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V CURSO DE FORMACIÓN EN ENFERMEDADES NEUROMUSCULARES EL VALOR DE LOS ESTUDIOS GENETICOS EN LAS ENFERMEDADES NEUROMUSCULARES Adolfo López de Munain Area de Neurociencias Instituto Biodonostia [email protected] Introducción Existen más de 300 genes relacionados diferentes enfermedades y síndromes neuromusculares cuyo amplio espectro fenotípico complica el diagnóstico molecular, especialmente de aquellos casos con un fenotipo más inespecífico. La patología molecular subyacente que abarca todos los paradigmas mutacionales genéticos (mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, duplicaciones, grandes deleciones, mutaciones dinámicas, etc,..) y epigenéticos, obliga a utilizar un amplio abanico de técnicas y procedimientos de laboratorio, cuyo rendimiento y limitaciones deben conocer los clínicos a la hora de solicitar una prueba o de interpretar los resultados que llegan desde el laboratorio. De manera general, el diagnóstico molecular confirmatorio de una enfermedad neuromuscular debe intentarse siempre, para tratar de establecer la etiología, ofrecer consejo genético, sentar un pronóstico vital o funcional, poder aplicar eventualmente una terapia u ofrecer la oportunidad de participar en ensayos clínicos o en otro tipo de investigaciones. En el campo de las enfermedades neuromusculares y debido a la gran heterogeneidad genética, no siempre es posible, llegar a un diagnóstico completo y de certeza tras un estudio exhaustivo de todas las posibles mutaciones en todos los genes conocidos, sin acotar previamente el campo de estudio en base a los rasgos fenotípicos (radiológicos, neurofisiológicos, del patrón de herencia, de la evolución, de los rasgos clínicos asociados, etc,..), y ponderar otras pistas (clínicas, étnicas, geográficas, culturales o simplemente epidemiológicas) que pueden contribuir a asentar como cierto un diagnóstico molecular. A medida que los avances tecnológicos relacionados con la secuenciación masiva y la interpretación de los datos obtenidos, se sigan abaratando y aumente su accesibilidad dentro de la oferta asistencial, se podrá valorar su utilidad real en contexto clínico y no sólo en investigación, como hasta ahora. No es descartable que estas nuevas tecnologías convivan con algunas estrategias de diagnóstico molecular ya usadas en el pasado como por ejemplo, el estudio de exomas/genomas completos familiares combinado con estudios de homozigosidad o con el análisis de los patrones de segregación, de manera similar a como fueron utilizados en el pasado los marcadores de localización cromosómica para los estudios de ligamiento. Bases moleculares de la variabilidad fenotípica Variaciones alélicas Las mutaciones que afectan a diferentes partes del gen o son de diferente naturaleza, pueden afectar de forma diversa a la función de la proteína resultante, produciendo fenotipos diferentes, como ocurre dentro de las distrofinopatías, dónde según la mutación rompa o no el marco de lectura, se producirá un fenotipo más grave (Duchenne) o más leve (Becker). En otro caso, cuando las mutaciones afectan a dominios diferentes, por ejemplo dominios transmembrana o en el extremo NH3 o COH-terminal, puede tener un impacto diferente sobre la funcionalidad de la proteína. 2 Mutaciones dinámicas Consisten en la inserción de tripletes (CTG en la distrofia miotónica tipo 1), tetranucleótidos (CCTG en la distrofia miotónica tipo 2) o hexanucleótidos (GGGGCC en la esclerosis lateral amiotrófica-DFT) de secuencia diversa en una zona repetitiva del genoma situada tanto en intrones como en la fracción codificante de genes. El tamaño de la inserción puede variar de una generación a otra (expansión intergeneracional como ocurre en distrofia miotónica tipo 1) o no (como ocurre en la distrofia oculofaríngea) y se suele correlacionar de manera diversa con la gravedad de la sintomatología clínica. Los tripletes se traducen a RNA y estas expansiones pueden alterar los mecanismos de procesamiento de otros RNAs o influir en la expresión de genes vecinos. En la mayoría de casos, la relación entre la mutación y la fisiopatología