, activada por ATP-Mg, transfiere los electrones a la nitrogenasa
que a su vez los distribuye entre N2 y protones para dar amonio e hidrógeno. Esta
reducción de protones es siempre concomitante con la producción de amonio.
Supone una pérdida de eficiencia del proceso por la parte correspondiente de
energía que consume (un 25%). Algunas especies y cepas microbianas están
provistas de una actividad hidrogenasa que recicla en parte la energía perdida por
la liberación de hidrógeno.
No obstante el mecanismo sigue siendo poco claro y se siguen haciendo
investigaciones con modelos para entender como es que la molécula de nitrógeno
se enlaza. Lo que sí se sabe es que los electrones son transferidos, dentro del
sistema de fijación de nitrógeno, a través de la ferredoxina (in vivo) o por la
flavodoxina (in vitro), mediante la transferencia de un simple electrón a la proteína
de Fe, luego la proteína de Fe transfiere los electrones (uno a la vez) a la proteína
de MoFe, donde la N2 se transforma en NH3. La conversión de N2 a NH3 por las
nitrogenasas ocurre por una secuencia de reacciones de transferencia hidronioelectrones (los electrones son provistos a través del sistema transportador de
electrones y los hidronios son mediados por el solvente acuoso).
A continuación se pueden observar dos tipos de esquema para la reducción de
nitrógeno catalizada por la nitrogenasa:
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La reacción global quedará de la siguiente manera:
N2 + 8H+ + 8e− + 16 MgATP → 2NH3 + H2 + 16MgADP + 16 Pi
Gasto energético
Dos cosas llaman la atención de la ecuación anterior:
Obsérvese que la reacción requiere un gran aporte de energía en forma de al
menos 16 ATP (en ocasiones puede llegar a 24 ATP). Ello se debe a que el
dinitrógeno (N≡N) es una molécula extremadamente inerte (su energía de
disociación es de 940 kJ), y su reducción precisa una gran energía de activación
para transferirle 6 electrones.
Parte de la actividad nitrogenasa (así como ATP y electrones) "se pierden" en
reducir dos iones H+ hasta H2. Se desconoce la razón de este "despilfarro", pero se
sabe que es un efecto intrínseco de este complejo enzimático.
Los electrones para la reducción llegan al complejo por medio de una ferredoxina,
que los transfiere al componente II, que queda reducido al tiempo que por cada dos
electrones transferidos se hidroliza una molécula de ATP. La nitrogenasa-reductasa
reducida se asocia entonces con la nitrogenasa (=componente I), y le transfiere los
electrones. Una vez reducida la molibdoferroproteína, ésta transfiere los electrones
(y los protones) al N2, hasta convertirlo en dos moléculas de amoniaco. (El centro
activo es co-FeMo).
Sensibilidad al Oxígeno
La nitrogenasa purificada es inactivada rápida e irreversiblemente por el O 2. La
proteína Fe es mucho más sensible que la proteína MoFe con una vida media en
presencia de aire de 45 segundos y 10 minutos respectivamente. El efecto de O 2
sobre la nitrogenasa restringe la fijación de N2 en la mayoría de las especies de
eubacterias a condiciones anaeróbicas o de microaerobiosis.
La fijación de nitrógeno en bacterias aeróbicas como Azotobacter es un proceso
que demanda gran cantidad de energía, por lo que requiere una eficiente
fosforilación oxidativa. Debido a que el O2 es tóxico para el complejo de la
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nitrogenasa, las bacterias aeróbicas fijadoras de nitrógeno han evolucionado una
variedad de estrategias para contender con esta paradoja aparente.
A. vinelandii fija nitrógeno en aerobiosis
A. vinelandii era hasta hace poco la única bacteria reconocida capaz de fijar
nitrógeno en condiciones de total aerobiosis, recientemente se describió otro
sistema de fijación de nitrógeno tolerante a O 2 en Streptomyces
thermoaututrophicus. Azotobacter fija nitrógeno en aerobiosis gracias a que posee
un sistema bien integrado de protección de su nitrogenasa que comprende:
protección conformacional, protección respiratoria, autoprotección y otros cambios
morfológicos y fisiológicos que le permiten crecer diazotróficamente en condiciones
totalmente aeróbicas.
Protección conformacional.
En A. vinelandii un aumento pasajero del O2 provoca un mecanismo de
inactivación (switching-off) de la nitrogenasa, que consiste en la formación de un
complejo de nitrogenasa inactivado pero protegido, conocido como protección
conformacional. Este complejo es formado por la unión no covalente de una
proteína que contiene Fe-S (conocida como FeSII o Shetna) a las proteínas Fe y
MoFe.
