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Jacaranda
“LA AUTOINMUNIDAD COMO ETIOLOGIA EN LA PROSTATITIS CRONICA NO
BACTERIANA. ESTUDIO DE LA ENFERMEDAD HUMANA Y MODELOS
EXPERIMENTALES Y SUS CONSECUENCIAS SOBRE LA FERTILIDAD MASCULINA”
INTRODUCCIÓN
El término prostatitis denota una condición de inflamación de la próstata. La prostatitis es
una patología urológica muy común y de difícil tratamiento. Se ha estimado que más de la mitad de
los hombres sufren algún síntoma de prostatitis en algún momento de sus vidas. Se han reconocido
distintos tipos de prostatitis, siendo actualmente clasificadas como prostatitis agudas (generalmente
de etiología infecciosa) y prostatitis crónicas. El diagnóstico de las prostatitis se realiza mediante
sintomatología, ecografías y estudios microbiológicos para evaluar posibles agentes infecciosos (12). En el 90-95% de los casos de prostatitis crónica ningún agente infeccioso puede ser detectado, a
pesar de que se investigue exhaustivamente (1-2). Dentro de las prostatitis crónicas, tenemos 2
tipos: Prostatitis crónica bacteriana y Prostatitis crónica no bacteriana (PCNB, también llamada
idiopática o Prostatodinia) (1-2). En esta última no son conocidos aun los agentes etiológicos
causales, aunque evidencia proporcionada por algunos investigadores, proponen como posible
agente etiológico a un fenómeno autoinmune (3). Su diagnóstico se reserva a pacientes con
síntomas localizados en la próstata, niveles elevados de leucocitos en secreciones prostáticas, pero
ausencia de microorganismos en este fluido (4). Afecta a hombres jóvenes, en plena edad
productiva, los cuales experimentan dificultades en su calidad de vida laboral y sexual (1). Se
conoce muy poco de la patogénesis de la PCNB y el tratamiento de pacientes con PCNB suele
realizarse con agentes antimicrobianos, pero es inefectivo. Surgen aquí dos posibilidades en la
búsqueda de su etiología: una es que el aumento de leucocitos en secreción prostática se deba a una
infección microbiana no detectada y la otra es que este aumento de leucocitos sea debido a una
respuesta autoinmune. Un grupo de investigadores con sus datos experimentales apoyan la primera
posibilidad (5). Sin embargo en un importante número de casos no se ha podido detectar una causa
infecciosa para la inflamación observada. La segunda posibilidad es que la etiología de estos
pacientes sea autoinmune. Una serie de evidencias experimentales apoyan esta segunda posibilidad
(2-7). Doble y colaboradores demostraron depósitos de anticuerpos intraprostáticos en biopsias de
pacientes con PCNB (3). Se ha observado además un aumento de citoquinas proinflamatorias como
IL-1, IL-6 y TNF-α en plasma seminal de pacientes con PCNB (6). Alexander y col. demostraron
una respuesta linfoproliferativa contra plasma seminal en el 30% de los pacientes con PCNB (7).
Además, Jarrow y colaboradores encontraron una asociación entre anticuerpos antiespermatozoides
y PCNB indicando que PCNB es un factor de riesgo para la presencia de estos autoanticuerpos (8).
Una de las dificultades que se plantean en el estudio de esta enfermedad es la falta de
modelos experimentales adecuados. En nuestro grupo de trabajo hemos desarrollado un modelo
experimental de prostatitis autoinmune (PAE) que nosotros proponemos que puede ser considerado
modelo experimental de PCNB. Hemos realizado trabajos en modelos espontáneos e inducidos por
inmunización. La PAE en ratas Wistar se induce por medio de la inmunización con antígenos
prostáticos incorporados a adyuvantes (9-11). La PAE en ratones NOD se observa
espontáneamente con la edad avanzada o por inmunización de ratones jóvenes con antígenos
prostáticos incorporados a adyuvantes (12-13). En el modelo experimental de PAE pudimos
demostrar que uno de los autoantígenos más importantes involucrados en la respuesta autoinmune
humoral y celular es la proteína Prostateína o PSBP (8-14). Recientemente proteínas homólogas a
PSBP, las lipofilinas, han sido descriptas en humanos (15-16).
Por otro lado, si bien se postula a la prostatitis crónica como posible causa de infertilidad
masculina, los reportes en literatura son escasos y la relación entre prostatitis crónica, calidad
seminal e infertilidad es actualmente controvertida debido a que es un área que ha sido muy poco
estudiada (17-21).
Los antecedentes en el tema demuestran que existen pocos reportes en los que se haya
explorado la presencia de autoinmunidad celular y humoral anti próstata en pacientes con
prostatitis crónica. Mucho menos se conoce que mecanismos estarían operando en esta enfermedad,
tipo de células que infiltran y causan destrucción de las células prostáticas, secreción de citoquinas
inflamatorias en el sitio y otros aspectos como su relación con la calidad seminal y fertilidad
masculina.
Jacaranda
OBJETIVOS
Los objetivos del presente trabajo fueron:
 Avanzar en el conocimiento de las causas etiológicas y de los mecanismos patogénicos de
la enfermedad prostática humana, lo cual permitirá mejorar los tratamientos y calidad de
vida de estos pacientes.
 Avanzar en el desarrollo de un modelo experimental adecuado, válido y que imite la
patología observada en humanos.
MATERIALES Y METODOS
En la presentación de cada uno de los resultados se detalla la metodología empleada en
cada caso.
RESULTADOS
LA AUTOINMUNIDAD COMO ETIOLOGÍA EN LA ENFERMEDAD PROSTÁTICA
HUMANA
Con el objetivo de indagar sobre la posible etiología autoinmune de la PCNB, se
analizaron, en simultáneo, la presencia de infecciones previamente no detectadas y la presencia de
una respuesta inmune autorreactiva hacia diferentes antígenos prostáticos en 44 pacientes con un
diagnóstico previo de PCNB y en 15 individuos sanos controles.
I-A.
Presencia de infecciones previamente no detectadas como causa de prostatitis crónica
no bacteriana (PCNB)
La presencia de agentes infecciosos de patologías genitourinarias fue analizada en el grupo
de pacientes en estudio. Empleando diferentes técnicas de cultivo microbiológico y de biología
molecular, se pudo identificar la presencia de una infección bacteriana en 15 de los 44 (34%)
pacientes con diagnóstico previo de PCNB. Estos pacientes fueron clasificados como grupo A, o
grupo de pacientes que en realidad padecían de prostatitis crónica bacteriana. Como se observa en
la tabla 1, los microorganismos aislados fueron típicos agentes causales de prostatitis crónica
bacteriana: Escherichia coli y Chlamydia trachomatis fueron detectadas en un 26,7% (4 de 15) y
40% (6 de 15) de los pacientes con infección, respectivamente. Este resultado enfatiza el rol de
estos patógenos en la patología prostática y evidencia la necesidad de prestar especial atención en
su identificación al momento de realizar el diagnóstico de esta patología.
TABLA 1: AGENTES INFECCIOSOS AISLADOS
Paciente
Urocultivo
Cultivo de semen
P1
--
Chlamydia trachomatis
P2
--
Staphylococcus aureus
P3
--
Staphylococcus aureus
P4
Escherichia coli
--
P5
--
Candida albicans
P6
Trichomonas spp.
--
P7
--
Escherichia coli
Chlamydia trachomatis
P8
Trichomonas spp.
--
P9
--
Chlamydia trachomatis
P10
--
Chlamydia trachomatis
P11
--
Escherichia coli
P12
Trichomonas spp.
--
P13
--
Klebsiella pneumoniae
Chlamydia trachomatis
P14
Trichomonas spp.
Escherichia coli
P15
--
Staphylococcus aureus
Chlamydia trachomatis
En el caso de infección por Chlamydia trachomatis (CT), también se determinaron los
niveles de anticuerpos específicos (IgG e IgA) anti-CT en muestras de suero y plasma seminal,
como herramienta complementaria y útil en el diagnóstico. Se observaron títulos séricos positivos
de estos anticuerpos en 6/40 y 1/40 pacientes con diagnóstico previo de PCNB, para IgG e IgA
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respectivamente (Tabla 2). En plasma seminal, se observaron títulos positivos en 3/40 y 13/40
pacientes con diganóstico previo de PCNB para IgG e IgA respectivamente (Tabla 2). Cuando se
analizó su presencia sólo en los pacientes que evidenciaron infección por CT determinada por la
técnica de PCR, el 75% de estos pacientes presentó títulos positivos de estos anticuerpos (datos no
mostrados). Con estos resultados, puede afirmarse que la determinación de anticuerpos específicos
anti-CT es una herramienta útil y complementaria para el diagnóstico de infección urogenital por
CT.
TABLA 2: Determinación de anticuerpos específicos contra
Chlamydia trachomatis
Ig G anti Chlamydia trachomatis
Resultado (+)
Resultado (-)
Total
Suero
6 (15,0%)
34 (85.0%)
40 (100.0%)
Semen
3 (7,5%)
37 (92.5%)
40 (100.0%)
Ig A anti Chlamydia trachomatis
Resultado (+)
Resultado (-)
Total
Suero
1 (2,5%)
39 (97.5%)
40 (100.0%)
Semen
13 (32,5%)
27 (67.5%)
40 (100.0%)
Los 29 pacientes restantes (66 %) no evidenciaron infección alguna en las muestras de
semen y orina analizadas, al igual que los hombres normales utilizados como controles (15
individuos).
I-B.
Autoinmunidad contra antígenos prostáticos en pacientes con PCNB
I-Bi. Presencia de una respuesta celular autoinmune contra antígenos prostáticos en
pacientes con PCNB
Con el objetivo de evaluar a la autoinmunidad como posible causa de PCNB, se evaluó la
respuesta proliferativa de linfocitos de sangre periférica de pacientes y controles, en presencia de
los siguientes antígenos prostáticos: proteínas de plasma seminal humano (PS), un extracto de
proteínas de próstata humana normal (EP) y proteínas prostáticas purificadas como PSA y PAP.
Linfoproliferación frente a Antígenos Prostáticos
4
*
*
3,5
*
Indice de proliferación
PS
3
EP
2,5
PSA
*
2
PAP
1,5
1
0,5
0
Grupo A
Grupo B
Grupo C
Grupo D
Figura 1: Respuesta proliferativa de células mononucleares de sangre periférica (CMN) contra
antígenos prostáticos. CMN cultivadas in-vitro en presencia de una dilución de PS, EP, PSA y PAP,
de pacientes don prostatitis crónica infecciosa (Grupo A), prostatitis crónica no infecciosa (Grupos
B y C) y controles normales (Grupo D).
* P<0.05 vs. Grupo D.
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Ningún paciente del grupo A (pacientes que cursaban con alguna infección o prostatitis
crónica bacteriana al momento del análisis) evidenció respuesta linfoproliferativa positiva hacia los
autoantígenos ensayados. Por el contrario, se detectó una respuesta linfoproliferativa positiva hacia
la mayoría de los antígenos examinados en 10 pacientes con PCNB (34,4 %). Estos pacientes que
evidenciaron una respuesta linfoproliferativa positiva hacia antígenos prostáticos, sin evidencia de
infección alguna, fueron clasificados como grupo B (Figura 1). El resto de los pacientes analizados,
que no evidenciaron infección alguna ni presentaron respuesta linfoproliferativa hacia antígenos
prostáticos, fueron clasificados como grupo C (Figura 1). Los individuos controles fueron
clasificados como grupo D.
Una respuesta linfoproliferativa positiva hacia 2 o mas antígenos prostáticos fue encontrada
en el 60% de los pacientes del grupo B, siendo PS y PAP los autoantígenos reconocidos con mayor
frecuencia.
A continuación, la secreción específica de citoquinas como INF-γ e IL-10 fue analizada en
sobrenadantes de cultivo de células mononucleares de sangre periférica estimuladas con PS, PSA o
PAP.
IFN-γ en sobrenadantes de cultivo
A
100
*
80
PS
*
PS
70
PSA
PSA
PAP
PAP
60
50
40
30
20
10
0
Grupo A
Grupo B
Grupo C
Grupo D
IL-10 en sobrenadantes de cultivo
B
500
450
Concentración (pg/ml)
Figura 2:
Determinación de los
niveles de citoquinas (A:
IFN-γ; B: IL-10) en
sobrenadantes de cultivo
de los ensayos de
linfoproliferación
antígeno-específica.
Células mononucleares de
sangre periférica de
pacientes con prostatitis
crónica infecciosa (Grupo
A), prostatitis crónica no
infecciosa (Grupos B y C)
y controles normales
(Grupo D) fueron
cultivadas in-vitro en
presencia de una dilución
de PS, PSA y PAP.
* P<0.05 vs. Grupo D.
Concentración (pg/ml)
90
SP
400
350
PS
PSA
300
PSA
250
PAP
PAP
200
150
100
50
0
Grupo A
Grupo B
Grupo C
Grupo D
Como puede observarse en la Figura 2A, se evidenció que los linfocitos de los pacientes
del grupo B, no sólo son capaces de proliferar en respuesta al estímulo con antígenos prostáticos,
sino que al mismo tiempo secretan elevados niveles de INFγ. Este incremento en la secreción
específica de INFγ fue estadísticamente significativo en linfocitos de pacientes del grupo B
estimulados con PSA y PAP (p<0.05) con respecto al grupo control o grupo D. En contraste, no se
encontraron diferencias en la secreción específica de IL-10 en los diferentes grupos de pacientes en
estudio (Figura 2B).
Las secreciones de la próstata contribuyen hasta en un 40-60% al volumen del eyaculado,
por lo tanto puede inferirse que si una reacción inflamatoria esta llevándose a cabo dentro de
próstata, muchos de los mediadores inflamatorios estarán presentes en el plasma seminal.
Diferentes citoquinas, como TNF-α, IL-1β, INF-γ e IL-10, fueron analizadas en plasma seminal de
-4-
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los pacientes en estudio como un reflejo de lo que estaría ocurriendo en el microambiente
prostático.
Niveles de TNF-α e IL-1β en plasma seminal
A
100
Concentración (pg/ml)
80
TNF-alpha
TNF-α
70
60
IL-1Beta
50
IL-1β
40
30
20
10
0
Grupo A
Grupo B
Grupo C
Grupo D
Niveles de IFN-γ e IL-10 en plasma seminal
B
22
*
20
Concentración (pg/ml)
Figura 3:
Cuantificación de
citoquinas (A: IFN-γ e
IL-10; B: TNF-α e IL-1β)
en plasma seminal de
pacientes con prostatitis
crónica infecciosa
(Grupo A), prostatitis
crónica no infecciosa con
RLP positiva hacia
antígenos prostáticos
(Grupos B), prostatitis
crónica no infecciosa con
RLP negativa hacia
antígenos prostáticos
(Grupo C) y controles
normales (Grupo D).
* P<0.05 vs. Grupo D.
*
*
90
*
18
16
14
IFN-gamma
IFN-γ
12
10
IL-10
8
IL-10
6
4
2
0
Grupo A
Grupo B
Grupo C
Grupo D
Como puede observarse en la Figura 3-A, sólo los pacientes del grupo B evidenciaron
elevados niveles de citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α e IL-1β en plasma seminal, lo que
demuestra un estado inflamatorio de origen no infeccioso en el tracto genital de estos pacientes.