y más aún con los síntomas de cada una de estas enfermedades sólo es parcialmente comprendida. En la distrofia miotónica tipo 1 o enfermedad de Steinert que es la miopatía del adulto más frecuente, existe una clara relación entre el tamaño del triplete medido en sangre y la edad de comienzo de los síntomas y la gravedad de los mismos; así por debajo de 80 repeticiones lo más probable es que la única sintomatología sea la presencia de cataratas. Entre 80 y 800 repeticiones la mayoría de pacientes presentan un cuadro miopático típico con debilidad, atrofia muscular y miotonía de comienzo más o menos precoz (a mayor expansión, más precoz). Por encima de este tamaño los casos suelen ser de debut precoz (infantil o juvenil) o incluso pueden corresponder a casos neonatales, aunque estos típicamente suelen superar los 1500 repeticiones Aunque la mayoría de laboratorios asistenciales sólo proporcionan una información cualitativa (alelo patológico o normal), conocer el tamaño de la expansión permite al clínico hacer una predicción siquiera aproximada de la evolución ulterior. No obstante, hay que recordar que a mayor tamaño, mayor probabilidad de que esta expansión somática en leucocitos sufra crecimientos adicionales con el paso del tiempo. Otro aspecto a tener en cuenta en relación a esta miopatía es que cada tejido tiene un tamaño diferente de expansión de forma que por ejemplo, el músculo, presenta expansiones mucho mayores que los leucocitos de sangre periférica que es donde se realizan la mayoría de estudios. De momento este conocimiento no tiene una clara utilidad práctica, pero será con casi total seguridad, un criterio de inclusión para los ensayos clínicos en preparación. Impronta genómica Conocemos como impronta genómica a la influencia que el sexo del progenitor afecto tiene para modular las manifestaciones clínicas de una determinada alteración genética. Por ejemplo, en la distrofia miotónica tipo 1 las formas neonatales más graves son transmitidas casi siempre por madres afectadas, aunque en términos relativos la expansión es mayor cuando el alelo transmisor procede del varón en los rangos bajos (por debajo de 100 repeticiones) de expansión. Otro ejemplo relacionado con la modulación por sexo en las miopatías ocurre en las distrofinopatías donde hasta un 10% de las mujeres portadoras pueden tener síntomas. Ello se debe a que el fenómeno de inactivación del cromosoma X (lyonización), puede afectar aleatoriamente en mayor medida al cromosoma X sano, provocando una deficiencia parcial de distrofina que genera sintomatología más o menos evidente en estas mujeres. Polimorfismos reguladores Éste es un mecanismo más relacionado por ahora con riesgo o susceptibilidad, que con modificaciones fenotípicas en el campo de las enfermedades neuromusculares. Podemos citar el polimorfismo en SLCO1B1 3 relacionado con el riesgo de aparición de una miopatía tóxica por uso de estatinas, o la presencia de polimorfismos en el gen SMCHD1 ligado a la distrofia facioescapulohumeral tipo 2 con el fenotipo de los pacientes con distrofia facioescapulohumeral tipo 1. Las variaciones en el número de copias (copy number variations) que arbitrariamente se refieren a fragmentos de 1 Kb como mínimo cuya presencia o ausencia en el genoma, da lugar a variación en la susceptibilidad a padecer ciertas enfermedades o en los fenotipos de las mismas. Umbral mutacional y segregación mitótica Éste es un mecanismo característico de variación fenotípica de las enfermedades neuromusculares derivadas de mutaciones en el ADN mitocondrial como el MELAS o el MERRF. La segregación mitótica es el mecanismo por el cual una estirpe celular puede haber heredado de su célula progenitora una cantidad variable de mitocondrias con su ADN mutado, lo que hará que la afectación clínica varíe mucho de unos tejidos a otros. El umbral mutacional depende del número de mitocondrias con ADN mutado que debe poseer una célula o un tejido para que exprese su sintomatología, y esto varía de unos tejidos a otros según sus necesidades energéticas. Cambios de la secuencia del ADN El diagnóstico molecular de muchas miopatías se