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Validación del método de detección de antígeno
prostático específico (psa), por inmunocromatografía
(Orgenics) aplicado a líquido seminal presente en
manchas secas y escobillones
Autores
Sandra Liliana Cifuentes
Bacterióloga
Instituto Nacional de Medicina Legal
y Ciencias Forenses
Pedro Vargas Pinilla
Biólogo
Pontificia Universidad Javeriana
Autor responsable de la correspondencia
Sandra Liliana Cifuentes
Calle 7ª No. 12 – 61
Instituto Nacional de Medicina Legal
y Ciencias Forenses
Laboratorio de Biología Forense
Tel. 3203474
[email protected]
Bogotá, Colombia
Título abreviado
Validación PSA por
inmunocromatografía en semen
Agradecemos al Instituto Nacional de Medicina
Legal y Ciencias Forenses en especial sus
peritos forenses y estudiantes de la Regional
Bogotá, por el aporte teórico, técnico y/o
humano que nos brindaron para la realización
de este estudio. Al Doctor Eleftherios
Diamandis por la información aportada, a la
empresa Orgenics y demás personas que de
una u otra forma contribuyeron a la finalización
de este estudio.
Validation of detection
method prostatic
specific antigen (PSA) by
inmunocromatrografyc
(Orgenics) applied to
seminal liquid in stain dry
and swabs
RESUMEN
El antígeno prostático específico (PSA)
es generalmente usado para detectar y
monitorear cuantitativamente el desarrollo
de cáncer de próstata por niveles en suero
de esta proteína, esta también es encontrada
en altas concentraciones en semen. Diversos
métodos reproducibles, sensibles y simples
han sido desarrollados para el análisis de
la presencia de PSA incluyendo técnicas
inmunocromatográficas. Los procedimientos
más comunes para la detección forense de
semen se han enfocado en la identificación
de espermatozoides, actividad de la fosfatasa
ácida y métodos inmunoelectroforéticos.
Aunque estos métodos han sido utilizados
por muchos años, existen algunos problemas
asociados con cada método. El objetivo
de esta investigación fue validar la prueba
inmunocromatográfica para la detección
de PSA en muestras forenses, para ello se
realizaron diferentes diluciones de un patrón
de semen con una concentración de PSA de
100.000ng/ml, encontrándose un límite de
detección de 10 ng/ml. En manchas secas
y escobillones, se presentaron resultados
positivos a partir de concentraciones de
500 ng/ml. De igual manera se evaluó
el comportamiento de la prueba ante
interferentes, tales como sangre, orina
masculina y femenina, leche materna,
secreciones vaginales, materia fecal y
saliva. Mostrando resultados positivos para
sangre y orina de un individuo con cáncer de
próstata se reporta una sensibilidad de 91.6%
y una especificidad de 100%. Los resultados
sugieren que este test puede ser usado como
presuntivo para determinar la presencia de
semen en muestras forenses.
ABSTRACT
The Prostate Specific Antigen (PSA)
generally is used quantitatively to detect
and to watch over the development of
prostate of cancer by serum levels of
this protein, but also is found in high
concentrations in semen. Different sensitive,
reproducible and simple methods have been
developed for the analysis of the presence
of PSA including inmunocromatografy
techniques. The procedures most common
in the forensic detection of semen have
focused in the detection of spermatozoa,
inmunoelectroforetic activity of acid
phosphatase and methods for the PSA
detection. Although these methods has been
used by many years, but some problems are
associated with each method. The objective
of this investigation was to validate the
inmunocromatografy test in the detection
of PSA in forensic evidences. Different
dilutions of semen standar (100.000 ng/ml of
PSA) were made, determining the low limit
detection in 10 ng/ml. Positive results were
obtained since concentrations of 500ng/ml
in stains and swabs. The performance of
the test was evaluated in the presence of
interferences, such as blood, male and female
urine, maternal milk, vaginal secretions,
feces and saliva. It shows positive results
in samples of blood and male urine with
prostatic cancer. We reported a sensitivity
of 91.6 % and a specificity of 100 %. These
results suggest that this presumtive test can
be usefull as preliminar test to determinate
presence of semen in forensic samples.
Palabras Clave: antígeno prostático
específico (PSA), evidencias forenses,
immunocromatografia, semen.