Cuando se analizaron los niveles de INF-γ e IL-10, los pacientes del grupo B y C presentaron
elevados niveles de INF-γ en plasma seminal, mientras que los niveles de IL-10 no evidenciaron
diferencias significativas entre los diferentes grupos (Figura 3-B). No obstante, pudo apreciarse que
en los individuos controles, hay un predominio de los niveles de esta citoquina
regulatoria/antinflamatoria sobre los niveles de INF-γ, lo cual representaría una situación
fisiológica normal ya que es bien conocido el predominio de citoquinas regulatorias y otras
sustancias anti-inflamatorias en semen (22). Como puede observarse, esta relación se encuentra
invertida en los pacientes de los grupos B y C, los cuales evidenciaron elevados niveles de INF-γ
en plasma seminal, lo que demuestra un imbalance o desvío de la respuesta inmune hacia un
fenotipo netamente pro-inflamatorio.
I-Bii.
Respuesta autoinmune humoral contra antígenos prostáticos en pacientes con PCNB
Al evaluar la posible respuesta humoral anti-antígenos prostáticos en los pacientes y
controles en estudio, no se encontraron diferencias significativas en los diferentes grupos de
pacientes con respecto a los individuos controles. Se observó una gran dispersión en los valores
observados por los pacientes de cada grupo, es decir, dentro de cada grupo se encontraron pacientes
con elevados valores de inmunoreactividad hacia antígenos prostáticos, pero a la vez también
pacientes con bajos valores de los mismos (Figura 4). Este fenómeno se observó en todos los
grupos de los pacientes analizados y lo que fue mas sorprendente, también en el grupo control
(Figura 4). Muestras de ciertos controles evidenciaron alta inmunoreactividad. El análisis consistió
en ensayar los niveles de inmunoglobulinas (IgG e IgM) anti PS, PSA y PAP en muestras de suero
(Figura 4) y plasma seminal (datos no mostrados), mediante técnicas de ELISA e Inmunoblot. La
ausencia de una diferencia en inmunoreactividad entre pacientes y controles podría deberse
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directamente a la ausencia de estos marcadores en esta enfermedad, o por el contrario, a que no
estarían siendo detectados por las metodología y antígenos utilizados en estos ensayos. Como
sucede en otras enfermedades autoinmunes, al realizar la determinación de autoanticuerpos contra
el antígeno completo, no se encuentran diferencias entre pacientes y controles, pero al usar péptidos
o determinadas secuencias peptídicas de los antígenos en cuestión, se encuentran diferencias
notables entre los mismos, por lo que la presencia de estos autoanticuerpos muchas veces queda
enmascarada por la elección errónea de la técnica o de los antígenos utilizados para su detección.
Determinación de anticuerpos séricos contra antígenos prostáticos
Densidad óptica (595 nm)
1841
IgG anti PS
1204
IgG anti PSA
IgG anti PAP
566
0 0
Grupo A
Grupo B
Grupo C
Grupo D
Figura 4: Determinación de los niveles de auto-anticuerpos séricos específicos contra antígenos
prostáticos en los diferentes grupos de pacientes y controles en estudio. Se determinaron los niveles séricos de
IgG específica hacia PS, PSA, y PAP, mediante ELISA indirecto.
Recientemente, se reportó la presencia de IgG específica hacia ciertos antígenos que
estarían involucrados en la patología prostática en pacientes con prostatitis crónica (23). Se
demostró, mediante la metodología SEREX, la presencia de IgG específica contra la proteína
MAD-PRO-34 en pacientes con PCNB, pero estos anticuerpos estaban ausentes en la población de
individuos normales. El antígeno MAD-PRO-34, reconocido preferentemente por la respuesta
inmune humoral de los pacientes con prostatitis crónica, es un autoantígeno nucleolar que
previamente fue identificado como una proteína potencialmente sobre-expresada en carcinoma
prostático y reconocido por la respuesta inmune de pacientes con cáncer de próstata (24) y cistitis
intersticial (25), una patología altamente relacionada con la PCNB. En colaboración con el grupo
de investigadores del laboratorio dirigido por el Dr. Douglas Mc Neel de la Universidad de
Wisconsin de los Estados Unidos de América, se llevó a cabo la determinación de estos
autoanticuerpos en los pacientes en estudio. La presencia de niveles positivos de IgG anti MADPRO-34 fue detectada en 4 pacientes, dos de ellos con PCNB sin causa aparente (Grupo C) y los
otros dos con PCNB con respuesta autoinmune hacia antígenos prostáticos (Grupo B)(Tabla 3).
Este resultado corrobora los hallazgos previos del grupo del Dr. Mc Neel y sustenta aún más la
etiología autoinmune de la patología presentada por estos pacientes.
Paciente
Grupo
Ensayo de linfoproliferación
PS
EP
PSA
PAP
IgG anti
MAD-PRO-34
Otros
Auto-anticuerpos
P16
B
1,28
1,97
1,40
1,66
Positivo
ANA
P24
B
2,23
0,90
1,64
2,67
Positivo
ANA
P33
C
0,97
0,35
0,66
0,98
Positivo
ANA
P42
C
1,13
1,74
1,06
1,04
Positivo
Negativo
Tabla 3: Determinación de IgG específica contra MAD-PRO-34 en suero mediante la
metodología SEREX. Análisis comparativo de los resultados positivos obtenidos en conjunto con
la respuesta linfoproliferativa frente a antígenos prostáticos y la determinación de otros autoanticuerpos.
ANA: anticuerpos anti-nucleares.
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I-C.
Análisis de la sintomatología clínica de los pacientes en estudio. Índice clínico según los
Institutos Nacionales de Salud (NIH) de los Estados Unidos de América (NIH-CPSI).
Los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de los Estados Unidos de América han
desarrollado un índice para mensurar la sintomatología y su impacto en la calidad de vida en
hombres que padecen PCNB. El índice se obtiene a partir de un cuestionario compuesto de 9 ítems
que comprenden 4 diferentes aspectos de la PCNB. El primer componente se refiere al dolor
(localización, intensidad y frecuencia del mismo). El segundo a la función urinaria (irritación y
obstrucción). El impacto en la calidad de vida y la calidad de vida global comprenden 3 ítems
adicionales que indagan sobre las consecuencias de los síntomas en las actividades diarias. Este
índice constituye una herramienta clínica sumamente útil, psicométricamente robusta y altamente
discriminadora para la valoración de los pacientes con PCNB.
Cuando se realizó el análisis del índice de síntomas a los pacientes en estudio, se pudo
determinar que existen diferencias en cuanto al componente que se refiere al dolor sufrido por los
pacientes. Como puede observarse en la Figura 5, se determinó que los pacientes con PCNB que
evidenciaron una respuesta autoinmune contra antígenos prostáticos fueron quienes presentaron el
dolor más frecuente (Figura 5A) e intenso (Figura 5B), circunscrito casi exclusivamente a la región
del periné y, sólo en algunos, también en pubis, pero no afectaba otras zonas anatómicas (Figura
5C). Otro hallazgo llamativo fue que estos pacientes autoinmunes presentaban fundamentalmente
dolor en la micción, pero no manifestaron tener dolor en la eyaculación (Figura 5D). En cuanto a
los dos ítems que componen la función urinaria, no se encontraron diferencias entre los distintos
grupos de pacientes analizados, manifestando todos ellos sentir una obstrucción parcial en la
micción y molestias al orinar (Figuras 5E y F). Finalmente, cuando se analizó el componente que
analiza la calidad de vida, se observó que si bien la PCNB tiene un notorio impacto negativo en la
calidad de vida de los pacientes, los pacientes que presentaban PCNB autoinmune fueron los que
manifestaron la peor calidad de vida, probablemente debido a que son a su vez quienes presentaban
mayor dolor (Figuras 5G y H).
Frecuencia del dolor
A
Intensidad del dolor
B
70
50
Pacientes (%)
45
60
Pacientes (%)
40
35
25
GrupoAA
Grupo
GrupoBB
Grupo
20
GrupoCC
Grupo
30
15
50
Grupo AA
Grupo
40
Grupo BB
Grupo
Grupo C
30
10
Grupo C
20
5
10
1
2
pr
e
en
te
0
3
4
5
6
7
8
H
Si
em
m
A
ab
itu
al
m
en
ud
o
ve
ce
s
0
A
R
ar
a
N
m
en
te
un
ca
0
C
Área del dolor
D
Momento del dolor
50
45
90
40
80
35
70
30
25
Grupo B
60
20
Grupo C
50
15
Grupo A
10
Grupo B
Pacientes (%)
Pacientes (%)
Grupo A
Grupo C
5
0
Perine
Testiculo
Pene
Pubis
Perine /
Pubis
40
Grupo A
30
Grupo B
Grupo C
20
10
0
Perine /
Test /
Pene
n
Si
do
r
lo
n
M
o
ci
ic
E
-7-
l
cu
ya
n
io
ac
Am
s
ba
Jacaranda
F
Sensación de vaciado
vesical incompleto
E
Polaquiuria
90
70
80
50
Grupo A
Grupo B
40
Grupo C
30
20
Pacientes (%)
Pacientes (%)
60
70
Grupo A
60
Grupo B
50
Grupo C
40
30
20
10
10
0
0
G
0
< 20%
< 50%
50%
0
> 50%
< 20%
< 50%
100%
80
50
70
45
> 50%
100%
Calidad de vida
H
Interferencia con la
actividad normal
50%
40
60
35
50
30
Grupo B
30
Grupo C
20
10
0
Grupo B
15
Grupo C
10
5
Pé
si
m
a
fe
liz
In
ul
ar
sa
tis
fa
ct
or
ia
In
Re
g
en
a
M
Sa
tis
fa
ct
or
Mucho
ia
a
0
Bastante
bu
Un poco
Grupo A
20
uy
Ninguna
25
Ó
pt
im
Pacientes (%)
Pacientes (%)
Grupo A
40
Figura 5: Análisis de la sintomatología clínica de acuerdo al Índice de Prostatitis Crónica de los Institutos de Salud de los
Estados Unidos de América (NIH-CPSI), en los diferentes grupos de pacientes en estudio. Detalle de la frecuencia (A), intensidad (B),
localización anatómica (C) y momento del dolor (D). Análisis de la sensación de vaciado vesical incompleto (E) y de la necesidad de
orinar mas de una vez en menos de dos horas o polaquiuria (F). Valoración de la interferencia de la enfermedad con el desarrollo de
actividades cotidianas (G) y su impacto sobre la calidad de vida (H).
CALIDAD ESPERMATICA EN PACIENTES
BACTERIANA
CON PROSTATITIS
CRONICA NO
Algunas investigaciones han asociado la prostatitis, principalmente infecciosa, con
anormalidades en la función y calidad espermática (26). No obstante, no existe hasta el momento
evidencia que fundamente alguna relación entre un estado inflamatorio debido a una
autoinmunidad contra próstata y calidad seminal. Por tal motivo, se analizaron los pacientes en
estudio con el objetivo de investigar si una respuesta autoinmune hacia antígenos prostáticos podría
tener alguna consecuencia sobre la calidad seminal de estos pacientes.
II-A.
Análisis de la calidad seminal en pacientes con prostatitis crónica
Para determinar si la PCNB tiene consecuencias sobre la calidad del semen, se realizó el
análisis de diversos parámetros de calidad espermática en muestras de semen de los pacientes en
estudio. Es importante destacar que este análisis se realizó en paralelo y en una modalidad a doble
ciego con los ensayos de proliferación antígeno-específicos de células mononucleares de sangre
periférica, por lo cual al momento de este análisis no se conocía la real etiología de los pacientes en
estudio, que habían sido previamente diagnosticados con PCNB. Los resultados de este análisis se
presentan en la Tabla 4 y Figura 6.
-8-
Jacaranda
Tabla 4: Análisis de diferentes parámetros de calidad seminal y PSA sérico
en pacientes y controles.
Grupos de pacientes
Análisis del Semen
Grupo A
Grupo B
Grupo C
Grupo D
variables
n = 15
(media  DE)
n = 10
(media  DE)
n = 19
(media  DE)
n = 15
(media  DE)
7,70 +/- 0,13
3,15 +/- 1,67
7,58 +/- 0,15
3,08 +/- 1,35
7,82 +/- 0,36
3,72 +/- 3,01
7,57 +/- 0,14
2,57 +/- 1,01
386,22 +/- 136,29
12,22 +/- 6,86 *
324,86 +/- 134,11
9,11 +/- 5,00
377,95 +/- 171,70
2,77 +/- 0,95
434,30 +/- 138,77
1,10 +/- 0,41
239,45 +/- 100,92
322,62 +/- 189,16
279,25 +/- 104,04
345,59 +/- 178,08
6,26 +/- 12,48 *
0,50 +/- 0,58
3,08 +/- 8,44
0,93 +/- 0,96
12,47 +/- 2,37
9,16 +/- 1,46
53,67 +/- 28,59 *
59,65 +/- 31,83 *
16,82 +/- 4,08
9,05 +/- 2,43
24,51 +/- 4,82
17,6 +/- 6,61
70,8 +/- 15,4 *
81,2 +/- 6,9
84,2 +/- 7,8
83,7 +/- 7,7
45,75 +/- 26,21
40,66 +/- 26,73
44,00 +/- 17,82
37,00 +/- 16,81
60,26 +/- 19,43
53,97 +/- 19,47
61,92 +/- 12,83
52,54 +/- 14,93
Plasma seminal
pH
Volumen (mL)
Próstata
Ácido cítrico (mg%)
PSA sérico (ng/ml)
Vesículas seminales
Fructosa (mg%)
Células no espermáticas
Céls. Peroxidasa (+) (x103/mL)
Citoquinas pro-inflamatorias
TNF-α (pg/ml)
IL-1β (pg/ml)
Espermatozoides
Viabilidad (%)
Motilidad espermática
Espermatozoides móviles (%)
Esp. móviles progresivos (%)
Los resultados se expresan como el valor promedio  desviación estándar.
* Una diferencia significativa de este grupo respecto del grupo D (p<0,05)
Al analizar el pH y el volumen del eyaculado en los diferentes grupos de pacientes en
estudio, no se encontraron diferencias significativas entre ellos (Tabla 4). Cuando se evaluaron
marcadores bioquímicos de funcionalidad de próstata y vesículas seminales (niveles acido cítrico y
fructosa en plasma seminal, respectivamente), no se encontraron diferencias estadísticamente
significativas con los valores arrojados por los individuos controles (Tabla 4). No obstante, los
niveles de ácido cítrico se encontraron reducidos (aunque no en forma estadísticamente
significativa) en todos los pacientes con cuadro clínico de prostatitis, siendo esta disminución más
evidente en el grupo B de pacientes o pacientes que evidenciaron una respuesta autoinmune hacia
antígenos prostáticos (Tabla 4). El PSA, una serino-proteasa producida por el epitelio prostático y
utilizado como marcador tumoral y de procesos infecciosos de la glándula prostática evidenció un
incremento significativo de los mismos en pacientes del grupo A (que cursaban con una infección),
con respecto al grupo control (Tabla 4). Si bien también se encontraron valores elevados y por
encima del límite máximo del rango de valores séricos normales (4 ng/ml) en pacientes del grupo
B, este incremento no fue estadísticamente significativo cuando se lo comparó con el grupo control
(Tabla 4).