basa en detectar los cambios en la secuencia. Por ejemplo, en la distrofia facioescapulohumeral tipo 1 se basa en la detección mediante la técnica de Southern/LGE de los fragmentos digeridos con EcoRI, EcoRI/Bln, XapI y detectados con la sonda p13E-11 que hibridiza proximalmente con la región D4Z4 del cromosoma 4. En la mayoría de casos esta técnica permite realizar el diagnóstico molecular confirmatorio de los pacientes con esta miopatía que muestran los rasgos típicos (herencia dominante afectación facioescapulohumeral, escápula alata, etc,..). Sin embargo hay un 510% de pacientes, algunos ellos con un fenotipo típico donde la técnica da resultados negativos. Esto nos plantea el problema de los falsos negativos, situación que debe ser tenida en cuenta antes de aceptar como bueno un resultado. Por otro lado, en estos casos hay que considerar que un resultado negativo inesperado puede ser por un problema técnico (baja sensibilidad de la electroforesis horizontal LGE frente a la electroforesis de campo pulsante o PFGE), la presencia de un mosaicismo (se observa en el 50 % de los casos esporádicos) o por existir en ese caso una deleción que incluye el lugar de hibridación de la sonda p13E-11, lo que impide detectar la deleción con las técnicas habituales. El problema contrario es el de los falsos positivos. Siguiendo con el ejemplo de la distrofia facioescapulohumeral tipo 1, existen dos alelos 4q diferentes (4qA y 4qB) que difieren por la presencia de un polimorfismo distal al locus D4Z4 y que caracteriza al alelo 4qA. Sólo cuando la contracción de la secuencia repetida en D4Z4 acontece en un cromosoma 4qA, se produce la enfermedad. Por lo tanto para evitar falsos positivos, es preciso determinar si la contracción se ha producido en el alelo adecuado. Además se han descrito varios haplotipos diferenciales dentro de ese cromosoma 4qA. Sólo cuando la contracción se produce en una serie de haplotipos permisivos (4qA161, entre otros) se produce la enfermedad. Existe para complicar la interpretación de los resultados, una región homóloga en el cromosoma 10q cuyas deleciones no causan enfermedad pero pueden generar confusión en el análisis. Para evitar confusiones se usa la triple digestión que permite identificar los alelos provenientes del cromosoma 4q y 10q Debido también a la gran homología (98%) de la región 4q35 donde se encuentra localizada la FSHD con otra región del cromosoma 10 (locus 10q26), pueden tener lugar una serie de reordenamientos entre ambos cromosomas, pudiendo o bien translocarse todas las repeticiones de uno de los alelos del cromosoma 10 al cromosoma 4 o 4 viceversa, obteniendo distintos patrones denominados cuatrisomía (si las repeticiones de los dos alelos del cromosoma 10 se han translocado al cromosoma 4), trisomía (si las repeticiones de uno de los dos alelos del cromosoma 10 se han translocado al cromosoma 4), monosomía (si las repeticiones de uno de los dos alelos del cromosoma 4 se han translocado al cromosoma 10) y nullsomía (si las repeticiones de los dos alelos del cromosoma 4 se han translocado al cromosoma 10). Una vez descartado todo lo anterior, existe un porcentaje de pacientes genuinamente negativos, sin contracción en D4Z4, en los que hay que buscar mutaciones en el gen SMCHD1 responsable de la forma 2 de la enfermedad. Cambios epigenéticos En la distrofia facioescapulohumeral tipo 1 existe una hipometilación de la región 4q35.2 tanto del ADN como de las histonas que influye en la derepresión del gen DUX4 localizado dentro de las repeticiones D4Z4, y la sobreexpresión de dicho gen en la última repetición D4Z4 es lo que finalmente da lugar a la clínica. En la distrofia facioescapulohumeral tipo 2 existe una hipometilación de la misma región 4q35.2 secundaria a una mutación en el gen SMCHD1 situado en el cromosoma 18p11.32. Los cambios epigenéticos son responsables de la modulación fenotípica en muchas enfermedades musculares como es el caso de la distrofia miotónica. RNAS no codificantes Los microRNAs son moléculas pequeñas (alrededor de 20 pb) que al unirse al RNA mensajero diana, regulan la traducción de éste, actuando como