Key
words:
Forensic
evidences;
Immunocromatografy; Prostate Specific
Antigen (PSA); semen.
Colombia forense
24
INTRODUCCIÓN
El incremento de las denuncias de
violaciones sexuales en Colombia en los
últimos años, obliga a los laboratorios de
biología forense a satisfacer la demanda
de análisis a través de procedimientos
rápidos, eficaces, sensibles y específicos,
por ello es necesario determinar sí la
prueba de detección de PSA (Antígeno
Prostático Específico) es un test que
permite detectar la presencia de semen
en evidencias forenses.
El PSA es una serin-proteasa con
funciones similares a la quimiotripsina,
fue descrita en 1971 por Hara y
colaboradores (1971), fue denominada
en un principio como g-seminoproteina
o P30, llamada de esta manera por
su peso aproximado de 30 Kdaltons,
inicialmente se pensó que podía ser
una proteína especifica de próstata no
obstante posteriormente se registro en
diferentes fluidos y tejidos, tales como en
suero y orina de hombres con patologías
prostáticas (Yokota M et al., 2001),
fluido amniótico (Yu & Diamandis,
1995) leche materna (Yu & Diamandis,
1995b) y saliva (Simich JP, 1999).
El PSA se puede detectar de dos
formas: unido al inhibidor alfa-1antiquimotrípsina (PSA ACT) o de
forma libre aparentemente inactiva.
En condiciones normales muy poca
INMLCF
25
cantidad es derivada hacia la circulación,
se pueden considerar valores superiores
a 4 ng/ml como anormales.(Irani J,
1997)
La inmunocromatografia es una técnica
que cuenta con una región de prueba
la cual esta cubierta con una anti-PSAanticuerpo monoclonal y la región
control con un anticuerpo policlonal
antiimmunoglobulina, como se ilustra
en la figura 1. Una capa sobre la
membrana contiene un segundo antiPSA-anticuerpo monoclonal marcado
con determinado colorante. El PSA en la
muestra reacciona con el segundo antiPSA-anticuerpo formando un complejo
marcado, el cual es desplazado por el
efecto de capilaridad de las membrana,
en cualquier caso el complejo se une al
anticuerpo de inmunoglobulina en la
región control y en caso de ser positivo el
complejo anti-PSA-anticuerpo se une al
anti-PSA-anticuerpo, visualizando una
línea roja en la región de prueba(Yokota
M et al., 2001). El estándar interno de la
membrana es cubierto con un anticuerpo
policlonal de inmunoglobulina ajustado
para visualizar la línea roja con
una intensidad correspondiente a la
intensidad del test con una concentración
de PSA de 3ng/ml. De esta forma los
casos positivos se evidencian por la
presencia de una banda coloreada en
INVESTIGACIONES ORIGINALES
la zona denominada (T) junto con la
banda control©. En casos negativos
solo se muestra la banda control y es
considerado no valido en los casos en
que la banda control no se evidencia.
Un resultado negativo de la prueba
puede darse por ausencia del antígeno
prostático especifico, por niveles menores
al limite de detección o por las altas
concentraciones de PSA en la muestra
(efecto Hook), fenómeno reportado por
Hochmeister y colaboradores (1999)
cada dilución los cuales fueron puestos
a secar durante 24 horas a temperatura
ambiente, posteriormente se cortaron
trozos de 0.25 cm2 para depositarlos
en 250 µl de agua esterilizada en tubos
Eppendorf de 1.5 ml durante dos horas,
para luego ser centrifugados a 13000
gravedades durante cinco minutos,
tomando posteriomente 200 µl del
sobrenadante para ser aplicado a la
ventana del test de RapidSignal PSA
Serum (Orgenics), realizando la lectura
del test 10 minutos después (Laux,
Tambasco & Benzinger, 2003).
Figura 1. Diagrama esquemático
del funcionamiento del test de PSA.
(Sato et al., 2002).
Zona de prueba
Depósito de muestra
Monoclonal anti PSA móvil
Policlonal anti PSA inmóvil
METODOLOGÍA
La etapa experimental se dividió en
varias fases. Dentro de la primera se
realizaron diluciones en agua estéril de
un patrón (100.000 ng/ml) de PSA de
0.5; 1; 2; 3; 4; 6.7; 10; 20; 25; 50; 100 y
500 ng/ml. De estas se tomaron 200 µl
para ser leídos en su respectiva prueba,
cada una con tres replicas.