Otro hallazgo significativo fue el hecho de que solamente los pacientes del grupo A (o
pacientes con prostatitis crónica infecciosa) presentaban un elevado recuento de células peroxidasa
positivas en semen, lo cual puede relacionarse con los bajos niveles de viabilidad espermática
observados en este grupo (Tabla 4). Cabe aquí destacar que el ensayo para determinar células
peroxidasa positivas sólo detecta macrófagos y leucocitos polimorfonucleares (neutrófilos,
eosinófilos y basófilos), pero no brinda información alguna acerca de la presencia o ausencia de
linfocitos. El hallazgo de un elevado recuento de estas células en los pacientes del grupo A fue un
resultado concordante con la naturaleza infecciosa de la prostatitis crónica presentada por los
-9-
Jacaranda
mismos. Un resultado negativo mediante esta técnica, para el grupo B (pacientes con prostatitis
crónica autoinmune), no descarta la posibilidad de que los mismos presenten un elevado número de
linfocitos en semen, ya que con este ensayo no es posible evidenciar su presencia.
Al analizar los niveles de motilidad espermática, se observó una disminución de la
motilidad (astenozoospermia) en pacientes de los grupos A y B (Tabla 4). Si bien esta diferencia no
fue estadísticamente significativa, la astenozoospermia sola o en combinación con otras
anormalidades, fue detectada en el 50% de los pacientes de estos dos grupos.
Concentración espermática
Hypo-Osmotic swelling test (HOS)
85
70
80
Esp. reactivos (%)
Concentración (.106/ml)
80
60
50
*
40
30
20
75
70
65
60
55
10
50
0
Grupo A Grupo B
Grupo C
Grupo A Grupo B
Grupo D
Grupo D
20
40
35
*
Esp. normales (%)
Esp. normales (%)
Grupo C
Morfología espermática (Kruger)
Morfología espermática (OMS)
30
*
*
25
20
15
15
*
10
5
0
Grupo A Grupo B
Grupo C
Grupo D
Grupo A Grupo B
Grupo C
Grupo D
Figura 6: Anormalidades en parámetros de calidad seminal en pacientes con prostatitis crónica. El análisis de la
concentración espermática (A), Test de hinchamiento hipo-osmótico (HOS) (B), morfología espermática analizada según los
lineamientos de la OMS (C) y según Kruger (D) se llevó a cabo en muestras de semen de pacientes con prostatitis crónica infecciosa
(Grupo A), prostatitis crónica no infecciosa con respuesta autoinmune hacia antígenos prostáticos (Grupo B), prostatitis crónica no
infecciosa sin respuesta autoinmune hacia antígenos prostáticos (Grupo C) y controles normales (Grupo D). Los resultados se
expresan como valor promedio +/- DE. * P<0.05 vs. Grupo D.
Como puede observarse en la Figura 6, se detectaron serias alteraciones en diferentes
parámetros de calidad espermática en pacientes del grupo B o pacientes que cursaban con
prostatitis crónica autoinmune. Se observó una marcada oligozoospermia (disminución en la
concentración de espermatozoides) en pacientes del grupo B y no en los otros grupos de pacientes
(Figura 6, p<0.05). De la misma manera, cuando se realizó el test de hinchamiento en medio hipoosmótico (test HOS), que evalúa la integridad y funcionalidad de la membrana plasmática del
espermatozoide, se evidenció la presencia de una severa alteración en la membrana plasmática de
los espermatozoides solamente en pacientes del grupo B (Figura 6, p<0.05). La morfología de los
espermatozoides también se encontró alterada en un elevado porcentaje de pacientes del grupo B y
también en pacientes del grupo A, cuando este parámetro fue analizado de acuerdo a los criterios
de la OMS (Figura 6, p<0.05). Cuando este mismo parámetro se analizó de acuerdo a criterios mas
estrictos de clasificación de espermatozoides normales (clasificación según Kruger), las mayores
alteraciones o anomalías morfológicas espermáticas fueron encontradas en pacientes del grupo B
(Figura 6, p<0.05). Cabe recordar que, además de las marcadas alteraciones en la calidad seminal
de los pacientes del grupo B o pacientes que evidenciaron una respuesta autoinmune hacia
antígenos prostáticos, estos pacientes también presentaron elevados niveles de citoquinas proinflamatorias en semen.
Es importante enfatizar que ninguno de los pacientes en estudio presentó anticuerpos antiespermatozoides, ya sea de isotipo IgG o IgA, excluyendo a este otro síndrome autoinmune
- 10 -
Jacaranda
(infertilidad debido a la presencia de autoanticuerpos anti-espermatozoide) como posible causa de
las anormalidades observadas en el semen de estos pacientes.
II-B. Análisis del estado del eje hipotálamo-hipófiso-gonadal en pacientes con prostatitis
crónica
Es sumamente conocida la importancia de la regulación del eje hipotálamo-hipófisisgónadas en la función testicular debido al rol de los andrógenos y gonadotropinas en la
espermatogénesis (27, 28). Con el objetivo de indagar acerca de la causa de las alteraciones en
concentración, motilidad y morfología espermática observadas en los pacientes que evidenciaron
una respuesta autoinmune hacia antígenos prostáticos, se decidió investigar la función testicular y
el estado endócrino del eje hipotálamo-hipófisis-testículo.
Como puede apreciarse en la Tabla 5, los niveles séricos de hormona folículo-estimulante
(FSH) (VN: 1,7-11,5 mUI/ml), luteinizante (LH) (VN: 0,5-8,0 mUI/ml) y testosterona (VN: 2,8-8,8
ng/ml) se encontraron dentro de los rangos normales de referencia en los diferentes grupos de
pacientes y controles en estudio. Estos resultados evidenciaron un estado endócrino normal del eje
hipotálamo-hipófisis-testículo en los pacientes en estudio, por lo tanto excluyen al factor hormonal
como posible causa de las alteraciones seminales observadas.
Tabla 5: Estado funcional endócrino del eje Hipotálamo-Hipófisis-Testículo (HHT)
Análisis de los niveles séricos de hormona folículo-estimulante (FSH), luteinizante (LH) y testosterona
en los diferentes grupos de pacientes y controles en estudio.
Grupos de pacientes
Análisis del eje HHT
Grupo A
Grupo B
Grupo C
Grupo D
hormonas
n = 15
n = 10
n = 19
n = 15
4,98 +/- 5,14
(1,00-17,50)
4,54 +/- 3,51
(2,62-13,10)
4,86 +/- 3,90
(0,87-16,60)
3,32 +/- 4,48
(0,84-17,30)
2,85 +/- 1,60
(1,20-6,50)
4,12 +/- 2,41
(2,30-8,90)
3,13 +/- 1,31
(1,50-6,20)
2,54 +/- 0,88
(0,83-4,00)
4,53 +/- 1,45
(2,77-8,84)
3,90 +/- 1,59
(1,91-6,64)
4,18 +/- 1,06
(2,75-6,13)
4,39 +/- 1,22
(2,35-6,36)
FSH
media  DE (mUI/ml)
rango (mín-máx) (mUI/ml)
LH
media  DE (mUI/ml)
rango (mín-máx) (mUI/ml)
Testosterona
media  DE (ng/ml)
rango (mín-máx) (ng/ml)
Los resultados se expresan como el valor promedio ± desviación estándar.
ESTUDIO DE UN MODELO EXPERIMENTAL DE PROSTATITIS CRÓNICA
AUTOINMUNE
La posibilidad de inducir prostatitis en animales de laboratorio mediante la manipulación
de su sistema inmunológico es una herramienta útil para el avance en el conocimiento acerca de
esta patología. La inmunización con antígenos prostáticos emulsionados en CFA (29, 30), dan
como resultado infiltrados inflamatorios en el tejido glandular prostático similar a aquellos vistos
en pacientes con PCNB (31).
Nuestro grupo de trabajo ha desarrollado en las últimas dos décadas un modelo de
prostatitis autoinmune experimental (PAE) en ratas, la cual se induce mediante la inmunización
activa de ratas Wistar macho con un extracto proteico de glándulas accesorias masculinas (próstata
y vesículas seminales) en CFA (29). En nuestro grupo de investigación se ha identificado el mayor
autoantígeno blanco de este modelo de PAE, ha sido purificado, secuenciado e identificado como
Prostateína (PSBP) (12, 9). Esta proteína purificada administrada con CFA, es capaz de inducir la
enfermedad que se genera con la inmunización con el extracto proteico completo de glándulas
masculinas anexas en ratas normales (9, 14).
- 11 -
Jacaranda
La cepa de ratones no obesos diabéticos (NOD) tiene una predisposición genética a
desarrollar lesiones autoinmunes, ya sea inducidas por inmunización activa o espontáneamente. En
nuestro grupo, también se ha desarrollado un modelo de PAE en esta cepa de ratones, mediante la
inyección de, ya sea un extracto de proteínas prostáticas o de PSBP purificada, emulsionados en
CFA (12, 14). Los ratones NOD desarrollan una forma más agresiva de PAE que la desarrollada
por las ratas Wistar, cepa utilizada en el modelo de prostatitis autoinmune experimental
originalmente desarrollado y usado como referencia (12).
Debido a que poco se conoce acerca de los mecanismos inmunopatogénicos involucrados
en el desarrollo de la enfermedad en este modelo de prostatitis autoinmune desarrollado en ratones
NOD, nos propusimos caracterizar este modelo experimental, enfocándonos en el estudio de los
mecanismos inmunológicos involucrados en el desarrollo de la enfermedad.
Estudio del modelo de PAE desarrollado en ratones de la cepa NOD
Protocolo Experimental
Se inmunizaron ratones NOD macho de 8 semanas de edad con antígenos prostáticos
(PSBP) y se utilizó un grupo control (C), al cual se lo inyectó con solución salina diluyente. A lo
largo del protocolo experimental se realizaron diferentes experimentos para estudiar el desarrollo y
mecanismos de la prostatitis autoinmune.
Protocolo Experimental
Día 0
Grupo C
(PBS)
0.1 mL/ratón
N=5
Día 15
Análisis:
PBS/CFA
Grupo PSBP
(Prostateína)
Linfoproliferación
Día 21
Análisis:
PBS/CFA
Linfoproliferación
Auto-anticuerpos
Auto-anticuerpos
Citoquinas
Citoquinas
Histología
50 g/ratón
N=5
Día 8
PSBP/CFA
Histología
PSBP/CFA
III-A. Lesiones histológicas en ratones NOD inmunizados con PSBP
Se realizó el análisis histológico de próstata, vesículas seminales y riñón de los diferentes
grupos experimentales. Se observaron lesiones de intensidad variable de manera consistente en la
glándula prostática de todos los animales inmunizados con PSBP (Figura 7-A). Las lesiones se
caracterizaron por presentar una típica infiltración estromal y perivascular de células
mononucleares, acompañada de edema, hemorragia y de una alteración de la arquitectura tisular
(Figura 7-A). Las próstatas de los animales del grupo C no evidenciaron ninguna lesión ni
alteración de la arquitectura tisular normal (Figura 7-A). Cuando se realizaron estudios de
inmunofluorescencia utilizando anticuerpos anti-marcadores panleucocitarios (anticuerpo
monoclonal anti-CD45) sobre cortes histológicos de próstata de los animales en estudio, se observó
que la presencia del marcador CD45 (linfocitos, monocitos, granulocitos, macrófagos y células
dendríticas) aumentaba a medida que progresaba la enfermedad en los animales autoinmunes
(Grupo PSBP)(Figura 7-B).
Al analizar la presencia de citoquinas inflamatorias en tejido prostático de los animales en
estudio utilizando la técnica de PCR en tiempo real, se observó un aumento en la expresión de IFNγ a medida que progresaba la enfermedad experimental (Figura 7-C). Se observaron también
elevados niveles de TNF-α en la próstata de los animales autoinmunes, con tendencia en aumento,
aunque no de manera significativa, a medida que progresaba la enfermedad (Figura 7-C). Por el
contrario y en concordancia con el desarrollo de una reacción inflamatoria, se observó un descenso
en los valores de IL-10 (Figura 7-C). De esta manera, la respuesta celular anti-antígenos prostáticos
- 12 -
Jacaranda
detectada previamente en periferia también es observada in-situ, con presencia de un infiltrado
celular y secreción de citoquinas inflamatorias.
B
C
IFN-γ en próstata
IFN-γ (n. copias/n. copias β-actina)
TNF-α en próstata
6,00
*
18,00
TNF-α (n. copias/n. copias β-actina)
A
13,50
9,00
4,50
0,00
5,35
4,70
4,05
3,40
Día 8
Día 21
Día 8
Día 21
IL-10 en próstata
IL-10 (n. copias/n. copias β-actina)
10,00
7,50
5,00
2,50
0,00
Día 8
Día 21
Figura 7: Análisis del desarrollo de prostatitis autoinmune en tejido prostático. A: Análisis histológico de cortes de
próstata de animales autoinmunes (PSBP) y controles (C), teñidos con hematoxilina/eosina evidenciando un infiltrado
mononuclear en el espacio perivascular y parénquima de la próstata, acompañado de hemorragia y alteración de la
arquitectura tisular normal (día 21 post-inmunización). B: Identificación del infiltrado mononuclear con un anticuerpo
monoclonal panleucocitario anti CD45 mediante inmunofluorescencia. C: Análisis de citoquinas en tejido prostático de los
animales autoinmunes a lo largo del desarrollo de PAE mediante PCR en tiempo real. Los resultados se expresan como
valor promedio +/- DE. * P<0.01.
No se observó lesión alguna en las vesículas seminales y riñón de ninguno de los grupos
experimentales, lo cual demuestra que sólo la glándula prostática y no otros órganos están siendo
atacados en el desarrollo de la prostatitis autoinmune experimental.
III-B. Desarrollo de una respuesta inmune celular específica en ratones NOD inmunizados con
PSBP
Se evaluó la respuesta celular específica contra PSBP (el principal autoantígeno en este
modelo de PAE). Se analizó la respuesta proliferativa de CMN de ganglios linfáticos drenantes y
de bazo en los días 8 y 21 del protocolo experimental. Como puede observarse en la Figura 8,
animales inmunizados con PSBP evidenciaron una elevada respuesta linfoproliferativa específica
cuando sus linfocitos fueron estimulados in-vitro con PSBP. Los animales del grupo control (C),
que fueron inmunizados con solución salina diluyente, no evidenciaron respuesta celular específica
contra PSBP. Estos resultados demuestran que luego de la inmunización con antígenos prostáticos
- 13 -
Jacaranda
(PSBP), los ratones NOD desarrollan una fuerte respuesta de linfocitos T específicos que son
capaces de infiltrar y causar daño en la glándula prostática, y de activarse y proliferar in-vitro
cuando son estimulados con este antígeno.
Linfoproliferación específica frente a PSBP
Indice de proliferación
20
*
15
Grupo C
10
Grupo PSBP
*
5
0
8 dpi
21 dpi
Figura 8: Respuesta proliferativa (expresada como índice de proliferación) de células mononucleares de bazo, de
animales autoinmunes y controles, cuando las mismas son estimuladas in-vitro con PSBP, a lo largo del protocolo
experimental (8 y 21 días post-inmunización). Los resultados se expresan como valor promedio +/- DE.
