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MATERIAL DE APOYO A LA DOCENCIA ENFERMEDADES CAUSADAS POR BACTERIAS FITOPATOGENAS CONTENIDOS: 1. ANTECEDENTES GENERALES II. CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES III. IDENTIFICACION DE BACTERIAS FITOPATOGENAS 3.1. Morfología de las colonias 3.2. Morfología celular y reacción Gram 3.3. Motilidad 3.4. Propiedades fisiológicas y bioquímicas 3.5. Propiedades serológicas IV. ESPECIFICIDAD PATOGENICA V. SINTOMAS 5.1. Hiperplasia (tumores) 5.2. Cancros, necrosis de la corteza 5.3. Marchitamientos, infecciones vasculares 5.4. Pudriciones blandas 5.5. Tizones foliares, muerte apical y manchas foliares VI. INFECCION Y PATOGENESIS 6. 1. Penetración 6.2. Patogénesis 6.2.a. Degradación enzimática de tejidas 6.2.b. Alteración del transporte de agua 6.2.c. Producción de fitotoxinas 6.2.d. Hipertrofia 6.2.e. Cambios genéticos 6.3. Dispersión y Sobrevivencia a. Habitantes del suelo b. Invasores del suelo c. Epifitos y endofitos VII. PRINCIPALES BACTERIAS FITOPATOGENAS EN CHILE (Latorre, 1992) 7.1. Agrobacterium tumefaciens 7.2. Agrobacterium rhizogenes 7.3. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis 7.4. Clavibacter michiganensis susp.insidiosum 7.5. Erwinia, carotovora subsp. carotovora 7.6. Erwinia carotovora subsp. atroseptica 7.7. Pseudomonas corrugata 7.8. Pseudomonas solanacearum 7.9. Pseudomonas syringae pv. coronafaciens 7.10. Pseudomonas syringae pv. lachrymans 7.11. Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 7.12. Pseudomonas syringae pv. tomato 7.13. Pseudomonas syríngae pv. syríngae 7.14. Streptomyces scabies 7.15. Xanthomonas campestris pv. juglandis 7.16. Xanthomonas campestris pv. phaseoli 7.17. Xanthomonas campestris pv. campestris 7.18. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria VIII. CONTROL DE ENFERMEDADES BACTERIANAS 8.a. Variedades resistentes 8.b. Medidas de Exclusión: 8.c. Medidas Sanitarias 8.d. Tratamientos químicos IX. Control de algunas patologías bacterianas - Control de las Agallas de la Corona en frutales - Cancer bacteriano, gomosis o savia ácida en frutales - Cancro bacteriano en tomate I. ANTECEDENTES GENERALES Los primeros indicios de la partícipaci6n de bacterias en procesos patológicos en plantas derivaron de estudios de fines del siglo pasado e inicios del presente. Con anterioridad a esto, se pensaba que 1as bacterias eran capaces de causar enfermedades en animales y que el rol de fitopat6genos era atribuible a hongos. En Norteamérica, entre 1883 y 1886, Burril y Arthur estudiaron el tizón del peral y descubrieron su etiología bacteriana. En Holanda, Walter trabajó con la amarillez del narciso y en Italia, Savastano estudio el mal negro de la vid llegando a reconocer la participación directa de bacterias en las respectivas patologías. Sin embargo, solo luego de los estudios del norteamericano Erwin Frink Smith (1854 – 1927) se logró el reconocimiento de las bacterias como agentes etológicos de enfermedades de plantas. El número de patologías descritas atribuibles a bacterias y micoplasmas es mucho menor que para el caso de hongos. No obstante, existen enfermedades de origen bacteriano que son especialmente importantes por causar graves pérdidas, como es en los casos del tizón violento o fogón del peral que afecta a varios frutales (Erwinia amylovora), la marchitez de las Solanáceas (Pseudomonas solanacearum), la cancrosis de los cítricos (Xanthomonas campestris pv. citri) o la marchitez amarilla de la remolacha azucarera provocada por un micoplasma. En términos generales, las enfermedades causadas por bacterias son, más importantes en zonas cálidas, tropicales y subtropicales que en zonas templadas. Actualmente se reconocen bacterias fitopatógenas dentro de 1os siguientes géneros: Agrobacterium spp. Clavibacter spp. ( = Corynebacterium spp.) Erwinia spp. Pseudomonas spp. Streptomyces spp. Xanthomonas spp. Xylella spp. II. CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES Las bacterias son organismos procariontes, unicelulares que carecen de sistemas de membranas y se reproducen por división binaria. Las células bacterianas pueden tener forma bacilar o cilíndrica (bacilos), esférica (coccos), filamentosa, de coma (vibrión) u otras. Algunas bacterias tienen la