Dado que la literatura reporta
porcentajes de recuperación muy bajos
(0.34% y 0.11%) (Gartside, Brewer &
Strong, 2003), las diluciones con las que
se impregnaron los escobillones y las
manchas son recalculados, obteniendo
concentraciones de 10; 100; 500;
1000; 2000; 10.000 y el patrón puro,
es decir 100.000 ng/ml de PSA. Se
realizaron cortes de algodón poliéster
de un centímetro por un centímetro,
impregnando con cada una de las
diluciones tres fragmentos de esta tela por
La segunda fase corresponde a la
fabricación de las muestras forenses
simuladas donde escobillados con frotis
anal, oral y frotis vaginal (2 de cada uno)
fueron tomados de cinco voluntarias que
no hubieran tenido relaciones sexuales
en los últimos cinco días antes de la toma
de la muestra. La leche materna fue
donada por una mujer lactante. De estas
mismas mujeres y cinco hombres fueron
tomadas muestras de sangre y orina con
el mismo periodo de abstinencia.
partes iguales y cada una de ellas se
impregnó con 150 µl de las diluciones
mencionadas anteriormente. Después de
ser secados durante 24 horas se procedió
a su procesamiento.
Durante el proceso de extracción cada
fragmento de escobillón con los diferentes
frotis y diluciones y ¼ de fragmento de
cada mancha fueron depositados en
el tubo Eppendorff sin punta azul y
se añadieron 250 µl de agua destilada,
permaneciendo allí las muestras por
dos horas a temperatura ambiente, para
posteriormente ser centrifugado a 13000
rpm por cinco minutos. Se tomaron 200
µl del sobrenadante para ser analizados
en el test de RapidSignal PSA Serum
(Orgenics), realizándose el análisis por
triplicado, al igual que los blancos de
los frotis vaginales, orales, réctales y los
escobillones con leche materna, sangre
y orina los cuales reporta la literatura
como posibles falsos positivos.
En la siguiente fase se evaluó el método
en semen humano azoospérmico. Se
realizaron diferentes diluciones seriales
de semen humano azoospérmico desde
1/10 hasta 1/1000 000 (Yokota M et
al., 2001), aplicándolas a la ventana del
test de PSA, realizando la lectura diez
minutos después.
Estas mismas diluciones fueron
impregnadas en algodón poliéster, para
ser expuestas a temperatura ambiente
durante 24 horas, seguida por el proceso
de extracción similar al realizado en la
fase tres.
Se realizó con los datos generales una
tabla de contingencia de 2 x 2 (Tabla
1) aplicando un test de Fisher con la
hipótesis nula de independencia entre el
resultado de la prueba y la presencia de
semen en la muestra.
Posteriormente cada escobillón con los
diferentes frotis se fragmento en cuatro
Colombia forense
RESULTADOS
El límite mínimo de detección es de 10
ng/ml de PSA.
En muestras forenses (manchas y escobillones) se presentaron resultados positivos a partir de 500 ng/ml., excepto en
el frotis vaginal el cual reporto un limite
de detección a partir de 1000 ng/ml.
Saliva, materia fecal, fluidos vaginales,
orina femenina y masculina, sangre
femenina y masculina y leche materna
no presentaron interferencia en la
detección de la proteína.
Se registran resultados positivos en los
controles de las muestras de sangre y
orina pertenecientes a un individuo con
carcinoma prostático.
Siguiendo el manejo de datos sugerido
por Manrique et al.(1995) se obtuvo
una sensibilidad de 91.6% y una
especificidad de 100%. Se presenta un
valor predictivo positivo de 1.00 y un
valor predictivo negativo de 0.88, de
esta manera se puede decir que cuando
la prueba entregue un resultado positivo,
se puede asumir con gran certeza que la
muestra analizada contiene Antígeno
prostático especifico.
En semen humano azoospermico se
obtuvieron resultados positivos para
manchas a partir de la Dilución 1/100
Tabla 1. Tabulación general de de los
datos derivada de las muestras con
o sin semen y sus resultados en el
test.
Muestras
Positivas Negativas
Resultado positivo
131
0
Total
131
Resultado negativo
12
90
102
TOTAL
143
90
233
El test de Fisher arrojo un valor
p<0.001, por lo que podemos inferir
estadísticamente en una relación
dependiente entre el resultado de la
prueba y la presencia de semen en la
muestra.