* P<0.01.
Con el objetivo de caracterizar el perfil inmunológico de la repuesta autoinmune generada,
se midieron los niveles de IL-2; IL-4; INF-γ e IL-13 en sobrenadantes de cultivo del ensayo de
linfoproliferación luego de 72 horas de cultivo.
IL-2 en sobrenadantes de cultivo
Concentración (pgmL)
300
B
IFN-γ en sobrenadantes de cultivo
1800
*
Concentración (pgmL)
A
*
250
200
150
100
50
1200
1000
800
Grupo C
*
Grupo PSBP
600
400
200
0
0
8 dpi
C
*
1600
1400
21 dpi
IL-4 en sobrenadantes de cultivo
8 dpi
D
21 dpi
IL-13 en sobrenadantes de cultivo
400
Concentración (pgmL)
Concentración (pgmL)
400
350
300
250
200
150
100
50
350
300
250
Grupo C
200
150
Grupo PSBP
*
100
50
0
0
8 dpi
8 dpi
21 dpi
21 dpi
Figura 9: Determinación de citoquinas en sobrenadantes del cultivo de linfoproliferación. Se determinaron las
concentraciones de IL-2 (A), IFN-γ (B), IL-4 (C) e IL-13 (D) en los ensayos de proliferación PSBP-específica de céulas
mononucleares de bazo de los animales autoinmunes (Grupo PSBP) y controles (Grupo C) a lo largo del protocolo
experimental (8 y 21 días post-inmunización). Los resultados se expresan como valor promedio +/- DE. * P<0.01.
Como puede observarse en la Figura 9-A, se detectó una incrementada secreción específica
de IL-2 en células de los animales inmunizados cuando fueron estimuladas con PSBP, lo cual
refleja la presencia de linfocitos específicos contra PSBP funcionalmente activos en presencia del
antígeno para el cual son específicos. Cuando se midió la secreción específica de INF-γ, se observó
que las células de los animales inmunizados con PSBP, cuando son estimuladas con este antígeno,
aparte de activarse y proliferar, secretan niveles sustancialmente elevados de esta citoquina a lo
largo de todo el protocolo experimental, evidenciándose un aumento del mismo luego de la
- 14 -
Jacaranda
segunda inmunización con el antígeno (Figura 9-B), lo que se correlacionó con el aumento de esta
citoquina observado en próstata de los animales autoinmunes. Por el contrario, se detectó una
producción nula de IL-4 (Figura 9-C) y mínima de IL-13 por parte de estas células (Figura 9-D),
indicando que la inmunidad específica generada contra PSBP es principalmente mediada por
células, donde el perfil inmunológico asociado es netamente de linfocitos T cooperadores tipo 1.
III-D. Desarrollo de una respuesta inmune humoral específica en ratones NOD inmunizados
con PSBP
Con el objetivo de estudiar la respuesta autoinmune humoral, se midieron los niveles de
inmunoglobulinas séricas totales contra PSBP en los días 8 y 21 del protocolo experimental.
Asimismo, se midieron los niveles de las subclases IgG1 e IgG2a, que están asociados a un perfil
de respuesta inmune tipo 2 o 1, respectivamente.
Como puede observarse en la Figura 10-A, se detectaron elevados niveles de IgG sérica
total específica hacia PSBP en los animales del grupo PSBP. Estos niveles de autoanticuerpos
fueron notablemente visibles en el día 8 del protocolo experimental y se incrementaron luego de la
segunda inmunización (dia 21, Figura 10-A). Al medir las subclases de IgG, se observó que el
principal subtipo involucrado en esta respuesta autoinmune fue IgG2a, la cual evidenció elevados
niveles que se incrementaron a lo largo del desarrollo de la enfermedad (Figura 10-B). Por el
contrario, se detectaron niveles muy bajos o casi nulos de IgG1 específica (Figura 10-C). Estos
resultados indican que los ratones NOD reaccionan a la inmunización con PSBP desarrollando una
respuesta inmune celular y humoral específica con un perfil de tipo Th1.
IgG total anti-PSBP
B
*
70
Indice de DO
Indice de DO
40
30
20
0
8 dpi
21 dpi
20
0
40
*
30
10
10
IgG1 anti-PSBP
50
40
*
C
50
60
50
IgG2a anti-PSBP
Indice de DO
A
*
8 dpi
Grupo C
30
Grupo PSBP
20
10
21 dpi
0
8 dpi
21 dpi
Figura 10: Cinética de la respuesta inmune humoral contra PSBP en ratones NOD controles y autoinmunes determinada
por ELISA indirecto. (A): IgG total específica hacia PSBP; (B) IgG2a específica hacia PSBP e (C) IgG1 específica hacia
PSBP en suero de animales autoinmunes y controles a lo largo del protocolo experimental (8 y 21 días post-inmunización). Los
resultados se expresan como valor promedio +/- DE. * P<0.01.
ESTUDIO DE LA PROSTATITIS AUTOINMUNE Y SUS EFECTOS SOBRE LA CALIDAD
SEMINAL EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE PROSTATITIS AUTOINMUNE
Previamente, se demostró que pacientes que evidenciaron prostatitis crónica autoinmune
presentaron las mayores alteraciones en la calidad seminal. A partir de estos resultados, surgieron
numerosos interrogantes, como cuándo?, dónde? y cómo? se está produciendo el daño que resulta
en las alteraciones observadas en la calidad seminal de estos pacientes con prostatitis crónica
autoinmune. Otros interrogantes surgidos, fueron acerca de los mediadores y mecanismos
patogénicos involucrados. Para contestar estos interrogantes, se realizaron estudios en el modelo de
PAE desarrollado en ratas Wistar.
Protocolo Experimental
Se utilizaron ratas macho de la cepa Wistar y fueron divididos en tres grupos
experimentales: un grupo inmunizado con EP; otro grupo inmunizado con PSBP y un grupo control
al cual se lo inyectó con solución salina diluyente. Los animales recibieron inmunizaciones y luego
de la segunda y tercera inmunización se realizaron diferentes experimentos para estudiar el
desarrollo de prostatitis autoinmune y para evaluar la calidad espermática y fertilidad de estos
animales.
- 15 -
Jacaranda
Protocolo Experimental
Día 0
Día 20
Día 27
Grupo C
(PBS)
0.1 mL/rata
N = 17
Análisis:
PBS/CFA
PBS/CFA
EP/CFA
EP/CFA
Parámetros
Seminales
Grupo EP
(Extracto Prostático)
1 mg/rata
N = 20
Día 35
Respuesta
Inmune
Día 42
Análisis:
PBS/CFA
EP/CFA
Parámetros
Seminales y
Epididimarios
Respuesta
Inmune
Histología
Grupo PSBP
(Prostateína)
Histología
120 g/rata
N = 18
PSBP/CFA
PSBP/CFA
PSBP/CFA
V-A.
Lesiones histológicas en ratas de la cepa Wistar inmunizadas con antígenos prostáticos
Al realizar el análisis histológico de la próstata, se observaron lesiones de intensidad
variable de manera consistente en todos los animales inmunizados, ya sea con EP o con PSBP
purificada, caracterizadas por la presencia de un aumento en el calibre de los vasos sanguíneos e
infiltrados focalizados de linfocitos y mastocitos en el estroma y en el espacio perivascular,
acompañados de edema y hemorragia (Figura 11). No se detectaron alteraciones histológicas en
próstata de los animales del grupo control (Grupo C), ni en las vesículas seminales, testículo y
epidídimo de los animales de los tres grupos experimentales en estudio (Figura 11).
A
B
C
D
Figura 11: Análisis histológico de cortes parafinados de próstata de ratas autoinmunes, coloreados con hematoxilinaeosina. Microfotografías de los cortes de animales inmunizados con EP (A:100X y C: 400X) y de animales inmunizados
con PSBP (B:250X y D:400X) en el día 42 del protocolo experimental.. Se observa la presencia de un infiltrado
mononuclear y de células cebadas en el estroma glandular prostático, como así también extravasación de linfocitos desde
una arteria e infiltrando en dirección del epitelio glandular, lugar donde se encuentra el autoantígeno principal,
prostateína o PSBP.
V-B.
Desarrollo de una respuesta autoinmune celular específica contra antígenos prostáticos
Se evaluó la respuesta celular específica contra diferentes antígenos prostáticos: EP, PSBP
o PAP en los días 27 y 42 del esquema experimental, luego de la segunda y tercer inmunización
respectivamente. En ambos días, tanto los animales inmunizados con EP o con PSBP evidenciaron
una elevada respuesta linfoproliferativa específica contra los diferentes antígenos prostáticos
ensayados (Figura 12).
- 16 -
Jacaranda
Linfoproliferación específica hacia
antígenos prostáticos
*
Indice de proliferación
7,58
Antígeno
ensayado
5,69
*
EP
*
*
PSBP
*
3,79
PAP
*
1,90
0,00
Grupo C
Grupo EP
Grupo PSBP
Figura 12: Respuesta proliferativa (expresada como índice de proliferación) de células mononucleares de bazo de
animales autoinmunes (Grupos EP y PSBP) y controles (Grupo C),cuando las mismas fueron estimuladas in-vitro con
antígenos del extracto prostático (EP), prostateína (PSBP) o fosfatasa ácida prostática (PAP).Los resultados presentados
corresponden al día 42 del protocolo experimental, luego de la tercera inmunización. * P<0.01 vs. Grupo C.
Estos resultados demuestran que, al igual que ratones de la cepa NOD, luego de la
inmunización con antígenos prostáticos (EP o PSBP), ratas de la cepa Wistar desarrollan una
respuesta de linfocitos T específicos capaces de activarse y proliferar in-vitro cuando son
estimulados con antígenos prostáticos (Figura 12).
V-C.
Desarrollo de una respuesta autoinmune humoral específica a nivel local y sistémico
Al evaluar la presencia de autoanticuerpos específicos contra antígenos prostáticos, los
animales inmunizados, ya sea con EP o PSBP, presentaron elevados niveles de IgG específica
contra EP y PSBP (Figura 13).
Respuesta inmune humoral sistémica
específica hacia antígenos prostáticos
*
Indice de Densidad Óptica
12,04
9,03
Antígeno
ensayado
*
6,02
EP
PSBP
*
*
PAP
3,01
0,00
Grupo C
Grupo EP
Grupo PSBP
Figura 13: Respuesta inmune humoral sistémica hacia antígenos prostáticos en ratas inmunizadas con EP o PSBP. Se
determinaron los niveles de IgG sérica específica hacia antígenos del extracto prostático (EP), prostateína (PSBP), fosfatasa
ácida prostática (PAP), extracto testicular y extracto epididimario, en animales autoinmunes (Grupos EP y PSBP) y
controles (Grupo C). Los resultados presentados corresponden al día 42 del protocolo experimental, luego de la tercera
inmunización.
* P<0.01 vs. Grupo C.
Luego se quiso investigar la presencia de autoanticuerpos a nivel local o más precisamente
donde está ocurriendo la reacción autoinmune. El semen constituye una muestra representativa para
el estudio de lo que esta ocurriendo a nivel de la glándula prostática debido a que las secreciones
prostáticas contribuyen en un 40-60 % al volumen del eyaculado. Se obtuvieron muestras de semen
de los animales en estudio, mediante la técnica de electroeyaculación, y se determinaron los niveles
de autoanticuerpos específicos contra PSBP en plasma seminal de los animales en estudio. Como
puede observarse en la Figura 14, no se observaron diferencias apreciables en los niveles seminales
de IgA específica contra PSBP en los diferentes grupos experimentales. No obstante, se pudo
comprobar que ambos grupos de animales autoinmunes evidenciaban elevados niveles seminales
de IgG específica contra PSBP, cuando fueron comparados con el grupo control (C) (Figura 14,
p<0.01). Cabe destacar, que el tracto genito-urinario tiene ciertas particularidades, una de las cuales
- 17 -
Jacaranda
es que el isotipo de inmunoglobulina predominante en la mucosa del mismo es IgG y no IgA, la
cual es típica del tracto gastrointestinal (32).
Respuesta inmune humoral local específica
hacia PSBP
4.5
*
4
Indice de densidad òptica
3.5
3
*
Ig analizada
2.5
IgA
2
IgG
1.5
1
0.5
0
Grupo C
Grupo EP
Grupo PSBP
Figura 13: Respuesta inmune humoral local hacia antígenos prostáticos en ratas inmunizadas con EP o PSBP. Niveles de
IgA e IgG específicas hacia prostateína (PSBP) en plasma seminal de animales autoinmunes (Grupos EP y PSBP) y
controles (Grupo C). Los resultados presentados corresponden al día 42 del protocolo experimental, luego de la tercera
inmunización. * P<0.01 vs. Grupo C.
Todos estos resultados indican que los animales inmunizados con antígenos prostáticos desarrollan
lesiones inflamatorias en tejido prostático y que producen una respuesta autoinmune celular y
humoral específica contra antígenos prostáticos, que puede ser detectada tanto a nivel sistémico
como local.
V-D. Presencia de elevados niveles de citoquinas y metabolitos inflamatorios en plasma
seminal de los animales autoinmunes
A continuación, se determinaron los niveles de mediadores pro-inflamatorios (ON, ROS,
TNF-α e INF-γ) en muestras de plasma seminal de los animales autoinmunes (Grupos EP y PSBP)
y controles (Grupo C) como reflejo de lo que estaba ocurriendo en el microambiente prostático.
Mediadores inflamatorios en el plasma seminal
A
B
ON en Plasma Seminal
ROS en Plasma Seminal
200
2,5
*
180
*
2
140
120
*
URL
ON (mol/ml)
160
100
80
*
1,5
1
60
40
0,5
20
0
0
C
EP
PSBP
C
IFN- en Plasma Seminal
C
PSBP
TNF- en Plasma Seminal
D
160
500
450
*
Concentración (pg/ml)
*
140
Concentración (pg/ml)
EP
120
100
80
60
40
20
*
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0
C
EP
PSBP
C
EP
PSBP
Figura 14: Presencia de metabolitos y citoquinas pro-inflamatorias en el plasma seminal de los grupos de animales
autoinmunes (EP y PSBP) y en el grupo control (C). Los niveles de ON (A), ROS (B), IFN-γ (C) y TNF-α (D) fueron
determinados por la técnica de Griess, quimioluminiscencia y por ELISA sándwich, respectivamente, en plasma seminal
obtenido mediante electroeyaculación de los animales autoinmunes y controles. Los resultados corresponden al día 42 del
protocolo experimental. * P<0.05 vs. C.
- 18 -
Jacaranda
Se detectó un marcado incremento en los niveles de ON y ROS en plasma seminal de los
animales autoinmunes (Grupos EP y PSBP) (Grupo C) (Figura 14, p<0.05). De la misma manera,
se detectaron niveles elevados de TNF-α en plasma seminal de los animales autoinmunes, aunque
sólo con un incremento significativo en muestras de los animales del grupo EP (Figura 14, p<0.05).
Cuando se evaluaron los niveles de INF-γ, se obtuvo un resultado similar, evidenciándose elevados
niveles de esta citoquina pro-inflamatoria en plasma seminal de los animales con prostatitis
autoinmune (Grupos EP y PSBP) (Figura 14, p<0.05).
