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INTRODUCCIÓN El nitrógeno fue descubierto por el botánico escocés Daniel Rutherford en 1772. Este científico observo que cuando encerraba un ratón en un frasco sellado, el animal consumía rápidamente el oxígeno y moría. Cuando se eliminaba el aire fijo (CO2) del recipiente quedaba un aire nocivo, el nitrógeno. El nitrógeno constituye el 78% en volumen de la atmósfera terrestre donde esta presente en forma de moléculas de N2. Propiedades: Gas incoloro, inodoro, insípido compuesto por moléculas de N2 Punto de fusión es de –210ºC Punto de ebullición normal es de –196ºC La molécula es muy poco reactiva a causa del fuerte enlace triple entre los átomos de nitrógeno El elemento exhibe todos los estadios de oxidación desde +5 hasta –3, los estados +5, 0 y –3 son los mas comunes (HNO3, N2 y HN3 resp.) y estables. El N es un elemento esencial para el ser humano, ya que es un componente de casi todas las biomoléculas, como loas ácidos nucleicos y las proteínas. La mayoría de los organismos vivos son incapaces de metabolizar el N2 debido a su inercia química. Por lo tanto, la conversión de nitrógeno a formas metabolizables, como el amoníaco, es esencial para el desarrollo y supervivencia de todos los organismos. El NH3 se incorpora a los aminoácidos y proteínas y entran en la cadena alimenticia. Los seres humanos solo pueden sintetizar 11 de los 20 aminoácidos que se necesitan para la síntesis de las proteínas. Aquéllos que no se pueden sintetizar de novo se denominan aminoácidos esenciales, ya que se deben de obtener de la dieta. Además de ser las unidades monoméricas de las proteínas, los aminoácidos son metabolitos energéticos y son precursores de muchos compuestos conteniendo Nitrógeno, como el grupo hemo, las aminas, el glutatión, los nucleótidos y los coenzimas nucleotídicos. El exceso de aminoácidos no se almacenan ni se excretan, se 1 convierten en precursores de otros metabolitos, como el Pyr, OAA y el αCG. Por lo tanto los aminoácidos son también precursores de los ácidos grasos, glucosa y cuerpos cetónicos, es decir, fuel metabólico. Aunque es un elemento clave en los organismos vivos los compuestos de nitrógeno no abundan en la corteza terrestre, los depósitos naturales de nitrógeno son los de KNO3 en la India y NaNO3 en Chile y otras regiones desérticas de América. ADQUISICIÓN DEL NITROGENO El nitrógeno molecular, N2, es un macronutriente vital para todos los tipos de vida. Casi todos los compuestos biológicamente activos con N lo contienen en forma reducida, y por lo tanto, antes de que se pueda utilizar por los organismos, se tiene que fijar, es decir, reducir desde N2 o [NO3]-hasta NH3 ([NH4]+), por los microorganismos, plantas y descargas eléctricas en los relámpagos. Las dos rutas para la adquisición del N en la biosfera son la asimilación del nitrato y la fijación del nitrógeno. Ambas rutas dan lugar a la formación de amonio, el cual es incorporado en los compuestos orgánicos. La asimilación del nitrato ocurre en dos pasos: 1) Reducción del nitrato en nitrito por 2 e-, catalizado por la nitrato reductasa (dibujo), que cataliza la reacción: [NO3]- + 2[H]+ + 2e- → [NO2]- + H2O La secuencia es la siguiente: NADH → [-SH → FAD → cyt b557 → MoCo] →[ NO3]El coMo es un centro especial que contiene molibdeno. Las nitrato reductasas son típicamente homodímeros 2 de 210-270 kD. 2) Reducción de nitrito en amonio por 6 e- catalizado por la nitrito reductasa: [NO2]- + 8[H]+ + 6e- → [NH4]+ + 2 H2O. La secuencia es la siguiente: Luz → 6 Fdred → [(4Fe-4S) → sirohemo] →[NO2]- 2 Las nitrito-reductasas son proteínas monoméricas de unos 63 kD con un sirohemo y un grupo (4Fe-4S). En las plantas superiores la nitrito reductasa se encuentra en los cloroplastos, donde está cerca de la ferredoxina que le proporciona los electrones. La nitrato reductasa se encuentra en el citosol. Las nitrito reductasas bacterianas son más complejas que las de las plantas