Download Trabajo presentado

Sobre-expresión en embriones somáticos de alcornoque del gen CsTL1
que codifica una taumatina
E. Corredoira1, V. Cano1, M. C. San-José1, M.T Martínez1, M. Toribio2, A. Ballester1
Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia (IIAG-CSIC), Avda. de Vigo s/n,
Apartado 122, 15705 Santiago de Compostela, La Coruña
2
Instituto Madrileño de Investigación y Desarrollo Rural, Agrario y Alimentario
(IMIDRA), Finca "El Encín", Apartado 127, 28800 Alcalá de Henares, Madrid
e-mail: [email protected]
1
El alcornoque está seriamente afectado por "la seca", enfermedad causada, entre otras
factores, por los hongos Phytophthora cinnamomi, Diplodia mulila y Biscogniauxia
mediterranea. La transformación genética podría ser una herramienta complementaria a
los programas de mejora convencional con la introducción de genes que incrementen la
resistencia a dicha enfermedad. Dado que no se conocen los mecanismos de resistencia a
la seca, una alternativa sería lograr la sobreexpresión de proteínas relacionadas con la
patogénesis (PR), como las quitinasas o las proteínas tipo osmotina (taumatina). El
objetivo de este estudio fue definir el protocolo de transformación de embriones
somáticos (ES) de alcornoque con el gen CsTL1, identificado en embriones zigóticos de
castaño y que codifica una taumatina.
Se utilizaron tres líneas embriogénicas de alcornoque, aislándose grupos de 2-3 ES en
estado globular o torpedo como explantos diana. Estos explantos se cultivaron durante 5
días con la cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA105 que porta el vector binario
pK7WG2D-CsTL1. Este plásmido contiene además el gen de neomicina fosfotransferasa
(nptII) como gen de selección, y el gen de la proteína verde fluorescente (egfp).
En experimentos previos, se determinó por un lado la concentración letal de kanamicina
(agente de selección) y por otro el antibiótico para eliminar Agrobacterium después de la
transformación. Para ello, los ES se cultivaron en medio de proliferación suplementado
con
diferentesmconcentraciones
de
kanamicina
y
diferentes
concentraciones/combinaciones de carbenicilina y cefotaxima. La dosis de 125 mg/l de
kanamicina ó superiores provocan la inhibición casi completa de la embriogénesis
secundaria. La carbenicilina (300 mg/l) fue seleccionada como agente bactericida pues no
afecta a la proliferación de los ES.
Aunque se ha obtenido la transformación genética en ES de las tres líneas evaluadas, la
eficiencia de transformación, fue claramente genotipo dependiente obteniéndose los
mejores resultados (14%) en la línea TGR-3.
Esta investigación ha sido parcialmente subvencionada por el Ministerio de Economía y
Competitividad (España) mediante el proyecto AGL2013-47400-C4-3-R. Los autores
agradecen a la Dra. I. Allona y al Dr. C. Aragoncillo la cesión del gen CsTL1.