represores post-transcripcionales de su diana genética o proteica. Los microRNAs se encuentran en localizaciones entre genes y también a nivel intragénico y se estima que influyen hasta un 30% en la expresión de los genes. Los lncRNAS son RNAs de tamaño más grande, codificados por miles de genes e intervienen regulando las principales rutas celulares. Su papel modulador de los fenotipos clínicos está en estos momentos en fase de investigación. El diagnóstico molecular El diagnóstico molecular estándar se hace a partir de ADN obtenido de un tejido del sujeto (generalmente células periféricas mononucleares de sangre periférica, salvo en el caso de las mutaciones mitocondriales, en las que a veces hay que realizar el estudio genómico en el tejido diana para poner de manifiesto la anomalía molecular subyacente). Además de este diagnóstico genómico, es posible realizar el diagnóstico a partir del ARN procedente del tejido diana, obteniendo a partir de éste, el cDNA que permite el diagnóstico, lo que supone una ventaja cuando las mutaciones no se localizan en el exoma del gen. En los últimos años han comenzado a utilizarse técnicas de secuenciación masiva del ADN cuyo precio se ha hecho competitivo y que utilizan 2 estrategias diferenciadas: a) Paneles de secuenciación de un catálogo de genes prefijado en torno a un problema clínico, como por ejemplo, las distrofias de cinturas o las neuropatías sensitivo motoras. 5 b) Secuenciación del exoma (whole exome sequencing o WES) que consiste en secuenciar la parte codificante (exones) de todos los genes del individuo. Secuenciación del genoma completo (whole genome sequencing o WGS) que consiste en secuenciar la parte codificante (exones) y la parte no codificante (intrones). c) Con estas estrategias el problema es el exceso de información que generan y cuya interpretación clínica es a veces imposible. A priori la estrategia de paneles parece más razonable, pero no es infrecuente encontrar variantes en más de un gen candidato o varias en un mismo gen de significado incierto, por lo que esta estrategia debe ser completada con estudios posteriores de segregación familiar o estudios funcionales para poder llegar a establecer la causalidad de alguna de las mutaciones encontradas. Frente a alguno cuadros con poca variabilidad y en la que las pruebas objetivas son escasas o difíciles de conseguir como ocurre con las miopatías congénitas, la correcta interpretación de los datos clínicos puede ayudar a reducir este exceso de información. En la tabla 1 se resumen a modo de ejemplo, algunos rasgos que orientan el diagnostico molecular en este grupo de miopatías. Rasgo clinico Genes potencialmente implicados Diagnóstico diferencial Escoliosis Espina rígida Cardiomiopatía Pie caído/pes cavus Hipertermia maligna SEPN1, RYR1, miopatía nemalínica SEPN1, RYR1 TTN, MYH7, ACTA1 NM (NEB, TPM3, TPM2), DNM2, MYH7 Miopatía Central Core, Miopatía Multiminicore, CNM (RYR1) SEPN1, miopatía nemalínica (NEB, TPM3, ACTA1) Miopatía centronuclear (MTM1, RYR1, DNM2), Miopatía Multi-Minicore, Miopatia central core Miopatía nemalínica, Miopatía centronuclear (MTM1, RYR1, DNM2) Miopatía centronuclear (MTM1, RYR1, DNM2), Miopatía Multi-Minicore (RYR1) Miopatía nemalínica, Miopatía centronuclear (MTM1, DNM2 grave), RYR1 grave NM, CNM (MTM1), RYR1 grave NM, CNM (MTM1), RYR1 grave RYR1, SEPN1 NM, MTM1, RYR1 COL6, LAMA2 Afectación preferente Ptosis respiratoria y Debilidad facial Oftalmoplejia Dismorfia facial Debilidad bulbar Insuficiencia respiratoria precoz Hipotonía axial Hipotonía severa Deformidades ortopédicas Dislocación de cadera Akinesia fetal/artrogriposis Pie club axial RYR1, Miopatía nemalínica RYR1 Miopatía nemalínica (ACTA1, NEB), RYR1, KLHL40 NM, RYR1 Enfermedad de Pompe Neuropatía periférica LMNA, Miastenia Enfermedad de Pompe congénita, LMNA Distrofia miotónica, Prader-Wili, síndrome de Down COL6, Miastenia congénita COL6 Miastenia congênita, SMA Miastenia congénita, miotónica, CHs Distrofia Tabla 1. Orientación diagnóstica en las miopatias/distrofias congénitas En el caso de la secuenciación de exomas, el problema es que el número de variantes