superiores, pareciéndose a las nitrato reductasas. La asimilación del nitrato es la forma predominante por la cual los microorganismos, algas y plantas verdes adquieren el nitrógeno (99%). La fijación de nitrógeno es la conversión del nitrógeno del aire (N2) a formas distintas susceptibles de incorporarse a la composición del suelo o de los seres vivos, como el ion amonio (NH4+) o los iones nitrito (NO2–) o nitrato (NO3–); y también su conversión a sustancias atmosféricas químicamente activas, como el dióxido de nitrógeno (NO2), que reaccionan fácilmente para originar alguna de las anteriores. Menos del 1% del N asimilado en la biosfera pasa por esta vía. La fijación de nitrógeno puede ser puramente abiótica o biológica: Fijación abiótica: se forman óxidos como consecuencia de la combustión de compuestos orgánicos, descargas eléctricas, etc., que son arrastrados al suelo por la lluvia, o amonio por el proceso industrial Haber-Bosch. Fijacion industrial El principal proceso industrial de fijación de nitrógeno es el de producción de amoníaco. Se realiza haciendo pasar una mezcla de nitrógeno atmosférico e hidrógeno por un catalizador metálico a 500-600 °C. Después el amoníaco se oxida a ácido nítrico, que al combinarse de nuevo con amoníaco rinde nitrato amónico, que se utiliza como explosivo y como fertilizante. La producción comercial de NH3 se lleva a cabo por el proceso Haber-Bosch: N2 (g) + 3 H2 (g) → 2 NH3 (g) La producción de cianamida es otro proceso industrial de fijación de nitrógeno y se realiza haciendo pasar nitrógeno atmosférico sobre carburo de calcio caliente en presencia de un catalizador. La cianamida se emplea como fertilizante y para elaborar cianuro. Fijación biológica de nitrógeno: Es un fenómeno fundamental que depende de la habilidad metabólica de unos pocos organismos, llamados diazotrofos en relación a esta habilidad, para tomar N2 y reducirlo a nitrógeno orgánico: N2 + 8H+ + 8e− + 16 ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16 Pi La fijación biológica la realizan tres grupos de microorganismos diazotrofos: 1) Bacterias gramnegativas de vida libre en el suelo, de géneros como Azotobacter, Klebsiella o el fotosintetizador Rhodospirillum, una bacteria purpúrea. 3 En el caso de bacterias del suelo, como Clostridium y Azotobacter, el amoniaco queda fijado en él. La acción de los descomponedores sobre los cadáveres y los productos de desecho del metabolismo también enriquecen el suelo en amoniaco mediante un proceso que se denomina amonificación. ( (Clostridium) (Azotobacter) 2) Bacterias simbióticas de algunas plantas, en las que viven de manera generalmente endosimbiótica en nódulos, principalmente localizados en las raíces. Hay multitud de especies encuadradas en el género Rhizobium, que guardan una relación muy específica con el hospedador, de manera que cada especie alberga la suya. Rhizobium leguminosarum (foto) es una bacteria simbiótica que se encuentra en unos nódulos que hay en las raíces de las leguminosas; parte del nitrógeno que fija lo cede a las plantas en forma de un componente soluble en el citoplasma celular. 3) Cianobacterias de vida libre o simbiótica. Las cianobacterias de vida libre son muy abundantes en el plancton marino y son los principales fijadores en el mar. Además hay casos de simbiosis, como el de la cianobacteria Anabaena en cavidades subestomáticas de helechos acuáticos del género Azolla, o el de algunas especies de Nostoc que crecen dentro de antoceros y otras plantas. A continuación se puede observar de manera aproximada las toneladas de N fijadas por año: 4 Y con esto entramos en el denominado ciclo del nitrógeno (fig. 1). Fig. 1.