capacidad para desplazarse por medios líquidos gracias a la existencia de flagelos que pueden presentarse alrededor de toda la célula (perítricos) o solo en uno o ambos extremos o polos. Las células bacterianas se encuentran rodaedas de una pared celular rígida de peptidoglicano (bacterias Gram +) a lo cual se suma una capa de lipopolisacárido en bacterias Gram -. Además de éstas, es común que las bacterias se presenten envueltas por una capa mucosa o cápsula. Las bacterias fitopatógenas son parásitos facultativos que pueden ser cultivados sin mayor dificultad en el laboratorio sobre medios de cultivo corrientes. La gran mayoría posee metabolismo aer6bico o anaeróbico facultativo. Las principales características de los géneros de bacterias fitopatogénicas son las siguientes: Agrobacterium spp. Bacilos Gram – con flagelación peritrica, metabolismo aeróbico, en medio con suficientes carbohidratos produce abundantes polisacáridos extracelulares, catalasa positivos, oxidasa positivos, colonias blanco – cremosas. Corynebacterium spp. Bacilos Gram + pleiomórficos, rectos a ligeramente curvos, las células permanecen unidas formando cadenas con forma de V. Indol negativos, no reducen nitratos, crecimiento restringido en medios con glucosa, colonias naranjas a amarillas. Erwinia spp. Bacilos Gram – con flagelos perítricos, anaeróbicos facultativos, fermentan la glucosa, oxidasa negativos, catalasa positivos. Crecen bien en medios simples. Colonias de colores grisaceas a blanquecinas opacas. Pseudomonas spp. Bacilos Gram – con flagelación polar (monotricos o lofotricos), oxidasa positivos o negativos, catalasa positivos, colonias grices o blanco opacas. Streptomyces spp. Bacilos Gram + que tienden a formar pseudomicelio ramificado y conidias. Xanthomonas spp. Bacilos Gram -, flagelación monotrica polar, aeróbicos, catalasa positivos, oxidasa debil o negativos, hidrolisan el Tween 80, no reducen nitratos, colonias usualmente de colores amarillos. Todas las especies del género son fitopatógenas. III, IDENTIFICACION DE BACTERIAS FITOPATOGENAS La identificación de las bacterias fitopatógenas se basa en varias propiedades, como las siguientes: 3.1. Morfología de las colonias Esta es una característica que depende del medio de cultivo y condiciones de íncubación, pero es estable y reproducible por la que posee un importante valor en la identificación. Las colonias pueden ser descrítas de acuerdo a la forma (redondas, ovales), diámetro alcanzado luego de determinado período de incubación a determinada temperatura, características de la superficie (estriada, opaca, brillante, etc.), color, margen, etc. 3.2. Morfología celular y reacción Gram Existe poca diversidad de formas celulares. La mayoría corresponden a bacilos cortos, Gram + (Clavibacter spp.) y Gram - (Pseudomonas spp., Xanthomonas spp., Erwinia spp. y Agrobacterium spp.). Las bacterias pertenecientes al grupo de Corynebacterium spp.. son Gram + y pleomorficas, es decir, presentan células que asemejan la escritura cuneiforme, con células en forma de V, L y aglomerados muriformes (empalizada). Las bacterias pertenecientes al género Streptomyces spp. desarrollan un pseudemicelio ramificado donde se producen conidias. 3.3. Motilidad Los géneros Agrobacterium spp., Erwinia spp., Pseudomonas spp. y Xanthomonas spp. poseen flagelos por lo que sus células son mótiles (móviles). Existe una tinción especial para determinar motilidad. 3.4. Propiedades fisiológicas y bioquímicas. Existen varias propiedades que pueden ser determinadas a traves de pruebas especiales. Algunos análisis determinan los requerimientos de oxigeno por lo que se pueden catalogar como aerobios y anaerobios, estrictos o facultativos. Otras pruebas buscan determinar la habilidad de las bacterias para degradar determinados compuestos como azúcares, aminoácidos, almidón, utilización de nitratos, presencia de enzima catalasa, producción de indol, etc. Por otro lado se estudian los requerimientos térmicos y de pH. 3.5. Propiedades serológicas Muchas bacterias pueden identificarse rápidamente a través del empleo de técnicas serológicas como la aglutinación, precipitación, ELISA, etc. IV. ESPECIFICIDAD PATOGENICA Algunas bacterias presentan gran especificidad por la planta hospedera lo que se expresa con