Estos resultados indican la presencia de un proceso inflamatorio en activo desarrollo en la
próstata de los animales inmunizados con antígenos prostáticos (EP y PSBP), como consecuencia
de una respuesta autoinmune contra antígenos prostáticos, la cual puede ser detectada en muestras
de semen.
V-E.
Alteración de la funcionalidad prostática en los animales autoinmunes
El zinc y el ácido cítrico son clásicos marcadores bioquímicos de funcionalidad de la
glándula prostática, como lo es la fructosa y la α-glucosidasa neutra para vesículas seminales y
epidídimo respectivamente (33). Como puede apreciarse en la Figura 15-A, no se observaron
diferencias apreciables en los niveles de fructosa y α-glucosidasa neutra en plasma seminal de los
animales en estudio. Muy por el contrario, se evidenció una disminución significativa en la
concentración de acido cítrico en plasma seminal de ambos grupos de animales autoinmunes (EP y
PSBP) con respecto a los niveles encontrados en el grupo control (C) (Figura 15-B, p<0.05). Esta
disminución en la concentración de ácido cítrico en plasma seminal demostró una alteración en el
normal funcionamiento de esta glándula en los animales con prostatitis autoinmune.
Funcionalidad de las glándulas masculinas
sexuales accesorias
Niveles de Fructosa y α-glucosidasa
en Plasma Seminal
A
Fructosa
Niveles de Ácido Cítrico
en Plasma Seminal
B
Alfa-glucosidasa
C
C
EP
EP
*
PSBP
PSBP
*
0
50
100
150
200
250
300
0
Concentración de Fructosa (mg %)
Concentración de α-glucosidasa (mU/vol)
100
200
300
400
Concentración de Ácido Cítrico (mg %)
Figura 15: Marcadores bioquímicos de la funcionalidad de vesículas seminales, epidídimo y próstata en plasma seminal de
ambos grupos de animales autoinmunes (EP y PSBP) y controles (C). Los niveles de Fructosa y α-glucosidasa (A) y Ácido
Cítrico (B) fueron determinados en muestras de plasma seminal, de animales autoinmunes y controles, obtenido mediante
electroeyaculación y de acuerdo a los lineamientos de la OMS. Los resultados corresponden al día 42 del protocolo
experimental. * P<0.05 vs. C.
Estos resultados corroboran que la inmunización con antígenos prostáticos genera una
respuesta inmune que induce un estado inflamatorio capaz de alterar la función de la próstata, pero
que preserva la normal funcionalidad de otras glándulas masculinas accesorias como vesículas
seminales y epidídimo.
V-F.
Severas alteraciones en la calidad seminal de los animales con prostatitis autoinmune
Luego de obtener muestras de semen de rata mediante electroeyaculación, se analizaron
diferentes parámetros de calidad espermática como concentración, motilidad, y vitalidad
espermática y el test HOS.
- 19 -
Jacaranda
Calidad espermática en semen
Post 2° Inmunización
Concentración espermática
21,6
51,1
EP
*
4,40
PSBP
7,2
Esp. Prog. Rápidos (%)
31,2
20,8
10,4
*
*
EP
PSBP
D
C
EP
PSBP
C
48,0
48,0
28,9
36,0
36,0
*
9,6
*
24,0
12,0
0,0
C
EP
PSBP
24,0
*
12,0
*
0,0
C
PSBP
EP
Test Hipo-osmótico
Test Hipoosmótico
38,6
19,3
*
*
0,0
C
PSBP
0,0
0,0
34,0
17,0
0,0
EP
Motilidad Progresiva
Motilidad Progresiva
14,4
*
C
41,6
Esp. Progresivos (%)
8,79
Vitalidad (%)
13,19
0,00
C
Vitalidad espermática
68,1
0,00
B
Vitalidad espermática
28,8
Esp. reactivos (%)
4,40
Post 3° Inmunización
17,59
Vitalidad (%)
Concentración (.106 esp./mL)
Concentración (106 esp/mL)
8,79
Post 2° Inmunización
Concentración espermática
17,59
13,19
C
Post 3° Inmunización
Esp. reactivos (%)
A
EP
PSBP
C
EP
PSBP
Figura 16: Calidad del semen en animales con prostatitis autoinmune. Se determinó la concentración espermática (A),
motilidad progresiva espermática (B), vitalidad espermática (C) y el test de hinchamiento hipo-osmótico (HOS test) en
muestras de semen de los animales autoinmunes (EP y PSBP) y controles (C) obtenidas por electroeyaculación. Los
diferentes parámetros fueron analizados inmediatamente luego de la obtención de la muestra siguiendo protocolos
estándar. Se detallan los resultados correspondientes a los días 27(post-2º inmunización) y 42 (post-3º inmunización), de
manera de reflejar la calidad seminal a lo largo del desarrollo de la prostatitis autoinmune. * P<0.01 vs. C.
Para tener una visión general de lo que ocurre a lo largo del desarrollo de la enfermedad, se
realizó el análisis de los diferentes parámetros en los días 27 y 42 (luego de la segunda y tercera
inmunización respectivamente) del protocolo experimental. Como puede apreciarse en la Figura
16, se observó que, en general, todos los animales autoinmunes evidenciaron serias alteraciones en
todos los parámetros de calidad espermática analizados y que estas alteraciones empeoraron a
medida que la enfermedad autoinmune progresó y se estableció a lo largo del protocolo
experimental. Los animales del grupo EP, quienes desarrollan la forma más severa de prostatitis
autoinmune, fueron los primeros en evidenciar una disminución de la concentración espermática en
el día 27; pero, a medida que la respuesta inmune progresó (día 42), ambos grupos de animales
autoinmunes (EP y PSBP) presentaron valores significativamente disminuidos de concentración
espermática (Figura 16-A, p<0.01). Simultáneamente, se detectaron niveles extremadamente bajos
o casi nulos de motilidad y vitalidad espermática en ambos grupos de animales autoinmunes (EP y
PSBP) tanto en una etapa temprana (luego de la segunda inmunización, día 27), como así también
en una etapa tardía (luego de la tercera inmunización, día 42) del desarrollo de la prostatitis
autoinmune (Figura 16-B y C) (p<0.01). Al realizar el ensayo de HOS, niveles muy bajos de
espermatozoides reactivos fueron observados en animales de los grupos EP y PSBP (Figura 16-D,
p<0.01). Estos resultados demuestran que cuanto mayor es la respuesta autoinmune hacia antígenos
prostáticos o cuando la misma progresa, peores son las alteraciones observadas en semen.
V-G. La calidad de los espermatozoides en muestras de semen está severamente alterada,
mientras que en epidídimo los espermatozoides se encuentran intactos
La génesis y diferenciación de los espermatozoides ocurre en testículo y los
espermatozoides maduros son almacenados en epidídimo hasta el momento de la eyaculación,
donde se juntan con los fluidos de las glándulas sexuales accesorias (próstata y vesículas
seminales) para formar el semen o eyaculado. Se quiso investigar dónde se originaban las
alteraciones observadas en semen. Existían dos posibilidades:
1. Que estas alteraciones fueran resultantes de un daño a nivel de epidídimo como
consecuencia de un efecto satélite de la inflamación prostática (aunque previamente no se
detectaron alteraciones histológicas, de marcadores bioquímicas, ni autoanticuerpos anti
antígenos testiculares o epididimarios).
- 20 -
Jacaranda
2. Que estas alteraciones fueran resultantes de un daño originado durante el encuentro de los
espermatozoides con los fluidos prostáticos a partir de la eyaculación.
Los animales de los diferentes grupos experimentales fueron sacrificados en los días 27 y 42,
y los mismos análisis previamente realizados en muestras de semen fueron realizados en muestras
de espermatozoides epididimarios.
Calidad espermática en epidídimo
Post 3° Inmunización
A
B
Concentración espermática
Motilidad Progresiva
54,8
Esp. Prog. Rápidos (%)
Concentración (106 esp/mL)
30,00
22,50
15,00
7,50
41,1
27,4
13,7
0,0
0,00
C
C
EP
PSBP
C
D
35,5
53,9
26,6
40,4
17,7
8,8
PSBP
Test Hipo-osmótico
Esp. reactivos (%)
Vitalidad (%)
Vitalidad espermática
EP
26,9
13,4
0,0
0,0
C
EP
PSBP
C
EP
PSBP
Figura 17: Parámetros de calidad espermática en espermatozoides epididimarios en animales con prostatitis autoinmune.
Se determinó la concentración espermática (A), motilidad progresiva espermática (B), vitalidad espermática (C) y el test
de hinchamiento hipo-osmótico (test HOS) en muestras de espermatozoides epididimarios de animales autoinmunes (EP y
PSBP) y controles (C), inmediatamente luego de sacrificar los animales. Los diferentes parámetros fueron analizados
inmediatamente luego de la obtención de la muestra siguiendo protocolos estándar. Los resultados graficados
corresponden al día 42 (post-3º inmunización) del protocolo experimental.
Como puede observarse en la Figura 17, no se observaron diferencias en ninguno de los
parámetros analizados entre los diferentes grupos de animales, ya sea en el día 27 (datos no
mostrados) o 42 del protocolo experimental. Estos resultados evidenciaron que las alteraciones
observadas en semen de los animales autoinmunes se originan luego de la génesis espermática en
testículo y maduración y paso por epidídimo. Aparentemente, la cinética de este daño sería muy
rápida y sus consecuencias podrían comprometer seriamente la calidad seminal de un individuo.
V-H.
Elevados niveles de apoptosis espermática en semen de los animales autoinmunes
Para investigar cuál es el mecanismo por el que estaban muriendo los espermatozoides de
los animales autoinmunes, se analizaron los niveles de apoptosis en muestras de semen de los
animales en estudio. Se realizó el ensayo de Anexina V (A)/Ioduro de propidio (IPr) mediante
citometría de flujo. Como puede observarse en la Tabla 6, se detectaron elevados niveles de
espermatozoides apoptóticos en semen de ambos grupos de animales autoinmunes (EP y PSBP)
(p<0.01). La frecuencia de espermatozoides en apoptosis temprana (A+/IPr-) fue
significativamente mayor en el grupo PSBP que en el grupo EP. No obstante, los animales del
grupo EP evidenciaron mayor porcentaje de espermatozoides seminales en apoptosis
tardía/necrosis temprana (A+/IPr+) y en necrosis (A-/IPr+), que los animales del grupo PSBP
(Tabla 6-A, p<0.01). Al realizar este ensayo en muestras de espermatozoides epididimarios y en
concordancia con los resultados del análisis de la calidad seminal, no se detectó incremento alguno
en el porcentaje de espermatozoides apoptóticos/necróticos en ninguno de los grupos
experimentales (Tabla 6-B).
- 21 -
Jacaranda
Apoptosis espermática en la Prostatitis
Autoinmune Experimental
A
Apoptosis espermática en semen
Espermatozoides (% ± DE)
Grupo C
Grupo EP
Grupo PSBP
95.72 ± 1.43
12.17 ± 5.00 *
57.75 ± 10.44 *
Vivos, apoptosis temprana (A+/IPr-)
3.70 ± 1.31
24.22 ± 4.76 *
40.47 ± 9.20 *
Muertos,
apoptosis tardía/necrosis temprana (A+/IPr+)
0.07 ± 0.04
60.04 ± 20.02 *
0.15 ± 0.15 *
Muertos, necrosis tardía (A-/IPr+)
0.50 ± 0.32
3.57 ± 0.04 *
1.90 ± 1.40 *
Vivos (A-/IPr-)
B
Apoptosis en espermatozoides epididimarios
Espermatozoides (% ± DE)
Grupo C
Grupo EP
Grupo PSBP
98.60 ± 0.41
98.92 ± 0.21
98.60 ± 0.20
Vivos, apoptosis temprana (A+/IPr-)
0.70 ± 0.31
0.70 ± 0.07
0.55 ± 0.05
Muertos,
apoptosis tardía/necrosis temprana (A+/IPr+)
0.01 ± 0.01
0.03 ± 0.01
0.01 ± 0.01
Muertos, necrosis tardía (A-/IPr+)
0.69 ± 0.12
1.27 ± 0.15
0.89 ± 0.10
Vivos (A-/IPr-)
Tabla 6: Apoptosis espermática en animales con prostatitis autoinmune. Los niveles de apoptosis
espermática se determinaron mediante la tinción con Anexina-V/Ioduro de Propidio por citometría de flujo
en muestras de semen (A) y espermatozoides epididimarios (B) de los animales autoinmunes (Grupos EP y
PSBP) y controles (Grupo C), en el día 42 del protocolo experimental. * P<0.01 vs. Grupo C.
Estos resultados evidencian que los espermatozoides de los animales autoinmunes (Grupos
EP y PSBP) están muriendo por un mecanismo de apoptosis, y que este mecanismo de muerte
celular es gatillado cuando los espermatozoides se juntan con las secreciones prostáticas en el
preciso momento de la eyaculación.
V-I.
Las alteraciones espermáticas observadas en los animales autoinmunes ocurren muy
rápidamente y son causadas en parte por citoquinas producidas localmente por la respuesta
autoinmune
Otros interrogantes fueron acerca de quién/quiénes estaban involucrados en el daño
presente en los espermatozoides y si este daño podía ocurrir en tan corto tiempo. Para contestar
estos interrogantes, se realizaron experimentos evaluando la cinética espermática y experimentos
mezcla para determinar qué mediadores estaban desencadenando el daño espermático observado.
V-Ii. La cinética de los espermatozoides de los animales autoinmunes decae rápidamente y
este fenómeno es provocado por mediadores solubles presentes en el plasma seminal
Se obtuvieron muestras de semen por electroeyaculación de los animales autoinmunes y
controles e inmediatamente se analizaron en un microscopio conectado a una cámara de video y se
analizó el porcentaje de motilidad espermática en diferentes campos por intervalos de 1 minuto
durante los 10 minutos totales.
Log (10) % esp. móviles
2
*
1,5
1
*
*
*
*
*
*
0,5
*
*
*
0
1
2
3
4
5
-0,5
6
7
8
9
Grupo C
Grupo EP
-1
Grupo PSBP
-1,5
Tiempo (min)
Figura 18: Análisis de la cinética espermática en semen de animales con prostatitis autoinmune. Se determinaron los
porcentajes de espermatozoides móviles en muestras de semen de animales autoinmunes (EP y PSBP) y controles (C) a lo
largo de 10 minutos, inmediatamente luego de la obtención de las muestras por electroeyaculación. Los resultados
graficados corresponden al día 42 (post-3º inmunización) del protocolo experimental. * P<0.01 vs. Grupo C.
- 22 -
Jacaranda
Como puede observarse en la Figura 18, la motilidad espermática no disminuyó de manera
apreciable en los animales del grupo C. Por el contrario, un marcado descenso en la motilidad
espermática se observó en los animales de los grupos EP y PSBP; siendo este efecto muy drástico
en muestras de los animales del grupo EP (Figura 18). Seguidamente, se realizaron experimentos
mezcla, en los cuales se evaluó el efecto sobre la cinética de espermatozoides normales
(provenientes de animales sanos) cuando se les adicionaba plasma seminal de los animales
autoinmunes y controles con el objetivo de analizar si mediadores solubles presentes en el plasma
seminal de los animales autoinmunes eran los responsables de las alteraciones observadas. Como
puede apreciarse en la Figura 19, cuando espermatozoides de animales normales, sin tratamiento
alguno, fueron mezclados con plasma seminal de animales autoinmunes (PS Grupo PSBP), se
observó una marcada disminución en la motilidad de los espermatozoides. Sin embargo, cuando se
agregó plasma seminal de los animales del grupo control (PS Grupo C), no se observó disminución
alguna en la motilidad de los mismos (Figura 19), evidenciando una cinética espermática similar a
la observada en muestras de semen de los animales controles evaluada previamente (Figura 18).