- Ciclo del nitrógeno 5 Casi todo el amoniaco que llega al suelo es pasado a ion nitrato por la acción de otras bacterias. Este proceso (llamado nitrificación) se realiza en dos partes:primero unas bacterias del género Nitrosomonas (dibujo 1) transforman el amoniaco en ion nitrito (NH3 → [NO2]-) por nitrosación, y luego las del género Nitrobacter (dibujo 2) transforman el nitrito en nitrato por nitratación ([NO2]→[NO3]-). El nitrato constituye la fuente principal de nitrógeno disponible en el suelo para las plantas superiores. Existe otro proceso llamado desnitrificación, que transforma el nitrato en nitrito y este en nitrógeno molecular, que vuelve a la atmósfera cerrándose así el ciclo. Este proceso lo realizan las bacterias desnitrificantes, como las del género Pseudomonas. (Pseudomonas) Todos estos sistemas requieren: 1. La nitrogenasa, la enzima que cataliza la reducción del N2 en amonio 2. Un reductor fuerte, i.e., ferredoxina 3. ATP 4. Condiciones anaeróbias 5. Controles regulatorios En una primera aproximación, dos son los controles más importantes: ADP, que inhibe a la enzima, por lo tanto la relación ATP/ADP regula la actividad de la enzima, y el [NH4]+, que reprime la expresión de los genes nif (se conocen más de 20), los genes que codifican las proteínas del sistema fijador. 6 ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LA NITROGENASA La nitrogenasa es un sistema bastante complejo, que está constituido por dos proteínas separadas, ambas imprescindibles para la acción enzimática, y que se denominan: a) Componente I o nitrogenasa propiamente dicha; un tretámero () que contiene dos grupos P (P-clusters), uno, (8Fe-7S) y el otro, (Mo:7Fe-9S)homocitrato, que constituye el cofactor conocido como co-FeMo (cofactor hierro molibdeno) a nivel del cual ocurre la reducción del N2 aunque se desconoce cómo y dónde se une el substrato y es activado. Es muy sensible al O 2. La enzima es muy lenta: 12 pares de electrones por segundo y por enzima, o tres N 2 por segundo. Ya que la actividad es tan baja, las células que fijan nitrógeno tienen una gran cantidad de enzima, aproximadamente el 5% de la proteína total de la célula. b) Componente II o nitrogenasa-reductasa, es un homodímero () que posee átomos de Fe acomplejados con S de determinadas cisteínas (por lo que este componente se denomina a veces ferroproteína). Es muy sensible al O 2. Se requieren 4ATP por cada par de electrones transferidos. Como se necesitan 4 pares de electrones, se consumen 16 ATP por N2 reducido. La necesidad de ATP es paradójica, ya que la reducción del N2 a [NH4]+ es favorable termodinámicamente. La solución está en la fuerza de la unión N≡N (225 kcal/mol) y por tanto se necesita energía para romperlo. 7 Mecanismo: La Feproteína, activada por ATP-Mg, transfiere los electrones a la nitrogenasa que a su vez los distribuye entre N2 y protones para dar amonio e hidrógeno. Esta reducción de protones es siempre concomitante con la producción de amonio. Supone una pérdida de eficiencia del proceso por la parte correspondiente de energía que consume (un 25%). Algunas especies y cepas microbianas están provistas de una actividad hidrogenasa que recicla en parte la energía perdida por la liberación de hidrógeno. No obstante el mecanismo sigue siendo poco claro y se siguen haciendo investigaciones con modelos para entender como es que la molécula de nitrógeno se enlaza. Lo que sí se sabe es que los electrones son transferidos, dentro del sistema de fijación de nitrógeno, a través de la ferredoxina (in vivo) o por la flavodoxina (in vitro), mediante la transferencia de un simple electrón a la proteína de Fe, luego la proteína de Fe transfiere los electrones (uno a la vez) a la proteína de MoFe, donde la N2 se transforma en NH3. La conversión de N2 a NH3 por las nitrogenasas ocurre por una secuencia de reacciones de transferencia hidronioelectrones (los electrones son provistos a través del sistema transportador de electrones y los hidronios son mediados por el solvente acuoso). A continuación se pueden observar dos tipos de esquema para la reducción de nitrógeno catalizada por la nitrogenasa: 8 La reacción global quedará de la siguiente manera: N2 + 8H+ + 8e− + 16 MgATP → 2NH3 + H2 + 16MgADP + 16 Pi Gasto