la categoría taxonómica denominada patovar (pv) que indica la habilidad patogénica para desarrollar la enfermedad en determinados hospederos. Por ejemplo: Xanthomonas campestris pv. citri ataca solo a cítricos. Xanthomonas campestris pv. phaseoli ataca solo al poroto. Xanthomonas campestris pv. juglandis ataca solo al nogal. Por el contrario, existen otras bacterias fitopatógenas que se caracterizan por tener un amplio rango de hospederos. Erwinia carotovora ataca a una gran variedad de plantas e igualmente Agrobacterium tumefaciens es capaz de infectar casi cualquier planta dicotiledónea. En la mayoría de los casos, las especies patógenas que poseen un amplio rango de hospederos son relativamente más heterogéneas. V. SINTOMAS Las bacterias fitopatógenas son capaces de producir diversos síntomas similares a los producidos por hongos fitopatógenos. 5.1. Hiperplasia (Tumores) Crecimiento y división celular anormal causado por un desbalance en el nivel de hormonas o por la transformación del material genético debido a la introducción de un factor genético extracromosomal. Ejemplo: Agallas de la corona, causada por Agrobacterium tumefaciens. 5.2. Cancros, necrosis de la corteza. Necrosis del tejido de la corteza de tallos o ramas, generalmente hundidos y con cambios en la coloración del tejido afectado. Ejemplo: Cancer bacteriano de frutales causado por Pseudomonas syringae. 5.3. Marchitamientos, infecciones vasculares. Invasión del tejido xilemático; obstrucción del sistema de transporte del agua. Ejemplo: marchitamientos causados por Pseudomonas solanacearum. 5.4. Pudriciones blandas. Pudrición de tejidos vegetales causados por enzimas pécticas de origen bacteriano. Ejemplo: tizón bacteriano del frejol, causado por Erwinia carotovora. 5.5. Tizones foliares, muerte apical y manchas foliares. Necrosis local de los tejidos vegetales, generalmente causados por toxinas bacterianas y procedidos por manchas de aspecto acuoso. Ejemplo: tizón bacteriano del frejol causado por Xanthomonas campestris pv. phaseoli. VI. INFECCION Y PATOGENESIS 6.1. Penetración. A diferencia de los hongos, las bacterias fitopatógenas no poseen mecanismos enzimáticos ni mecánicos para la penetración directa de las plantas hospederas. El acceso a los tejidos internos del vegetal lo logran penetrando a través de las aberturas naturales (estomas, lenticelas, hidátodos, cicatrices foliares, etc.) y heridas o daños provocados por las labores agrícolas, insectos, nemátodos, factores físicos como heladas, etc. las heridas no solo contemplan grandes abrasiones de la superficie del vegetal, sino que tambien ruptura de pelos, glándulas, etc. La motilidad (movimiento)de las células bacterianas por medio de los flagelos es considerada como una característica que favorece la penetración. 6.2. Patogénesis Las bacterias fitopatógenas son capaces de ejercer su acción patogénica a través de varios mecanismos: 6.2.a. Degradación enzimática de tejidos. Muchas bacterias producen enzimas extracelulares que hidrolizan los componentes estructurales de la pared celular de las plantas. Dentro del género Erwinia spp., Cepas de E. carotovora producen grandes cantidades de enzimas pecticas que son las responsables de las pudriciones. La celulosa puede ser degradada por Pseudomonas solanacearum y algunos patovares de Xanthomonas campestris. No existen bacterias que degraden la lignina. 6.2.b. Alteración del transporte de agua. Como resultado de esta disfunción se obtiene el síntoma de marchitamiento. Este puede ser consecuencia de la obstrucción de los vasos xilemáticos por las masas de células bacterianas (X. campestris pv campestris) o por el efecto que tienen los metabolitos de origen bacteriano en el tejido conductor (Clavibacter michiganensis). 6.2.c. Producción de fitotoxinas. Se han detectado toxinas de origen bacteriano que afectan al metabolismo de la planta hospedera y, al menos en parte, explican los síntomas de determinadas patologías. Pseudomonas syringae produce toxinas fitotoxicas. 6.2.d. Hipertrofia. Existen varias bacterias que producen sustancias similares a las hormonas vegetales que influyen sobre las células vegetales causando, desbalances en el crecimiento vegetal dando origen a hiperplasias e hipertrofias. Ejemplos de éstos son Pseudomonas syringae pv. savastonoi y Corynebacterium fascians. 