26
DISCUSIÓN
Sensibilidad y especificidad
El limite de detección de 10 ng/ml
difiere del reportado en suero (3 ng/
ml), es posible que estas diferencias
en los límites de detección se deban a
las variadas formas en que se presenta
el PSA en suero tales como : PSA
libre y PSA ligado a su inhibidor alfa
antiquimotripsina (PSA-ACT) de otro
lado, en semen solamente encontramos
PSA libre (Qian et al., 1997), dado que
la concentración fisiológica de zinc
en semen (150-200 mg/L), inhiben la
formación del complejo PSA-ACT.
Si se tiene en cuenta el diseño del test,
se debe observar que el anticuerpo
monoclonal se encuentra estructurado
para reconocer un epítope en la región
demarcada en la proteína, la mayoría de
los anticuerpos monoclonales reconocen
regiones (I, II, IIIa y IV) que se encuentran
en el PSA unido a ACT, solo una región
(IIIb) se encuentra disponible para que
los anticuerpos se unan exclusivamente
al PSA libre (Piironen et al., 1998).
En muestras forenses con fluido vaginal
se detectan concentraciones de PSA
iguales o superiores a los 1000 ng/ml,
este resultado probablemente se debe a
la degradación de la proteína por parte
de la flora bacteriana presente en el
frotis vaginal.
No presentaron interferencia ni
registraron resultados positivos en la
detección PSA ante la ausencia de semen;
la materia fecal, saliva, sangre femenina
ni orina femenina lo que no descarta su
presencia en pequeñas cantidades, como
lo registran diferentes autores (Breul &
Hartung, 1994; Jaakkola et al., 1995;
Sawaya & Rolim, 2004; Simich JP, 1999;
Zarghami et al., 1997).
INMLCF
27
Aunque la sangre y orina masculinas no
presentaron interferencia en la detección
de la proteína, si se registraron resultados
positivos ante la ausencia del fluido
seminal, en el análisis estos fluidos de
un individuo que padece carcinoma
prostático, derivado posiblemente del
paso de la proteína de la próstata a la
circulación periférica, y al paso de la
uretra a través de la misma glándula.
Aunque no registramos el PSA en
individuos varones sanos, se debe tener
en cuenta los registros realizados por
Sato (2002), quien reporta la presencia
de esta proteína en varones a partir de
la pubertad.
La sensibilidad, especificidad, el valor
predictivo positivo y negativo indican que
el método de detección de PSA permite
detectar la presencia de semen, sin
descartar la realización de otras pruebas,
tales como la detección de actividad
de fosfatasa acida y la observación
de espermatozoides, no obstante es
necesario realizar la evaluación y
correspondencia de las mismas.
No se reporta falsos negativos derivados
del efecto Hook.
La concentración de PSA en plasma
seminal humano fue determinado
alrededor de 200.000-5.500.000ng/ml
(Sensabaugh, 1978), por tanto, el test
de PSA es una prueba aceptable en
la detección de semen en evidencias
forenses. Sin embargo se debe tener en
cuenta la presencia de fluidos que arrojen
falsos positivos, ya que las patologías
prostáticas se encuentran dentro de
la lista de canceres más comunes en
el mundo. También se debe tener en
cuenta los individuos que son sometidos
a la extirpación de la próstata ya que
cuando se realiza de forma radical, cesa
INVESTIGACIONES ORIGINALES
la emisión de semen en el orgasmo, y
cuando se realiza de forma parcial (más
de 25%) se da un eyaculación retrograda,
hacia la vejiga, en donde el semen es
mezclado con la orina para ser evacuado
en la micción posterior a la eyaculación
(Vargas, 2000).
CONCLUSIONES
Este trabajo permitió validar el test de
inmunocromatografía RapidSignal PSA
Serum (Orgenics) para la detección de
antígeno prostático especifico (PSA)
en muestras forenses (manchas secas
y escobillones) en el laboratorio de
Biología Forense del Instituto Nacional
de Medicina Legal –Regional Bogotá.
Se estableció que el método desarrollado
para la aplicación de la técnica de
inmunocromatografía RapidSignal PSA
Serum (Orgenics) tiene la capacidad
para detectar PSA en semen.