energético Dos cosas llaman la atención de la ecuación anterior: Obsérvese que la reacción requiere un gran aporte de energía en forma de al menos 16 ATP (en ocasiones puede llegar a 24 ATP). Ello se debe a que el dinitrógeno (N≡N) es una molécula extremadamente inerte (su energía de disociación es de 940 kJ), y su reducción precisa una gran energía de activación para transferirle 6 electrones. Parte de la actividad nitrogenasa (así como ATP y electrones) "se pierden" en reducir dos iones H+ hasta H2. Se desconoce la razón de este "despilfarro", pero se sabe que es un efecto intrínseco de este complejo enzimático. Los electrones para la reducción llegan al complejo por medio de una ferredoxina, que los transfiere al componente II, que queda reducido al tiempo que por cada dos electrones transferidos se hidroliza una molécula de ATP. La nitrogenasa-reductasa reducida se asocia entonces con la nitrogenasa (=componente I), y le transfiere los electrones. Una vez reducida la molibdoferroproteína, ésta transfiere los electrones (y los protones) al N2, hasta convertirlo en dos moléculas de amoniaco. (El centro activo es co-FeMo). Sensibilidad al Oxígeno La nitrogenasa purificada es inactivada rápida e irreversiblemente por el O 2. La proteína Fe es mucho más sensible que la proteína MoFe con una vida media en presencia de aire de 45 segundos y 10 minutos respectivamente. El efecto de O 2 sobre la nitrogenasa restringe la fijación de N2 en la mayoría de las especies de eubacterias a condiciones anaeróbicas o de microaerobiosis. La fijación de nitrógeno en bacterias aeróbicas como Azotobacter es un proceso que demanda gran cantidad de energía, por lo que requiere una eficiente fosforilación oxidativa. Debido a que el O2 es tóxico para el complejo de la 9 nitrogenasa, las bacterias aeróbicas fijadoras de nitrógeno han evolucionado una variedad de estrategias para contender con esta paradoja aparente. A. vinelandii fija nitrógeno en aerobiosis A. vinelandii era hasta hace poco la única bacteria reconocida capaz de fijar nitrógeno en condiciones de total aerobiosis, recientemente se describió otro sistema de fijación de nitrógeno tolerante a O 2 en Streptomyces thermoaututrophicus. Azotobacter fija nitrógeno en aerobiosis gracias a que posee un sistema bien integrado de protección de su nitrogenasa que comprende: protección conformacional, protección respiratoria, autoprotección y otros cambios morfológicos y fisiológicos que le permiten crecer diazotróficamente en condiciones totalmente aeróbicas. Protección conformacional. En A. vinelandii un aumento pasajero del O2 provoca un mecanismo de inactivación (switching-off) de la nitrogenasa, que consiste en la formación de un complejo de nitrogenasa inactivado pero protegido, conocido como protección conformacional. Este complejo es formado por la unión no covalente de una proteína que contiene Fe-S (conocida como FeSII o Shetna) a las proteínas Fe y MoFe. Protección respiratoria. Cuando las células se adaptan al ambiente de mayor concentración de O 2, se expresa la citocromo oxidasa cytbd, parcialmente desacoplada con baja afinidad por O2, la cual probablemente actúa junto con una NADH deshidrogenasa desacoplada. El flujo de electrones a través de esta cadena desacoplada permite tasas de respiración altas y un rápido consumo del O2 intracelular sin agotar las pozas de ATP y NADH. La tasa respiratoria en condiciones de fijación de nitrógeno atmosférico es 10 veces más alta que la tasa normal de muchas bacterias. Además de reducir el O2 la citocromo oxidasa cytbd, funcionaría como un productor de ATP rápido ya que se necesitan grandes cantidades de ATP para la autoprotección de la nitrogenasa. Autoprotección. Si la concentración de nitrogenasa es lo suficientemente alta en relación a la concentración de O2 celular, la nitrogenasa reductasa puede reducir O2 a H2O2 y posiblemente a H2O y por lo tanto reduciría el O2 en la vecindad de la nitrogenasa. Además