Efectos del Plasma Seminal Autoinmune sobre
la motilidad de Espermatozoides Normales
2
Log (10) % esp. móviles
1,5
1
*
*
0,5
*
0
1
2
3
-0,5
4
5
*
-1
6
*
PS Grupo C
-1,5
7
*
8
9
*
PS Grupo PSBP
-2
Tiempo (min)
Figura 19: Análisis de los efectos de plasma seminal de animales con prostatitis autoinmune sobre espermatozoides de
animales normales. Se determinaron los porcentajes de espermatozoides móviles en muestras de semen de animales
normales a los cuales se le adicionó plasma seminal de animales autoinmunes (PS Grupo PSBP) o plasma seminal de
animales controles (PS Grupo C), a lo largo de 10 minutos luego de su obtención por electroeyaculación. * P<0.01 vs.
Grupo C.
Estos resultados indican que el contacto inmediato entre espermatozoides normales y un
plasma seminal inflamatorio es capaz de reproducir las anormalidades observadas en semen de los
animales autoinmunes, evidenciando que el daño observado ocurre rápidamente y que sustancias
presentes en el plasma seminal de los animales autoinmunes son las responsables del mismo.
V-Iii. Las anormalidades espermáticas observadas son causadas, en parte, por citoquinas
inflamatorias presentes en el plasma seminal de los animales autoinmunes
A partir de los resultados de los experimentos mezcla, surgió la inquietud de precisar si los
mediadores solubles presentes en el plasma seminal que originaban las anormalidades
espermáticas, eran las citoquinas inflamatorias previamente detectadas en el plasma seminal de los
animales autoinmunes. Se realizaron experimentos para evaluar la cinética espermática de
espermatozoides de animales normales no tratados a los cuales se les adicionó TNF-α recombinante
a las concentraciones detectadas en el plasma seminal de los animales autoinmunes. Luego de la
adición del mismo también se evaluó la apoptosis espermática. La adición de r-TNF-α causó una
disminución significativa en la motilidad espermática (Figura 20-A) y un incremento significativo
de la apoptosis en espermatozoides normales (Figura 20-B). Para sustentar aun más este resultado,
se evaluó el efecto de agregar un anticuerpo neutralizante anti-TNF-α a la mezcla anterior,
observándose un bloqueo parcial del efecto previamente observado (Figura 20-A).
También se investigó el efecto directo del INF-γ sobre la motilidad y apoptosis de
espermatozoides normales, debido a que el mismo es un mediador crucial en un proceso
inflamatorio y su presencia fue detectada en el plasma seminal de los pacientes con PCNB con
respuesta autoinmune y en los animales con prostatitis autoinmune. La adición de INF-γ
recombinante (en las mismas concentraciones detectadas en plasma seminal de los animales
autoinmunes) redujo significativamente la motilidad y aumentó significativamente la apoptosis de
- 23 -
Jacaranda
espermatozoides normales (Figuras 20-C y 20-D). Asimismo, la adición de anticuerpos
neutralizantes anti-INF-γ redujo este efecto significativamente (Figura 20-C).
Efectos de r-TNF-α sobre Espermatozoides Normales
A
Motilidad espermática
2
Log (10) % esp. móviles
1,5
*
1
*
*
*
*
0,5
*
*
*
*
*
*
*
0
1
2
-0,5
3
4
*
5
6
PS Grupo C
7
8
*
*
*
PS Grupo C + r-TNF-alfa
-1
9
PS Grupo C + r-TNF-alfa + anti-TNF-alfa
-1,5
Tiempo (min)
B
Apoptosis inducida por r-TNF-a
Espermatozoides (%)
Control
r-TNF-a
400 pg/ml
r-TNF-a
200 pg/ml
87.30
70.42 *
74.16 *
Vivos, apoptosis temprana (A+/IPr-)
8.60
20.29 *
19.55 *
Muertos,
apoptosis tardía/necrosis temprana (A+/IPr+)
1.20
3.54 *
2.49 *
Muertos, necrosis tardía (A-/IPr+)
2.90
5.75 *
3.80 *
Vivos (A-/IPr-)
Efectos de r-IFN-γ sobre Espermatozoides Normales
Motilidad espermática
C
2
Log (10) % esp. móviles
1,5
1
*
*
*
*
*
0,5
*
PS Grupo C
PS Grupo C + r-IFN-gama
PS Grupo C + r-IFN-gama + anti-IFN-gama
*
*
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
-0,5
Tiempo (min)
D
Apoptosis inducida por r-IFN-?
Espermatozoides (%)
Control
r-IFN-?
100 pg/ml
r-IFN-?
50 pg/ml
90.30
67.60 *
74.40 *
Vivos, apoptosis temprana (A+/IPr-)
2.60
24.00 *
17.70 *
Muertos,
apoptosis tardía/necrosis temprana (A+/IPr+)
0.60
3.30 *
2.60 *
Muertos, necrosis tardía (A-/IPr+)
6.50
5.10
5.30
Vivos (A-/IPr-)
Figura 20: Análisis de los efectos de citoquinas inflamatorias (TNF-α e IFN-γ) sobre espermatozoides normales de rata.
Se analizó la cinética de la motilidad de espermatozoides a los cuales se les adicionó plasma seminal de animales
controles (PS Grupo C) suplementado con TNF-α recombinante (A) o con IFN-γ recombinante (C) a las
concentraciones detectadas en el plasma seminal de los animales con prostatitis autoinmune, durante 10 minutos. Al
mismo tiempo y utilizando el mismo diseño experimental, se analizaron los efectos sobre la expresión de marcadores de
apoptosis (Anexina-V e Ioduro de Propidio)(B y D). * P<0.01 vs. Grupo C.
Teniendo en cuenta todos estos resultados, puede afirmarse que las citoquinas presentes en
el plasma seminal, producto de la respuesta autoinmune hacia antígenos prostáticos, son capaces de
alterar significativamente la calidad seminal de un individuo, gatillando la muerte de los
espermatozoides por un proceso de apoptosis.
- 24 -
Jacaranda
ESTUDIO DE LA PROSTATITIS AUTOINMUNE Y SUS EFECTOS SOBRE LA
FERTILIDAD MASCULINA EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE PROSTATITIS
AUTOINMUNE
Los resultados hasta aquí presentados evidencian que una respuesta autoinmune hacia
antígenos prostáticos, y el ambiente inflamatorio generado como consecuencia de ella, producen
serias alteraciones que se traducen en una calidad seminal disminuida. Con el propósito de
determinar si las alteraciones seminales observadas como consecuencia de la prostatitis autoinmune
eran capaces de comprometer la fertilidad masculina, se diseñaron experimentos de apareamiento y
de estudio de la capacidad fértil de los animales de los diferentes grupos experimentales.
Protocolo Experimental
Se reprodujo el modelo de PAE previamente descripto, y luego del día 42 los animales
fueron apareados con ratas Wistar hembra de 8 semanas de edad (cada macho con dos hembras),
las cuales eran sexualmente adultas y estaban en plena edad reproductiva. Luego, cada hembra fue
sacrificada en el día 21 de gestación y diferentes parámetros fueron analizados, entre ellos
potencia; índice de fecundidad; índice de fertilidad; perdida embrionaria o aborto pre y postimplantación.
Protocolo Experimental
Día 35
Grupo C
(PBS)
0.1 mL/rata
N=8
PBS/CFA
Grupo EP
(Extracto Prostático)
1 mg/rata
N=9
Día 42 / Día 0
Gestación
Día 21
Ensayos de
Apareamiento
Análisis de
parámetros de
fertilidad
1 macho : 2 hembras
en el estadío estro del
ciclo estral
Potencia
Fecundidad
EP/CFA
Fertilidad
Copulación: preñez
Día 0 de gestación
Grupo PSBP
(Prostateína)
Pérdida embrionaria/
aborto espontáneo
120 g/rata
N=9
PSBP/CFA
VI-I. La fertilidad masculina está seriamente comprometida en animales con prostatitis
autoinmune
Luego de los ensayos de apareamiento, se determinó la Potencia de los animales
autoinmunes, la cual se evalúa como la cantidad de hembras inseminadas del total de hembras
puestas a aparear. Como puede observarse en la Figura 21-A, los animales con prostatitis
autoinmune evidenciaron una potencia normal, demostrando que los mismos tienen una capacidad
normal al momento de llevar a cabo un coito. Posteriormente y con el objeto de analizar la
fertilidad de los animales autoinmunes, se sacrificaron las hembras preñadas por los mismos, en el
día 21 de gestación, y se analizaron otros parámetros. Como puede observarse en la Figura 21-B,
cuando se evaluó el Índice de Fecundidad, que da cuenta del porcentaje de hembras preñadas del
total de hembras puestas a aparear, se observó una disminución mínima del mismo en los animales
autoinmunes. Esto evidenció que los animales autoinmunes tampoco tienen dificultades en preñar
hembras fértiles cuando son puestos a aparear. No obstante, cuando se evaluó el Índice de
Fertilidad, que da cuenta del número de ovocitos fecundados sobre el total de ovocitos ovulados
por la hembra, se evidenció una significativa disminución en el número de ovocitos fertilizados por
espermatozoides de los animales autoinmunes (Grupos EP y PSBP) (Figura 21-C). Expresado de
otra manera, los espermatozoides de animales autoinmunes evidencian una capacidad disminuida
de fertilizar normalmente a un ovocito. Esto podría ser consecuencia del daño que los mismos
sufren al tomar contacto con los fluidos prostáticos inflamatorios, demostrado previamente.
- 25 -
Jacaranda
Parámetros de Fertilidad en la Prostatitis Autoinmune
Experimental
A
Potencia
Potencia (%)
100
80
Hembras inseminadas
Hembras apareadas
60
x 100
40
20
B
0
EP
C
Fecundidad
PSBP
Fecundidad (%)
100
N machos que engendraron x 100
N machos apareados
80
60
40
20
0
C
C
Índice de Fertilidad
EP
PSBP
Índice de Fertilidad
1,0
*
0,8
*
N de sitios de implantación
N de cuerpos lúteos (2 ovarios)
0,6
0,4
0,2
0,0
EP
C
PSBP
Figura 21: Análisis de diferentes parámetros de fertilidad en hembras apareadas con animales con prostatitis
autoinmune. Se analizaron la Potencia (A), Fecundidad (B) e Índice de Fertilidad (C) en hembras apareadas con
animales autoinmunes (Grupos EP y PSBP) y controles (Grupo C). Las hembras fueron apareadas y luego de
constatado el coito, fueron separadas y mantenidas aisladas hasta el día 21 de gestación. En este día las hembras
fueron sacrificadas y se analizaron los diferentes parámetros de fertilidad. * P<0.01 vs. Grupo C.
Al mismo tiempo, se analizó el porcentaje de aborto o pérdida embrionaria (Figura 22).
Este parámetro comprende dos índices: la pérdida embrionaria o aborto pre-implantación y la
pérdida embrionaria o aborto post-implantación. Se observó que los animales autoinmunes
evidenciaron un marcado incremento en ambos parámetros, comparado con los valores observados
en el grupo control (Figura 22-A y B).
Pérdida embrionaria
Pre-implantación
A
Embriones abortados (%)
50
*
*
40
N cuerpos lúteos – N sitios implantación
30
N sitios implantación
20
10
0
C
EP
PSBP
- 26 -
x 100
Jacaranda
Pérdida embrionaria
Post-implantación
B
Embriones abortados (%)
50
N sitios implantación – N fetos vivos
N sitios implantación
x 100
*
*
40
30
20
10
0
C
EP
PSBP
Figura 22: Análisis de parámetros de fertilidad en hembras apareadas con animales con prostatitis autoinmune. Se
analizaron los porcentajes de Pérdida embrionaria/aborto pre-implantación uterina (A) y post-implantaciónuterina (B)
en hembras apareadas con animales autoinmunes (Grupos EP y PSBP) y controles (Grupo C). Las hembras fueron
apareadas y luego de constatado el coito, fueron separadas y mantenidas aisladas hasta el día 21 de gestación. En este
día las hembras fueron sacrificadas y se analizaron los parámetros de fertilidad. * P<0.01 vs. Grupo C.
En concordancia con estos resultados, las hembras preñadas por animales autoinmunes
presentaron mayor número de fetos muertos /reabsorbidos que las hembras preñadas por animales
controles. Además, los fetos concebidos por hembras preñadas por animales autoinmunes
presentaron, aunque no significativamente, un menor tamaño que aquellos concebidos por animales
controles (datos no mostrados).
Estos resultados indican que si bien los animales autoinmunes son capaces de copular y
preñar a hembras fértiles al igual que los animales controles, evidencian una disminución de su
capacidad fértil. Esto resulta de la incapacidad de los espermatozoides de animales autoinmunes de
fecundar ovocitos con la misma eficiencia que espermatozoides de animales controles. A su vez, si
un ovocito es fecundado por espermatozoides de animales autoinmunes, presenta una menor
capacidad de implantarse en útero y de llegar a término en un embarazo exitoso, que aquellos
ovocitos fecundados por espermatozoides de animales controles. Esta capacidad disminuida de
concepción, puede resultar de los daños que los mismos sufren al encontrarse con los mediadores y
sustancias inflamatorias presentes en los fluidos prostáticos durante la eyaculación.
DISCUSION
Con el objetivo de analizar la presencia de infecciones no detectadas previamente como causa
de la PCNB que presentaban los pacientes estudiados en el presente trabajo, se evaluó la presencia
de agentes infecciosos empleando métodos de cultivo microbiológico y de biología molecular en
muestras biológicas de los pacientes en estudio. Se detectó la presencia de agentes infecciosos en
15 de los 44 pacientes analizados, es decir en un 34% de los mismos, siendo los microorganismos
aislados reconocidos agentes etiológicos de prostatitis (E. coli, St. aureus, Klebsiella spp., C.
trachomatis, C. albicans, Tricomonas spp.). En concordancia con literatura, se pudo determinar una
etiología infecciosa en un grupo de los pacientes en estudio. No obstante, esto fue posible en un
grupo minoritario de pacientes (34%). En la mayoría restante, no se pudo aislar agente infeccioso
alguno como responsable de la sintomatología prostática presentada, por lo que esta hipótesis no es
completamente satisfactoria para explicar la causa de la enfermedad. La etiología de la misma en el
resto de los pacientes podría deberse, entre otros, a fenómenos inflamatorios de origen no
infeccioso de naturaleza autoinmune.
El siguiente paso, que consistió en lograr uno de los objetivos principales del presente trabajo,
fue evaluar a la autoinmunidad como posible factor etiológico de PCNB. La autoinmunidad es la
pérdida de “autotolerancia” o tolerancia a lo propio, siendo esta última lograda a través de una serie
de complejos mecanismos que el sistema inmune ha generado a lo largo de la evolución.