Se estableció que el método desarrollado
para la aplicación de la técnica de
inmunocromatografía
RapidSignal
PSA Serum (Orgenics) tiene un límite
de detección de 10 ng/ml. Algunos de
los fluidos analizados (saliva, materia
fecal, fluidos vaginales, orina femenina,
sangre femenina y leche materna) no
presentaron interferencia en la detección
de la proteína. Se presentaron resultados
positivos para la detección de la proteína
en el análisis de orina y sangre de un
individuo con cáncer de próstata.
A través de este trabajo reportamos una
sensibilidad de 91.6% y una especificidad
de 100%.
El valor predictivo positivo reportado es
de 1.00, el valor predictivo negativo es
de 0.88.
Se encontró evidencia estadística de una
relación dependiente entre el resultado
de la prueba y la presencia de semen en la
muestra. Existe una buena concordancia
entre observadores ante la interpretación
de los resultados del test.
Análisis de las regiones hipervariables del ADN
mitocondrial en 99 individuos originarios del
Departamento de Antioquia
Aspectos genético poblacionales
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Colombia forense
Autores
César Augusto Arévalo Ordóñez. Biólogo M.Sc.
Grupo de Genética Forense. Instituto Nacional
de Medicina Legal y Ciencias Forenses
Correspondencia: Calle 7 A # 12-61
[email protected]
Andrea Carolina Romero Lucena. Bióloga
Universidad del Tolima
[email protected]
Autor responsable de la correspondencia
César Augusto Arévalo Ordóñez. Biólogo M.Sc.
Calle 7 A # 12-61
[email protected]
Título abreviado
Análisis ADN MT población antioqueña
El presente artículo, se basa en análisis
complementarios al trabajo de grado ”Determinacion de los polimorfismos de secuencia
de las regiones hipervariables I y II del ADN
mitocondrial humano y establecimiento de una
base de datos para uso forense”, presentado
como requisito para optar al título de Biólogo.
Universidad del Tolima. Ibagué, (2007)
Fue desarrollado dentro del proyecto 519
de la división de Investigación científica del
Instituto, “Determinación de los polimorfismos
de secuencia de las regiones hipervariables I
y II de la región control del ADN mitocondrial
humano, en 100 individuos originarios del
departamento de Antioquia.”
28
Resumen
La técnica de amplificación mediante PCR
y secuenciación del ADN mitocondrial, se
ha convertido en una herramienta forense
muy importante para el análisis de muestras
escasas o degradadas, y la automatización del
proceso de cotejo, mediante bases de datos
permitirá en el futuro realizar una estimación
probabilística de la posibilidad de ocurrencia
de una coincidencia biológica. En el presente
estudio se usaron las secuencias obtenidas
a partir de individuos no emparentados del
departamento de Antioquia, y se agregaron
a la base de datos de ADN mitocondrial del
FBI, como cambios respecto a la secuencia
corregida de Cambridge. Los resultados
encontrados hasta el momento, muestran
una diversidad de 0.992166564, lo que
implica la necesidad de ampliar muestreos
poblacionales y evaluar el comportamiento de
las frecuencias haplotípicas para determinar
si es representativa de la población, antes de
ser usada en la resolución de casos forenses.
Se anota sin embargo, que aún en los estados
incipientes de la base, puede ser útil para la
toma de decisiones respecto a los análisis
complementarios a practicar a muestras
determinadas.
Analysis of HVI and
HVII mitochondrial DNA
regions on 99 individuals
from the Antioquia Region.
Population genetics
aspects
Abstract
Mitochondrial DNA analysis, has become
an important tool for the resolution of
forensic cases, specially when low quantity
or degraded samples are being analysed.
Data basing permits the automation of the
matching process and in the future to make
probabilistic estimates of the biological
match. In the present work sequences
from unrelated people from the Antioquia
Department were used, and were uploaded
to the FBI mitochondrial DNA database as
changes in reference to the revised Cambridge
reference sequence. Results show a diversity
of 0.992166564, so is necessary to make
larger samplings prior to make reports with
reference to this database.
Key words: Mitochondrial DNA, Data bases,
Haplotipic frequencies.
Palabras clave: ADN mitocondrial, bases de
datos, frecuencias haplotípicas.
INMLCF
29
INVESTIGACIONES ORIGINALES