detectadas puede ser muy alto e incluso con las restricciones posteriores (asunción de potencial homozigosidad por consanguinidad parental o restricción a genes con expresión en el tejido diana), el número de variantes que quedan para el análisis final puede ser muy alto e impedir llegar a conclusiones. En ambos casos las técnicas de secuenciación masiva tienen problemas de sensibilidad y especificidad por lo que los resultados deben ser validados con secuenciación tradicional tipo Sanger. Para poder validar los resultados obtenidos es preciso consultar bases de datos (1,000 Genomes Project: http://www.1000genomes.org; 6 dbSNP:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/, etc.). Sin embargo es preciso filtrar bien los resultados para llegar a genes candidatos compatibles con la clínica de la enfermedad presente en casos únicos. En ocasiones debemos tener en cuenta que podemos encontrarnos genes implicados hasta ese momento en miopatias diferentes, ensanchando el espectro fenotípico de esos genes. El caso de los trastornos mitocondriales se deberá realizar simultáneamente el estudio concomitante del exoma nuclear y mitocondrial. En cualquier caso habrá casos en los que para llegar al diagnóstico haya que integrar no solo los datos genéticos sino los de expresión a nivel RNA y proteína con los clínicos para asegurar el diagnóstico. Estas complejidades hacen que cada caso precise de su propia estrategia en relación con el paradigma mutacional que se busca para seleccionar la técnica más adecuada para su diagnóstico. El clínico debe conocerlas para dar la correspondiente verosimilitud al resultado recibido y es responsabilidad del laboratorio especificar las técnicas empleadas y los límites de su capacidad de detección. Un problema creciente es el hallazgo casual o inesperado de mutaciones deletéreas en genes implicados en patología humana y que no se acompañan de clínica y que van a obligar a revisar en profundidad nuestros conceptos sobre la penetrancia y expresión de las enfermedades. Finalidad del diagnóstico molecular El diagnóstico molecular puede hacerse al sujeto afecto con finalidad diagnóstica, para predecir la evolución clínica o la respuesta a la terapia (diagnóstico genético clínico o farmacogenético), o a un sujeto a riesgo asintomático para evaluar su riesgo de desarrollar la enfermedad (diagnóstico genético predictivo o de susceptibilidad) y/o de transmitirla a su descendencia (diagnóstico molecular para consejo genético). Dentro del primero podemos diferenciar como subtipos especiales el diagnóstico prenatal, y el preimplantacional. Dentro del segundo grupo existen circunstancias que deben ser consideradas, como son el conocimiento del riesgo pre-prueba (diferente en los familiares de riesgo que en la población general), la edad de los sujetos a estudiar (los niños y adolescentes constituyen un caso especial), o el carácter de la alteración genética a estudiar (genes causativos o genes de susceptibilidad). En un futuro inmediato el reto será integrar una información genética de los genes causativos con otra sobre genes moduladores y eventuales factores ambientales para un consejo genético mucho más preciso. En los sujetos afectos y mentalmente competentes el diagnóstico debe hacerse tras un consentimiento informado proporcionando información suficiente, no sesgada y realista en cuanto a los posibles beneficios del conocimiento del estatus genético. En los sujetos incapacitados por su enfermedad o por otras causas, para poder dar un consentimiento válido se puede realizar el test en el mejor interés del paciente siempre que no existan mejores alternativas. En los niños sintomáticos, los responsables legales del mismo (padres o tutores) pueden autorizar la realización del test en el mejor interés del niño. Cuando estas circunstancias no estén claras se puede almacenar el ADN en un biobanco con todas las garantías establecidas, para un ulterior procesamiento que puede conducir a un diagnóstico a instancias de la familia o servir para investigación. En el diagnóstico de sujetos presintomáticos a riesgo, la actitud a seguir difiere mucho si nos encontramos