Últimamente, se ha evidenciado que cada individuo no es tolerante hacia todos los determinantes
antigénicos o epítopes de las proteínas propias y que el repertorio de linfocitos T periféricos
específicos hacia algunas secuencias de proteínas propias se encuentra intacto y funcionalmente
activo pero mantenidos bajo control por los mecanismos periféricos de autotolerancia. No obstante,
el repertorio de linfocitos T específicos hacia autoantígenos particulares puede ser potencialmente
- 27 -
Jacaranda
activado y luego desencadenar una enfermedad autoinmune. Aunque las respuestas autoinmunes
hacia la mayoría de los tejidos en el organismo han sido extensamente descriptas desde décadas
atrás, muy poco se conoce respecto a la respuesta autoinmune dirigida contra próstata. Con los
resultados expuestos en el presente trabajo, se demuestra la presencia de linfocitos capaces de
activarse y proliferar de manera específica en respuesta al estímulo con antígenos prostáticos
(como PSA, PAP y otros) en un grupo de pacientes con PCNB. Los antígenos evaluados fueron
aquellos presentes en PS, EP, PSA y PAP como potenciales autoantígenos reconocidos por los
pacientes, y se demostró que PS y PAP fueron capaces de inducir una respuesta linfoproliferativa
significativa en un grupo de pacientes con PCNB. Un alto porcentaje de este grupo de pacientes
presentó una respuesta positiva frente a 2 o más de los antígenos ensayados, indicando que una
respuesta linfoproliferativa contra 2 o más antígenos es una característica común. La respuesta
específica contra antígenos prostáticos también pudo ser demostrada en este grupo de pacientes
mediante la detección de una elevada secreción específica de IFN-γ en sobrenadantes de cultivo de
CMN estimuladas con antígenos prostáticos. Fue interesante también el hallazgo de una notable
secreción específica de IL-10 en sobrenadantes de cultivo de CMN de los individuos controles
como así también en todos los pacientes. A partir de este resultado, puede hipotetizarse que
hombres saludables normalmente poseen linfocitos circulantes específicos hacia antígenos
prostáticos que no secretan IFN-γ, sino que secretan IL-10 principalmente, la cual es una citoquina
regulatoria bien conocida. En este grupo de pacientes que evidencian una respuesta celular contra
antígenos prostáticos, con una elevada secreción específica de IFN-γ, podría estar ocurriendo un
desbalance hacia un perfil de respuesta tipo Th1. Existe evidencia que sustenta esta hipótesis,
demostrando la presencia de linfocitos T específicos contra antígenos prostáticos en hombres
normales (34, 35). De hecho, estos hallazgos están tratando de ser usados como posible
herramienta para la inducción de una respuesta inmune contra próstata con el objetivo de destruir
células prostáticas neoplásicas, según lo descripto por Fong y col. (36).
Con respecto al estudio de la respuesta autoinmune humoral, en todos los ensayos
realizados en un principio de la presente tesis, no se detectaron diferencias en los niveles de
anticuerpos contra antígenos prostáticos en las muestras de suero y plasma seminal estudiadas. Este
resultado fue sorprendente, aunque también fue llamativa la casi inexistencia de reportes en
literatura científica que aborden este aspecto. No obstante, ha sido reportada la presencia de niveles
incrementados de IgA e IgG total sin especificidad hacia microorganismo alguno en secreciones
prostáticas de pacientes con prostatitis crónica no infecciosa (3). Además, también se demostraron
depósitos de IgM en tejido periglandular prostático en 34 de 60 pacientes con prostatitis crónica y
en 1 de 21 controles (3). Una posibilidad para explicar el hecho de que en la presente tesis no se
haya encontrado una respuesta autoinmune humoral positiva en los pacientes estudiados
(específicos contra los mismos antígenos estudiados en los ensayos de linfoproliferación), es que se
deba a un problema metodológico. Para sortear este problema se deberían desarrollar metodologías
más sensibles, precisas y específicas para detectar la posible presencia de estos autoanticuerpos.
Sin embargo, se ha recientemente reportado la presencia de IgG específica en pacientes con
prostatitis crónica (23). Estos autores demostraron la presencia de IgG específica contra MADPRO-34 en 6 de 67 pacientes con prostatitis crónica y en ninguno de los 71 controles normales
utilizando la metodología SEREX (identificación serológica de antígenos por clonado de expresión
recombinante), una metodología que utiliza una librería de ADNc de próstata humana normal que
luego se expresa para la obtención de proteínas recombinantes y su posterior utilización como
antígenos para la detección de anticuerpos específicos. El antígeno MAD-PRO-34, reconocido
preferentemente por la respuesta inmune humoral de los pacientes con prostatitis crónica
comparado con controles normales, es un autoantígeno nucleolar potencialmente sobreexpresada en
carcinoma prostático y reconocido por la respuesta inmune de pacientes con cáncer de próstata (24)
y cistitis intersticial (25), una patología altamente relacionada con la PCNB. Trabajando en
colaboración con el grupo de investigadores del laboratorio dirigido por el Dr. Douglas Mc Neel de
la Universidad de Wisconsin de los Estados Unidos de América, se determinó la presencia de estos
autoanticuerpos en los pacientes en estudio, demostrándose la presencia de los mismos en cuatro de
los pacientes analizados, dos de los cuales presentaban PCNB sin causa aparente y los restantes
dos, para sorpresa, fueron pacientes que evidenciaron PCNB con respuesta celular autoinmune
hacia antígenos prostáticos. Este resultado estuvo completamente de acuerdo con los resultados
- 28 -
Jacaranda
previamente reportados por el grupo del Dr. Mc Neel y evidencia la presencia de autoanticuerpos
en la PCNB que están asociados a otras patologías prostáticas.
Además, se encontraron niveles muy elevados de citoquinas inflamatorias como TNF-α,
IL-1β e IFN-γ sólo en muestras de plasma seminal de pacientes con prostatitis crónica que
evidenciaron una respuesta autoinmune celular hacia antígenos prostáticos, lo cual sugiere la
presencia de una inflamación local de origen no infeccioso como responsable del cuadro clínico
presentado por estos pacientes. Las citoquinas actúan localmente para iniciar y modular respuestas
inmunes. En otras patologías autoinmunes, como artritis reumatoidea, también se encuentran
niveles elevados de citoquinas inflamatorias en el sitio local de la inflamación (fluido sinovial), y
se ha demostrado que su inhibición mejoró notablemente la sintomatología de la enfermedad (37).
Con respecto a los pacientes con PCNB con componente autoinmune, los niveles elevados de IFNγ detectados en plasma seminal se correlacionan con aquellos encontrados en los sobrenadantes de
cultivo de proliferación frente a antígenos prostáticos.
A pesar de que la prostatitis es una enfermedad muy común del tracto genitourinario, la
relación entre prostatitis crónica y fertilidad masculina no ha sido claramente definida, por lo que
ha habido mucha controversia al respecto durante años y hasta el presente (26, 38, 39, 40). Una
explicación posible a estos hallazgos contradictorios podría ser que la población de pacientes con
prostatitis crónica comprende un grupo heterogéneo de pacientes. Con los resultados presentados
en este trabajo, fue muy interesante observar que estos pacientes con PCNB con respuesta
autoinmune hacia antígenos prostáticos evidenciaron serias anormalidades o alteraciones en
parámetros de calidad seminal. Los pacientes con PCNB de naturaleza infecciosa también
presentaron alteraciones en su calidad seminal; no obstante, las mismas no fueron tan marcadas
como las presentadas por los pacientes con respuesta autoinmune hacia antígenos prostáticos.
Cuando el análisis comparativo de todos los parámetros estudiados fue realizado sin subclasificar a
los pacientes, de acuerdo a si presentaron o no una respuesta autoinmune hacia antígenos
prostáticos, no se encontraron diferencias significativas entre pacientes y controles. A partir de
esto, puede hipotetizarse que, de la misma manera, las alteraciones en semen encontradas en los
pacientes estudiados, pudieron haber sido enmascaradas en los estudios mencionados
precedentemente debido a una clasificación errónea de los mismos. En este trabajo, luego de
clasificar a los pacientes según la etiología determinada, se evidenció que, cuando los mismos
presentaban respuestas autoinmunes contra antígenos prostáticos, también evidenciaban una serie
de importantes alteraciones en la calidad seminal. De hecho, para algunos de los parámetros
analizados, como concentración espermática, el test HOS y la morfología espermática analizada de
acuerdo a los criterios de Kruger, las alteraciones observadas fueron aún más marcadas que
aquellas observadas en pacientes con prostatitis crónica infecciosa.
A partir de estudios realizados en pacientes con infertilidad masculina, con desórdenes
andrológicos, expuestos a tóxicos ambientales (41) o que presentaban anticuerpos antiespermatozoides (42), se ha obtenido evidencia que relaciona el estado hormonal con los
parámetros de calidad seminal. En la presente tesis, no se encontraron niveles positivos de
anticuerpos anti-espermatozoides, de isotipo IgG o IgA, ni alteraciones hormonales del eje
hipotálamo-hipófisis-testículo en ninguno de los pacientes analizados, excluyendo al factor
hormonal y a los anticuerpos anti-espermatozoides como posible causa de las alteraciones
seminales observadas. Para explicar estas alteraciones observadas en semen de los pacientes,
pueden postularse tres hipótesis. Las secreciones prostáticas fisiológicamente toman contacto con
los espermatozoides en el momento mismo de la eyaculación, por lo que la primera posibilidad
sería que el daño observado se desencadene y ocurra desde este preciso instante. La segunda
posibilidad podría incluir a un efecto directo de la inflamación sobre testículo y epidídimo. La
tercera posibilidad sería una combinación de ambas hipótesis. Estudios previos han demostrado la
presencia de citoquinas como TNF-α e IFN-γ en el semen de hombres infértiles (43). Además,
niveles elevados de citoquinas inflamatorias en plasma seminal han sido reportados en pacientes
con prostatitis crónica (44, 45). En la presente tesis, se evidenció la presencia de niveles
significativamente elevados de TNF-α, IFN-γ e IL-1β en pacientes que demostraron una respuesta
linfoproliferativa positiva contra antígenos prostáticos, que a su vez son quienes evidenciaron la
alteraciones seminales descriptas. Se ha reportado que la incubación de espermatozoides con TNFα produce efectos negativos sobre la motilidad de los mismos que se hacen evidentes a tiempos
tempranos como a los 30 minutos de incubación (46). Además, la próstata normalmente secreta
- 29 -
Jacaranda
sustancias antioxidantes que componen la Capacidad Antioxidante Total (TAC) que posee el
plasma seminal, y es bien conocido que el balance entre la concentración de ROS presentes en
plasma seminal y la TAC es muy importante para la sobrevida de los espermatozoides (47).
Pasqualotto et al. (21) reportaron una disminución significativa de la TAC seminal en pacientes con
PCNB (asociada o no a leucospermia) cuando se los comparó con individuos controles. Además, se
ha documentado fehacientemente que altos niveles de ROS tienen efectos deletéreos sobre la
calidad seminal (48) y que una disminución en la capacidad secretoria de la próstata se asocia con
aumentados niveles de apoptosis espermática. Todos estos hallazgos pueden explicar a la
oligozoospermia y astenozoospermia encontradas en los pacientes estudiados en el presente trabajo.
Otra explicación al origen de las alteraciones presentes en semen de estos pacientes, podría
ser que la inflamación esté ejerciendo un efecto directo sobre testículo y/o epidídimo siendo este el
responsable de las mismas. Además, también podría esperarse un incremento de las alteraciones
espermáticas debido a un efecto crónico de la inflamación. Aunque esta hipótesis no puede
descartarse, los resultados obtenidos en los experimentos realizados utilizando nuestro modelo
experimental animal de prostatitis autoinmune demostraron que la inflamación debida a una
respuesta autoinmune hacia próstata tiene como consecuencia efectos negativos directos en
espermatozoides seminales pero no en espermatozoides epididimarios.
Teniendo en cuenta los resultados presentados, puede especularse que una respuesta
autoinmune contra próstata en algunos pacientes con prostatitis crónica no infecciosa, y el proceso
inflamatorio involucrado, es capaz de comprometer seriamente la calidad del semen de estos
pacientes, y por lo tanto afectar su fertilidad.
Durante las últimas dos décadas, nuestro grupo de trabajo ha desarrollado dos modelos de
Prostatitis Autoinmune Experimental (PAE), uno desarrollado en ratas de la cepa Wistar y el otro
en la cepa de ratones No Obesos Diabéticos (NOD), que se proponen como modelos válidos para el
estudio de la PCNB. En el presente trabajo, se propuso profundizar el estudio de este modelo para
lograr una mejor caracterización de la inmunopatogenia involucrada. Al inmunizar los animales ya
sea con EP o con PSBP, y tal como ya se describió (14), los animales desarrollaron importantes
lesiones en el órgano blanco, caracterizadas por un notable infiltrado de células mononucleares en
el parénquima glandular, con desorganización de la arquitectura tisular normal, acompañado de
edema y hemorragia, lo cual constituye una lesión importante del órgano blanco. Este infiltrado
mononuclear presentó una fuerte marca para el antígeno de superficie CD45, un antígeno
panleucocitario, lo que significa que identifica a todas las poblaciones leucocitarias: granulocitos,
monocitos, linfocitos, macrófagos y células dendríticas. Además de lesiones tisulares prostáticas, el
desarrollo de la prostatitis autoinmune va acompañado de la aparición de una respuesta autoinmune
celular y humoral específica. Linfocitos T autorreactivos pueden ser detectados en ganglios
linfáticos drenantes y circulación sistémica (bazo) a etapas muy tempranas del desarrollo de la
enfermedad (8 días post inmunización) y esta respuesta se sostiene a los largo del tiempo (día 21).
Un hallazgo importante fue determinar que el perfil inmunológico de los linfocitos T autorreactivos
en este modelo es netamente de tipo Th1. Esto fue puesto en evidencia al analizar el perfil de
citoquinas secretadas. En presencia de PSBP, los linfocitos de animales autoinmunes no sólo son
capaces de activarse y proliferar, sino que también secretan grandes cantidades de Il-2 e IFN-γ,
siendo ésta última una citoquina patognomónica de linfocitos Th1. Muy por el contrario y bajo las
mismas condiciones de estimulación, se detectaron niveles nulos o muy bajos de IL-4 e IL-13,
citoquinas típicamente asociadas a un perfil de respuesta tipo Th2. Mediante ensayos de PCR en
tiempo real en tejido prostático de los animales autoinmunes, pudo también determinarse que estos
linfocitos autorreactivos que secretan altos niveles de IFN-γ detectados en periferia, son capaces de
infiltrar el órgano blanco secretando elevados niveles de esta citoquina in-situ a medida que
progresa la enfermedad. De manera inversa, se observó que los niveles de IL-10 en tejido
prostático disminuyen a medida que la enfermedad avanza. En conjunto, estos resultados ponen en
evidencia que la respuesta autoinmune contra próstata desarrollada por estos animales es de un
fenotipo preferentemente de perfil Th1, lo cual constituye otra similitud importante con lo
observado previamente en pacientes. Con los datos aportados pudo demostrarse que ratones de la
cepa NOD, cuando son inmunizados con antígenos prostáticos, desarrollan una fuerte respuesta
autoinmune humoral y celular específica con un perfil de tipo Th1.