Protección respiratoria.
Cuando las células se adaptan al ambiente de mayor concentración de O 2, se
expresa la citocromo oxidasa cytbd, parcialmente desacoplada con baja afinidad por
O2, la cual probablemente actúa junto con una NADH deshidrogenasa desacoplada.
El flujo de electrones a través de esta cadena desacoplada permite tasas de
respiración altas y un rápido consumo del O2 intracelular sin agotar las pozas de
ATP y NADH. La tasa respiratoria en condiciones de fijación de nitrógeno
atmosférico es 10 veces más alta que la tasa normal de muchas bacterias. Además
de reducir el O2 la citocromo oxidasa cytbd, funcionaría como un productor de ATP
rápido ya que se necesitan grandes cantidades de ATP para la autoprotección de la
nitrogenasa.
Autoprotección.
Si la concentración de nitrogenasa es lo suficientemente alta en relación a la
concentración de O2 celular, la nitrogenasa reductasa puede reducir O2 a H2O2 y
posiblemente a H2O y por lo tanto reduciría el O2 en la vecindad de la nitrogenasa.
Además el flujo constante de equivalentes reductores a través de la nitrogenasa
puede ayudar a mantenerla en un estado reducido. Este proceso conocido como
autoprotección requiere grandes cantidades de equivalentes reductores y ATP que
son los provistos por la rama cytab de la cadena respiratoria.
Especificidad
La nitrogenasa es una enzima relativamente "inespecífica", ya que puede reducir
otras pequeñas moléculas provistas de triples enlaces, como acetileno, protones,
trinitrógeno, alquilacetilenos, ciclopropeno,.... La reducción de acetileno a etileno
sirve de base al método más usual de medir la actividad nitrogenasa, el llamado
ensayo de reducción del acetileno, que se registra mediante aparatos de
cromatografía gaseosa.
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LA NITROGENASA Y LOS MICROORGANISMOS QUE LA POSEEN
MICROORGANISMO
BACILACEAS
Bacillus polymyxa
Clostridium
AZOTOBACTERIAS
Azotobacter
Azomonas insignis
Azotococcus agilis
Beijerinckia derxii
ENTEROBACTERIAS
Klebsiella pneumoniae
Enterobacter aerogenes
Erwinia herbicola
Citrobacter freundii
Azospirillum brasilense
TIPO DE METABOLISMO
AL FIJAR N
Aeróbico,
heterotrófico
Beneficios a cosechas no
confirmados
Anaeróbico
o microaerófilo
Importantes en la fijación
asociativa
Microaerófilo,
heterotrófico
STREPTOMICETACEAS
Frankia
Microaerófilo,
heterotrófico
METANOMONADACEAS
Methylocystis
Methylococcus
Microaerófilo,
autotrófico
TIOBACTERIACEAS
Thiobacillus ferrooxidans
Microaerófilo
Anaeróbico o
microaerófilo,
fotolitotrófico
CROMATIACEAS
Chromatium vinosum
Anaeróbico,
fotolitotrófico
CLOROBIACEAS
Chlorobium limicola
Anaeróbico,
fotolitotrófico
RODOSPIRILACEAS
Rhodospirillum rubrum
Rhodopseudomonas palustris
Rhodobacter capsulatus
Rhodomicrobium vannielli
Beneficios marginales
en agricultura
Anaeróbico,
heterotrófico
RIZOBIACEAS
Rhizobium
Bradyrhizobium
CIANOFICEAS
Anabaena
Nostoc
Gloeothece
Spirulina
Synechococcus
IMPORTANCIA ECONÓMICA
Anaeróbico,
fotoorganotrófico
Muy importantes en el
cultivo de leguminosas
Uso potencial en bosques
Obtención de proteína
unicelular
Minería microbiana
Cultivo de arroz y producción
de proteína unicelular
Depuración de aguas
residuales, abono y pienso
para piscifactorías
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NITROGENASAS
ALTERNATIVAS
Además de la extensivamente caracterizada nitogenasa que requiere molibdeno,
Azotobacter vinelandi posee otras dos nitrogenasas alternativas: una que contienen
vanadio y otra que contiene Fe.