ante una enfermedad dominante, en cuyo caso ser portador puede significar el desarrollo de sintomatología clínica posteriormente cualquiera que ésta sea, o una enfermedad recesiva, en la que las consecuencias personales de conocer el estatus molecular son mucho menores. En primer lugar, se debe ofrecer una información veraz sobre la enfermedad en cuestión, sus 7 posibles variantes clínicas, posibilidades de tratamiento, progresos razonablemente esperados de la investigación, y contestar a todas aquellas preguntas que puedan surgir al respecto. En segundo lugar, hay que proceder a identificar, por si estuviesen presentes, los estigmas clínicos característicos de la enfermedad, cuando éstos sean apreciables como resultado del interrogatorio o una exploración clínica. En tercer lugar, se debería proceder a analizar conjuntamente las motivaciones del deseo de conocer el estatus manifestado por el sujeto en cuestión, así como sus posibles consecuencias prácticas teniendo en cuenta la edad, la situación socioeconómica, el nivel educativo y cultural, el estado civil, opciones ético-religiosas, el deseo de tener hijos, y sobre todo la naturaleza más o menos penosa de la enfermedad junto con sus posibilidades de tratamiento y/o prevención. En cuarto lugar, en las enfermedades de curso clínico conocido y de penetrancia completa o cercana al 100% (es decir, aquellas en las que el valor predictivo de la prueba molecular respecto de tener o no la enfermedad y respecto a la expresión fenotípica es cercano al 100%) se debe proceder a hacer una evaluación de la estructura psicológica del individuo. Ésta se hará en relación con su capacidad de adaptación al impacto de un resultado, cualquiera que éste fuese, sobre su vida diaria. En aquellas enfermedades en las que el valor predictivo de la prueba no pueda establecerse, hay que ser muy cautos a la hora de indicar estas pruebas en sujetos asintomáticos, desaconsejándose formalmente en muchas situaciones, por generar los resultados una incertidumbre similar o más acusada que la previa. Sólo en los casos de consejo dirigido a la conducta reproductora se podría considerar su utilización, y tras un minucioso análisis de las ventajas e inconvenientes en cada caso. No se deben realizar estudios genéticos a sujetos asintomáticos menores de 18 años por su incapacidad para otorgar consentimiento debidamente informado. En el caso de que existiesen terapias preventivas eficaces para los estadios presintomáticos que permitiesen evitar el desarrollo o modificar el curso evolutivo de la enfermedad, se podría considerar su realización sometida a las cautelas generales para esa enfermedad en población adulta. Sólo en casos excepcionales debidamente justificados, en los que esperar a los 18 años conlleve un perjuicio superior para ese niño o adolescente, se puede considerar su realización fuera de esos supuestos. En caso de conflicto legal entre los intereses paternos o de los tutores legales y el médico, éste debe ser capaz de argumentar su negativa de manera lógica ante un comité ético independiente o, llegado el caso, ante la jurisdicción ordinaria. El diagnóstico prenatal es el que se realiza durante el período de gestación a aquellas mujeres con riesgo alto de tener un feto con una anomalía genética o cromosómica y se indica siempre a partir del conocimiento de un riesgo de magnitud conocida (diferente según patrones de herencia) para una enfermedad concreta. Los padres han de conocer las diferentes posibilidades que este diagnóstico encierra, y deben discutirse las opciones ante los posibles resultados con antelación a la realización del test. Como norma general no es aceptable su realización si uno o los dos progenitores no conocen o no desean conocer su estatus de portador. El diagnóstico prenatal se realiza a partir del ADN fetal extraído de una vellosidad corial obtenida entre la semana 10 y 12 de gestación, aunque existen ya técnicas que permiten obtener esa muestra de ADN a partir de células fetales presentes en la sangre materna circulante. El diagnóstico preimplantacional consiste en realizar un diagnóstico molecular a partir de