el flujo constante de equivalentes reductores a través de la nitrogenasa puede ayudar a mantenerla en un estado reducido. Este proceso conocido como autoprotección requiere grandes cantidades de equivalentes reductores y ATP que son los provistos por la rama cytab de la cadena respiratoria. Especificidad La nitrogenasa es una enzima relativamente "inespecífica", ya que puede reducir otras pequeñas moléculas provistas de triples enlaces, como acetileno, protones, trinitrógeno, alquilacetilenos, ciclopropeno,.... La reducción de acetileno a etileno sirve de base al método más usual de medir la actividad nitrogenasa, el llamado ensayo de reducción del acetileno, que se registra mediante aparatos de cromatografía gaseosa. 10 LA NITROGENASA Y LOS MICROORGANISMOS QUE LA POSEEN MICROORGANISMO BACILACEAS Bacillus polymyxa Clostridium AZOTOBACTERIAS Azotobacter Azomonas insignis Azotococcus agilis Beijerinckia derxii ENTEROBACTERIAS Klebsiella pneumoniae Enterobacter aerogenes Erwinia herbicola Citrobacter freundii Azospirillum brasilense TIPO DE METABOLISMO AL FIJAR N Aeróbico, heterotrófico Beneficios a cosechas no confirmados Anaeróbico o microaerófilo Importantes en la fijación asociativa Microaerófilo, heterotrófico STREPTOMICETACEAS Frankia Microaerófilo, heterotrófico METANOMONADACEAS Methylocystis Methylococcus Microaerófilo, autotrófico TIOBACTERIACEAS Thiobacillus ferrooxidans Microaerófilo Anaeróbico o microaerófilo, fotolitotrófico CROMATIACEAS Chromatium vinosum Anaeróbico, fotolitotrófico CLOROBIACEAS Chlorobium limicola Anaeróbico, fotolitotrófico RODOSPIRILACEAS Rhodospirillum rubrum Rhodopseudomonas palustris Rhodobacter capsulatus Rhodomicrobium vannielli Beneficios marginales en agricultura Anaeróbico, heterotrófico RIZOBIACEAS Rhizobium Bradyrhizobium CIANOFICEAS Anabaena Nostoc Gloeothece Spirulina Synechococcus IMPORTANCIA ECONÓMICA Anaeróbico, fotoorganotrófico Muy importantes en el cultivo de leguminosas Uso potencial en bosques Obtención de proteína unicelular Minería microbiana Cultivo de arroz y producción de proteína unicelular Depuración de aguas residuales, abono y pienso para piscifactorías 11 NITROGENASAS ALTERNATIVAS Además de la extensivamente caracterizada nitogenasa que requiere molibdeno, Azotobacter vinelandi posee otras dos nitrogenasas alternativas: una que contienen vanadio y otra que contiene Fe. Se han descrito diversas nitrogenasas alternativas que no contienen Mo, sino que en su lugar tienen V, con cofactor de Fe-V, o sólo Fe, pero con una agrupación sulfoférrica similar a los coFeMo y coFeV. Estas nitrogenasas no se sintetizan cuando hay suficiente Mo, lo que indica que la nitrogenasa con Mo es el sistema nitrogenasa principal en las células, mientras que las otras se supone que sirven como mecanismo de apoyo para asegurar la fijación de N2 cuando el hábitat está limitado en Mo. Proteína de FeV Los estudios de la nitrogenasa de vanadio se han centrado en gran medida en los tipos de centros redox de la proteína VFe, así como en el análisis comparado de ss propiedades catalíticas con las de la nitrogenasa de molibdeno. La proteína de FeV de la nitrogenasa de vanadio difiere de la de molibdeno en cuanto a la organización de las subunidades, ya que presenta una subunidad adicional cuya función no está aún aclarada. Además, las interacciones entre subunidades parecen ser más débiles que en la proteína de FeMo, y de hecho se han aislado muestras de distintos organismos con una composición de subunidades variable. En este sentido, se han aislado proteínas deFeV hexámeras, donde la composición es con masa molecular de 240 KDa aprox., pero también se han aislado muestras con una estequimetría distinta en cuanto a las subunidades . Proteína FeMo K.pneumoniae FeV A.chroococcum A.vinelandii FeFe A.vinelandii R.capsulatus Masa mol (KDa) subunidades Contenido en metal 225,0 2 Mo; 32 Fe; 0,06 V 239,6 Muestra de composición variable 2 V; 21 Fe; 0,06 Mo 249,8 268,0 