Se han descrito diversas nitrogenasas alternativas que no contienen Mo, sino que
en su lugar tienen V, con cofactor de Fe-V, o sólo Fe, pero con una agrupación
sulfoférrica similar a los coFeMo y coFeV. Estas nitrogenasas no se sintetizan
cuando hay suficiente Mo, lo que indica que la nitrogenasa con Mo es el sistema
nitrogenasa principal en las células, mientras que las otras se supone que sirven
como mecanismo de apoyo para asegurar la fijación de N2 cuando el hábitat está
limitado en Mo.
Proteína de FeV
Los estudios de la nitrogenasa de vanadio se han centrado en gran medida en los
tipos de centros redox de la proteína VFe, así como en el análisis comparado de ss
propiedades catalíticas con las de la nitrogenasa de molibdeno.
La proteína de FeV de la nitrogenasa de vanadio difiere de la de molibdeno en
cuanto a la organización de las subunidades, ya que presenta una subunidad 
adicional cuya función no está aún aclarada. Además, las interacciones entre
subunidades parecen ser más débiles que en la proteína de FeMo, y de hecho se
han aislado muestras de distintos organismos con una composición de subunidades
variable. En este sentido, se han aislado proteínas deFeV hexámeras, donde la
composición es  con masa molecular de 240 KDa aprox., pero también se han
aislado muestras con una estequimetría distinta en cuanto a las subunidades .
Proteína
FeMo
K.pneumoniae
FeV
A.chroococcum
A.vinelandii
FeFe
A.vinelandii
R.capsulatus
Masa mol (KDa)
subunidades
Contenido en metal
225,0

2 Mo; 32 Fe; 0,06 V
239,6
Muestra de
composición variable

2 V; 21 Fe; 0,06 Mo
249,8
268,0


24 Fe; 0,01 V; 0,08 Mo
Nd
Los restos de aminoácidos implicados en la unión de los clústeres-P y co-FeMo de
la proteína de FeMo están conservados en la proteína de FeV, lo cual sugiere que
los centros redox de la proteína FeV son análogos a los de la proteína FeMo. De
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hecho, los estudios mediante diferentes técnicas espectroscópicas indican que ña
proteína de FeV contiene centros redox análogos al clúster-P y al co-FeMo de la
proteína de FeMo, con la salvedad de que el molibdeno ha sido sustituido por
vanadio en el cofactor de FeV. Además, se ha indicado que las muestras que
contienen menos de 30 Fe por mol, debían ser una mezcla de metaloproteínas y
apoproteína.
Proteína FeFe
Los estudios de caracterización de la proteína de FeFe de la nitrogenasa de hierro
son muy limitados. Como en el caso de la proteína de FeV, la proteína FeFe de esta
nitrogenasa está constituida por tres tipos de subunidades, a, b, d, donde las
interacciones entre subunidades son débiles, lo que conduce a la preparación de
muestras de composición variable en cuanto a la estequiométrica de las
subunidades. En el cuadro anterior se muestran algunas propiedades de la proteína
de FeFe. Recientemente se ha mejorado la purificación de esta proteína y presenta
una composición a2b2d2 con masa molecular de 268 KDa aprox., no habiéndose
publicado los datos analíticos de contenido en metales. La actividad de estas
muestras para reduciar al N2 es comparable a la de la proteína de VFe, lo que
indica claramente la existencia del cofactor-FeFe, cuya estructura cabe esperar que
sea análoga a la de los cofactores de las otras nitrogenasas. Además, los datos
disponibles, aunque escasos, son consistentes con la presencia de clusters-P.
Recientemente se ha descubierto un sistema nitrogenasa en la bacteria
quimiolitotrofa termófila Streptomyces thermoautotrophicus que, aunque contiene
Mo, es funcional y estructuralmente diferente a los sistemas encontrados en el resto
de organismos (dibujo). En este caso el donador de electrones es el CO a través de
una CO deshidrogenasa, que contiene Mo y que forma iones superóxido por
reducción del O2. Estos iones superóxido son reoxidados por el componente Str2
del complejo nitrogenasa (proteína dimérica que funciona como la reductasa de la
nitrogenasa clásica, aunque estructuralmente es muy parecida a las superóxido
dismutasas que contienen Mn). Los electrones se transfieren finalmente al
componente dinitrogenasa, denominado Str1, que reduce al N2. Esta
molibdoproteína contiene tres polipéptidos diferentes que presentan algunas
semejanzas estructurales con los de las otras dinitrogenasas. El requerimiento
energético de esta nitrogenasa es inferior (entre un 50 y un 75%) al de las clásicas y
además no es lábil al O2, lo que permite pensar que este sistema puede ser un
buen candidato para obtener por ingeniería genética plantas fijadoras de N2.
13
BIBLIOGRAFÍA
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