una o dos células de uno de los embriones obtenidos mediante fecundación in vitro con los gametos sexuales de los progenitores de manera previa a su implantación en el útero materno. Ésta técnica es poco eficiente 8 en mujeres mayores de 35 años y muy costosa económicamente. La cantidad de ADN que se puede extraer de 1 o 2 células es muy escasa y esto complica la efectividad cuando las técnicas moleculares requieren cantidades mayores de ADN como es el caso de la técnica de Southern para la distrofia miotónica o la distrofia facioescapulohumeral. En algunos casos se puede hacer un diagnóstico indirecto con SNPs cuando esto son informativos. Las pruebas genéticas en investigación Todo el conocimiento sobre el funcionamiento de los genes, la expresión fenotípica de sus alteraciones y su eventual tratamiento descansa en la investigación clínica que trata de correlacionar los datos moleculares con los clínicos, por lo que ante todo trastorno neurológico donde exista la sospecha de que pueda deberse a una alteración genética debe plantearse su estudio molecular. El análisis de sujetos con manifestaciones clínicas atípicas de un trastorno conocido es especialmente importante, y el neurólogo tiene la obligación ética y profesional de profundizar en el estudio molecular de estos pacientes guardando todos los requisitos enunciados anteriormente y respetando el principio de autonomía del paciente. Cuando se trate de un trastorno neurológico de causa no filiada pero con carácter familiar, se debe considerar su estudio molecular con fines de investigación, ya que este tipo de estudios han sido claves para descubrir aspectos importantes en enfermedades neurológicas de etiología oscura. Igualmente es aconsejable guardar muestras de ADN de sujetos afectos de patologías de complejo diagnóstico o muy poco frecuente incluso no filiadas clínicamente cuando existe la sospecha de que puede tratarse de una condición hereditaria y se puede presumir un fallecimiento próximo del paciente. En las enfermedades que afectan a la capacidad de decisión del paciente el consentimiento para realizar la extracción y almacenamiento de estas muestras deberá otorgarse por parte de los familiares o tutores responsables. Con respecto a los genes de susceptibilidad es preciso contar con poblaciones de controles adecuadas y debidamente anonimizadas, cuyas características variarán dependiendo de los rasgos de los genes y estudios propuestos. Para poder disponer de ellos, los Biobancos de ADN en red son una herramienta fundamental. Por último, una cuestión candente es la aparición de hallazgos inesperados tanto en pacientes que se someten a una prueba molecular para diagnóstico como en controles. Como ya se ha mencionado, se comunican cada vez con más frecuencia casos o porcentajes en series de pacientes que portan una o varias mutaciones deletéreas en genes identificados previamente como relacionados con mutaciones humanas. Estas mutaciones son incluso mutaciones previamente detectadas que por razones no bien conocidas no se manifiestan fenotípicamente en determinados sujetos. Esclarecer los mecanismos de escape de estos sujetos solventados los indudables problemas éticos que esta situación provoca resulta crucial para poder avanzar en nuestra comprensión de la fisiopatología de las enfermedades neuromusculares y en las bases de la expresión fenotípica. 9 Bibliografía 1. Akinrinade O, Koskenvuo JW, Alastalo TP. Prevalence of Titin TruncatingVariants in General Population. PLoS One. 2015 Dec 23;10(12):e0145284. doi: 10.1371/journal.pone.0145284. eCollection 2015. 2. ASHG/ACMG Report. Points to consider: ethical, legal and psychosocial implications of genetic testing in children and adolescents. Am J Hum Genet 1995; 57: 1233-1241. 3. Bennett RL, Hampel HL, Mandell JB, Marks JH. Genetic counsellors: translating genomic science into clinical practice. J Clin Invest 2003; 112: 1274-1279. 4. Bird TD. Approaches to the patient with neurogenetic disease. Clin Lab Med 2010; 30(4):785-93. 5. Burgunder JM, Schöls L, Baets J, Andersen P, Gasser T, Szolnoki Z, et al. 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