24 Fe; 0,01 V; 0,08 Mo Nd Los restos de aminoácidos implicados en la unión de los clústeres-P y co-FeMo de la proteína de FeMo están conservados en la proteína de FeV, lo cual sugiere que los centros redox de la proteína FeV son análogos a los de la proteína FeMo. De 12 hecho, los estudios mediante diferentes técnicas espectroscópicas indican que ña proteína de FeV contiene centros redox análogos al clúster-P y al co-FeMo de la proteína de FeMo, con la salvedad de que el molibdeno ha sido sustituido por vanadio en el cofactor de FeV. Además, se ha indicado que las muestras que contienen menos de 30 Fe por mol, debían ser una mezcla de metaloproteínas y apoproteína. Proteína FeFe Los estudios de caracterización de la proteína de FeFe de la nitrogenasa de hierro son muy limitados. Como en el caso de la proteína de FeV, la proteína FeFe de esta nitrogenasa está constituida por tres tipos de subunidades, a, b, d, donde las interacciones entre subunidades son débiles, lo que conduce a la preparación de muestras de composición variable en cuanto a la estequiométrica de las subunidades. En el cuadro anterior se muestran algunas propiedades de la proteína de FeFe. Recientemente se ha mejorado la purificación de esta proteína y presenta una composición a2b2d2 con masa molecular de 268 KDa aprox., no habiéndose publicado los datos analíticos de contenido en metales. La actividad de estas muestras para reduciar al N2 es comparable a la de la proteína de VFe, lo que indica claramente la existencia del cofactor-FeFe, cuya estructura cabe esperar que sea análoga a la de los cofactores de las otras nitrogenasas. Además, los datos disponibles, aunque escasos, son consistentes con la presencia de clusters-P. Recientemente se ha descubierto un sistema nitrogenasa en la bacteria quimiolitotrofa termófila Streptomyces thermoautotrophicus que, aunque contiene Mo, es funcional y estructuralmente diferente a los sistemas encontrados en el resto de organismos (dibujo). En este caso el donador de electrones es el CO a través de una CO deshidrogenasa, que contiene Mo y que forma iones superóxido por reducción del O2. Estos iones superóxido son reoxidados por el componente Str2 del complejo nitrogenasa (proteína dimérica que funciona como la reductasa de la nitrogenasa clásica, aunque estructuralmente es muy parecida a las superóxido dismutasas que contienen Mn). Los electrones se transfieren finalmente al componente dinitrogenasa, denominado Str1, que reduce al N2. Esta molibdoproteína contiene tres polipéptidos diferentes que presentan algunas semejanzas estructurales con los de las otras dinitrogenasas. El requerimiento energético de esta nitrogenasa es inferior (entre un 50 y un 75%) al de las clásicas y además no es lábil al O2, lo que permite pensar que este sistema puede ser un buen candidato para obtener por ingeniería genética plantas fijadoras de N2. 13 BIBLIOGRAFÍA Introducción a la química bioinorgánica (Maria Vallet,Juan Faus,Enrique García-España, José Moratal) EDITORIAL SINTESIS http://www.eez.csic.es/~olivares/ciencia/fijacion/index.html http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/bolarios/Investigacion/fijacionN.htm http://www.wikipedia.org http://www.monografias.com http://al-quimicos.blogspot.com/2007/05/nitrogenasa.html http://www.eez.csic.es/~olivares/ciencia/fijacion/nitrogenasa.html http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000051/lecciones/cap02/imagene s/04_02_01.gif http://www.botany.hawaii.edu/faculty/webb/Bot201/Bot201/Algae/Bot%20201%2 0Anabaena.jpg http://media-2.web.britannica.com/eb-media/95/24295-004-2DC8B7B4.jpg http://www.kimicontrol.com/microorg/Clostridium%20botulinum.jpg http://www.miliarium.com/Proyectos/Nitratos/Nitrato/Azotobacteria.gif http://books.google.es/books?id=19ffPAm3E3kC&pg=PA161&lpg=PA161&dq=nit rogenasas+alternativas&source=web&ots=BOleho_YHI&sig=cx_yO72AD_YvT0x 10xFt6MPq5rk&hl=es&sa=X&oi=book_result&resnum=6&ct=result#PPA161,M1 14