En este trabajo, también se demostró que muchas de las anormalidades presentes en el
semen de los pacientes con prostatitis crónica autoinmune también se reproducen en el modelo
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Jacaranda
animal: presencia de marcadores de inflamación local (elevados niveles de metabolitos y citoquinas
proinflamatorias en plasma seminal), niveles reducidos de marcadores bioquímicos prostáticos y
marcadas alteraciones en la calidad seminal. El uso de los modelos animales de PAE desarrollados
en nuestro laboratorio, también permitió contestar ciertos interrogantes que hubiesen sido
imposibles de contestar en pacientes. Fue muy importante determinar cuándo, dónde y cómo está
ocurriendo el daño observado en los espermatozoides de pacientes con prostatitis crónica
autoinmune. Se evaluaron dos posibilidades: que estas alteraciones fueran resultado de un daño en
epidídimo como consecuencia de un efecto satélite de la inflamación presente en próstata; o que las
mismas fueran resultado de un daño muy rápido originado durante el encuentro de los
espermatozoides con los fluidos prostáticos en el momento de la eyaculación. Los hallazgos
obtenidos demuestran que sólo los espermatozoides eyaculados presentan daños y alteraciones y
que un proceso de apoptosis está involucrado. Los resultados encontrados sugirieron que los
mediadores presentes en el plasma seminal de los animales autoinmunes fueron los responsables de
estas alteraciones. Efectivamente, cuando el plasma seminal de ratas con prostatitis autoinmune fue
agregado a una suspensión de espermatozoides eyaculados normales, se evidenció una notable
disminución de la motilidad de los mismos, sugiriendo que mediadores humorales presentes en el
plasma seminal de los animales autoinmunes fueron los responsables de los efectos observados.
Los elevados niveles de ROS y ON detectados en el plasma seminal de los animales autoinmunes
pueden estar involucrados en estos efectos negativos sobre los espermatozoides. Otros candidatos
posibles de ser responsables de estos efectos son TNF-α e IFN-γ. Ciertamente, se detectaron
niveles elevados de estas citoquinas en el plasma seminal de los animales con prostatitis
autoinmune. Además, cuando TNF-α o IFN-γ recombinantes fueron agregados a plasma seminal
normal y luego a una suspensión de espermatozoides normales, fueron capaces de reproducir
exactamente los efectos observados previamente en el semen de los animales autoinmunes,
disminuyendo la motilidad y aumentando la apoptosis espermática. En concordancia, sus efectos
pudieron ser bloqueados, sino totalmente al menos en parte, mediante el uso de anticuerpos
monoclonales neutralizantes.
Con los resultados expuestos puede afirmarse que el daño espermático en la PAE puede ser
consecuencia de varias causas: por un medio ambiente inflamatorio, originalmente producido por la
respuesta autoinmune en la glándula prostática, caracterizada por un aumento de los niveles de
ROS y de citoquinas proinflamatorias en plasma seminal; por una disminución de la TAC debido a
una alteración de la funcionalidad prostática; o por ambas causas simultáneamente.
Luego de haber descripto la presencia de alteraciones en la calidad seminal de los pacientes
con prostatitis autoinmunes, y de haber reproducido esos hallazgos en el modelo animal,
naturalmente surgió el interrogante de si estas alteraciones serían capaces de realmente
comprometer la fertilidad de un individuo. Con el objetivo de evaluar si las alteraciones observadas
en la calidad seminal de animales con prostatitis autoinmune se traducían en infertilidad masculina,
se realizaron ensayos de apareamiento con hembras normales fértiles y se evaluaron diversos
parámetros de fertilidad en los animales en estudio. Se demostró que los animales autoinmunes
presentaban la misma capacidad de copular y preñar hembras que los animales controles. No
obstante, a pesar de poder preñarlas, la eficiencia con que sus espermatozoides fecundaban sus
ovocitos fue notablemente menor a la eficiencia de espermatozoides de los animales controles. Esto
se evidenció al analizar los índices de fertilidad de los diferentes animales. Los animales
autoinmunes mostraron índices de fertilidad notablemente bajos y mucho menores a aquellos
arrojados por los animales controles. Por lo tanto, las alteraciones presentes en los espermatozoides
de animales autoinmunes eran capaces de alterar su capacidad normal de fertilizar a un ovocito.
Otro hallazgo importante fue que las hembras preñadas por animales autoinmunes evidenciaron
elevados niveles de aborto espontáneo/pérdida embrionaria, tanto pre como post-implantación del
embrión en útero. Este hallazgo puso de manifiesto que los ovocitos fecundados por
espermatozoides de pobre calidad, fracasaron en llevar adelante un embarazo exitoso, siendo
inviables y perdiéndose a lo largo del mismo. Tal y como fue reportado previamente en protocolos
de reproducción asistida (49), esto puede ser consecuencia de daños en el ADN/cromatina de los
espermatozoides que los hacen incapaces de lograr una embriogénesis normal o desarrollo óptimo
del embrión/feto a lo largo del embarazo. Por lo tanto las alteraciones espermáticas observadas,
consecuencia de una respuesta autoinmune hacia componentes prostáticos, no solo reducen el
índice de fertilidad de los espermatozoides, sino que también afectan la calidad de los embriones
- 31 -
Jacaranda
que generan, haciéndolos incapaces tanto de lograr un implantación uterina exitosa, como así
también de progresar en una gestación normal.
Con todo lo hasta aquí expuesto, puede afirmarse que animales con prostatitis autoinmune
presentan marcadas alteraciones en su calidad seminal, y que estas alteraciones se traducen en una
fertilidad disminuida. La prostatitis autoinmune compromete seriamente la fertilidad masculina.
Los resultados presentados en el presente trabajo argumentan en favor de la importancia de
la funcionalidad prostática y sugieren que, además de las manifestaciones clínicas en los pacientes
con prostatitis crónica (dolor pélvico, síntomas de irritación y obstrucción urinaria, relaciones
sexuales no placenteras), un grupo de ellos, que tienen una respuesta autoinmune hacia antígenos
prostáticos, pueden también tener disminuida su fertilidad.
Es muy factible que la utilización de modelos animales experimentales de prostatitis
autoinmune provea de avances importantes en la enfermedad, los cuales podrán ayudar a identificar
claramente los mecanismos patogénicos involucrados y también desarrollar posibles terapias para
ser aplicadas en la enfermedad humana, lo cual constituye une verdadera necesidad sanitaria actual.
CONCLUSIONES GENERALES
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-
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La autoinmunidad puede ser considerada un factor etiológico involucrado en el desarrollo
de Prostatitis Crónica No Bacteriana/Síndrome de Dolor Pélvico Crónico (Prostatitis
categoría NIH-III).
La Prostatitis Crónica Autoinmune y el ambiente inflamatorio que la misma genera,
producen serias alteraciones en la calidad del semen de un individuo que pueden
comprometer la fertilidad masculina.
Los modelos experimentales animales son herramientas sumamente valiosas para lograr un
mejor entendimiento de la enfermedad humana, pudiendo mediante los mismos, llegar a
obtener, sino la cura, posibles terapias que mejoren la calidad de vida de los pacientes.
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RESUMEN
La próstata es una glándula sexual accesoria masculina cuya principal función consiste en
la secreción de numerosas sustancias y metabolitos que componen el plasma seminal,
constituyendo el medio adecuado para la preservación de los espermatozoides. No obstante, el
plasma seminal ejerce otras funciones como la defensa del tracto genitourinario masculino y hasta
complejos efectos en el tracto reproductivo femenino para asegurar una preñez. La importancia de
la próstata no solo radica en su fisiología, sino también en su patología. Esta glándula es blanco de
algunas patologías que se encuentran entre las más prevalentes en la práctica clínica, como el
carcinoma prostático, hiperplasia benigna prostática y las inflamaciones prostáticas o prostatitis. La
prostatitis constituye el 10% de los casos en el consultorio urológico y dentro de ellas la más
común, representando el 90% de los casos, es la Prostatitis Crónica No Bacteriana o Síndrome de
dolor pélvico crónico (Prostatitis NIH-III). La PCNB consiste en una inflamación crónica de la
próstata sin causa aparente. Se han propuesto numerosas hipótesis para explicar su etiología, dentro
de las cuales figuran infecciones difíciles de detectar, autoinmunidad hacia antígenos prostáticos,
un mecanismo neurogénico con contractura de la musculatura pelviana, cálculos, etc. Por otro lado,
la información existente que aborda la relación entre un estado patológico/disfunción de la glándula
prostática y alteraciones en la fertilidad masculina son nulas o escasas. La falta de datos
experimentales acerca de la próstata, sus enfermedades y consecuencias es, en parte, debido a la
falta de modelos experimentales para su estudio.
Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la
posible etiología autoinmune en la PCNB, sus consecuencias y avanzar en el desarrollo y
caracterización de modelos experimentales adecuados que reflejen la patología humana.
Al analizar pacientes con un diagnóstico establecido de PCNB, se evidenció la presencia de
un componente autoinmune contra próstata en el 34% de los pacientes estudiados. Estos pacientes
evidenciaron la presencia de linfocitos T específicos capaces de activarse, proliferar y secretar altos
niveles de IFN-γ cuando son estimulados in vitro con diferentes antígenos prostáticos. Esta
respuesta inflamatoria fue detectada de manera sistémica (sangre periférica), y al mismo tiempo de
manera local, evidenciándose elevados niveles de citoquinas pro-inflamatorias como IFN-γ, TNF-α
e IL-1β en plasma seminal de estos pacientes. Además, cuando se evaluó la calidad seminal de los
mismos, se detectaron serias alteraciones en diferentes parámetros de calidad espermática
analizados, sugiriendo una relación entre prostatitis crónica y una calidad seminal disminuida.
Seguidamente y con el objetivo de avanzar en el entendimiento de los mecanismos
inmunopatogénicos involucrados, se estudió el modelo de PAE desarrollado en ratones de la cepa
NOD. Estos estudios demostraron que luego de la inmunización con antígenos prostáticos, los
animales desarrollan una fuerte respuesta celular y humoral contra próstata de un perfil netamente
Th1, la cual se acompaña de un fuerte infiltrado y daño tisular en próstata. El tipo de respuesta
encontrado en este modelo animal, de tipo Th1, refleja lo encontrado en la enfermedad humana, por
lo que sustenta su validez como modelo experimental.
Luego, y con el objetivo de establecer la posible relación entre prostatitis crónica e
infertilidad masculina, se avanzó en el estudio del modelo de PAE desarrollado en ratas Wistar.
Pudo determinarse que estos animales, luego de ser inmunizados con antígenos prostáticos,
desarrollan una respuesta autoinmune hacia próstata que puede ser detectada tanto de manera
sistémica (bazo y ganglios linfáticos drenantes) como local (semen). Estos animales presentaron
una calidad seminal notablemente alterada. Las alteraciones observadas en la calidad espermática
sólo estuvieron presentes en semen y no es espermatozoides epididimarios, y se determinó que
factores solubles, como citoquinas y otras sustancias inflamatorias son las responsables del
desencadenamiento de las mismas. Los hallazgos encontrados reprodujeron exactamente lo
encontrado previamente en la enfermedad humana, confirmando que los espermatozoides empiezan
a afectarse luego que toman contacto con los fluidos inflamatorios prostáticos.
Finalmente y con el propósito de determinar si estas alteraciones seminales se traducían en
una fertilidad masculina alterada, se realizaron ensayos de apareamiento con hembras fértiles. Se
evidenció que los animales con prostatitis autoinmune presentan índices de fertilidad disminuidos,
como así también aumentados valores de aborto/pérdida embrionaria, lo que demuestra que una
respuesta autoinmune hacia próstata es capaz de alterar la fertilidad masculina.
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Jacaranda
SUMMARY
Prostate is a male accessory gland whose main function is to secrete several substances that
compose seminal plasma. The latter has many roles being the principal one to constitute the
optimal medium for sperm survival, and many other ones, such as being a defense barrier against
male urogenital infections and exerting complex effects in the female genital tract for achieving a
pregnancy. Prostate is not only important because of its physiology but also for its pathology. It is a
key target of several and very prevalent diseases in the clinical practice. Prostate benign
hyperplasia, prostate cancer and prostate inflammation or prostatitis syndromes are the most
common diseases that affect prostate. Prostatitis accounts for the 10% of visits in the urology clinic
and Chronic Non Bacterial Prostatitis or Chronic Pelvic Pain Syndrome (Prostatitis NIH-III)
represents 90% of those cases. CPPS is an inflammatory condition of the prostate gland without
any apparent cause. Many hypotheses have been postulated to explain its etiology: cryptic
infections, autoimmunity against prostate antigens, a neurogenic mechanism, etc. In addition, the
information regarding the relationship between chronic prostatitis and male infertility is very
scarce. The little information about prostate pathology and its consequences is due, at least in part,
to the lack of experimental animal models.
Taking all these data into account, the aim of this work was to assess the possible
autoimmune etiology of CPPS, its consequences and to advance in the development and study of
adequate animal models that mirror human pathology.
A group of patients with an established diagnosis of CPPS was analyzed and an
autoimmune response against prostate antigens was evidenced in 34% of patients. They showed the
presence of IFN-γ secreting lymphocytes able to activate, proliferate and secrete high levels of
IFN-γ when they were stimulated with different prostate antigens in vitro. This inflammatory
response was evidenced sistemically (peripheral bloood mononuclear cells) as well as locally by
the finding of elevated levels of pro-imflammatory cytokines, such as IFN-γ, TNF-α and IL-1β, in
seminal plasma. Besides, striking abnormalities in the semen quality of these patients was
evidenced suggesting a link between chronic prostatitis and a decreased semen quality.
Later on and with the aim of advancing in the immunopathogenic underlying mechanisms,
the experimental model of EAP developed in NOD mice was studied. Prostate antigens immunized
animals developed a strong cellular and humoral immune response against prostate and it was
accompanied with a strong infiltration and tissue damge in the prostate. This autoimmune response
against prostate antigens showed a marked bias to a Th1 profile. The findings in this animal model
reproduced what it was previously found in human disease, which supports its validity as an
experimental model for CPPS.
Another aim of the present work was to study the putative relationship between chronic
prostatitis and male fertility which was achieved studing the EAP model in Wistar rats.
Autoimmune animals develop a strong autoimmune response against prostate antigens that can be
detected sistemically (spleen and draining lymph nodes) and locally (semen). In addition, these
animals evidenced a marked decreased semen quality. The sperm alterations were only present in
semen and not in epidydimal sperm and it was shown that soluble factors (such as inflammatory
mediators and cytokines) present in the autoimmune seminal plasma were responsible for them.
These findings mirrored what it previosuly was found in human disease confirming the sperm cells
start to be affected when they join the prostate inflammatory secretions during ejaculation.
Finally and in order to assess if the sperm alterations were able to impair male fertility,
mating studies with fertile female rats were performed. It was shown that autoimmune animals
evidenced decreased fertility indexes as well as high levels of pre and post implantation embryo
loss. These findings demonstrated that an autoimmune response against prostate is able to seriuosly
compromise male fertility.
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