6.2.e. Cambios genéticos. La bacteria Agrobacterium tumefaciens porta un plásmido (TI) que luego, de la infección es incorporado al material genética de la planta con la cual se promueve a la división celular y formación de agallas. 6.3. Dispersión y Sobrevivencia La dispersión de las bacterias fitopat6genas desde plantas enfermas a plantas sanas ocurre por el salpicado del agua de lluvia, regadío, por el viento, por la acción de animales como insectos plaga y polinizadores, nemátodos, por la acción del hombre, a través de las labores culturales, etc. La dispersión a mayor escala comprende la diseminación del agente patógeno desde áreas infectadas a áreas libres del patógeno lo que ocurre a través del uso de germoplasma contaminado, por ejemplo tuberculos, semillas, bulbos, esquejes, etc., por introducción de suelo u otros materiales contaminados, por comercializaci6n de plantas con infección asintomática, etc. Las bacterias pueden ser acarreadas en residuos vegetales o contaminando la semilla, externamente o en la testa, en el endosperma o en el embrión. Aún bajos niveles de infección o contaminación pueden tener importancia como focos para infecciones primarias, a partir de los cuales, si las condiciones son favorables, se pueden originar epidemias. Las bacterias fitopatógenas no producen estructuras especializadas para la sobrevivencia como es en los hongos donde existen esporas, esclerocios y otras estructuras resistentes. No obstante, son capaces de sobrevivir por períodos que dependen de las condiciones ambientales. En términos generales, la sobrevivencia será mayor cuando se encuentren en lugares de baja humedad y temperatura con escasa actividad microbíana. Se pueden distinguir al menos 3 patrones de sobrevivencia: a. Habitantes del suelo. Algunas bacterias fitopatogénicas son habitantes del suelo pudiendo vivir y reproducirse saprofíticamente en restos de materia orgánica semidescompuesta en el suelo. Este es el caso de Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas solanacearum, Erwinia carotovora y Erwinia artroseptica. b. Invasores del suelo. Algunas especies bacterianas tienen una sobrevivencia limitada en el suelo permaneciendo asociadas a los restos de cultivos enfermo y escasamente sobreviven en ausencia de tales sustratos. A este grupo pertenece Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. c. Epífitos y endófitos. Las bacterias epífitas crecen y se multiplican en la superficie o filaplano de hojas, flores, frutos, ramas, etc., sin causar daño al vegetal a menos que logren penetrar e infectar los tejidos internos de la planta hospedera. Las bacterias end6fitas son capaces de colonizar internamente a plantas sin causar síntomas patológicos a la planta que puede corresponder a una maleza que en tal caso puede actuar como reservorio de inóculo. Ejemplo: Pseudomonas syringae pv syringae. VII PRINCIPALES BACTERIAS FITOPATOGENAS EN CHILE (Latorre, 1992) 7.1 Agrobacterium tumefaciens Ataca a frutales como almendro, cerezo, guindo, ciruelo, damasco, duraznero, nectarino, frambueso, kiwi, manzano, nogal, peral, rosal, vid, causando agallas de la corona 7.2. Agrobacterium rhizogenes Ataca al manzano causando proliferaci6n de raices. 7.3. Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Ataca el tomate causando el cancro bacteriano. 7.4. Clavibacter michiganensis subsp insidiosum Ataca a la alfalfa causando la marchitez bacteriana. 7.5. Erwinia carotovora subsp. carotovora Ataca al apio y zanahoria causando pudrición acuosa. Ataca al esparrago y zanahoria causando pudrición hedionda. Ataca a la papa causando el pie negro o pudrición acuosa del tubérculo. Ataca a la remolacha azucarera causando necrosis y pudrición vascular. 7.6. Erwinia carotovora subsp. atroseptica Ataca al esparrago causando pudrición acuosa. 7.7. Pseudomonas corrugata Ataca el tomate causando necrosis medular. 7.8. Pseudomonas solanacearum Ataca a las Solanaceas ( papa, tomate) causando Marchitez bacteriana. 7.9. Pseudomonas svringae pv coronafaciens Ataca a la avena causando el Halo bacteriano o tizón. 7.10. Pseudomonas syringae pv lachrymans Ataca a Cucurbitáceas causando mancha angular. 7.11. Pseudomonas syringae pv phaseolicola Ataca al poroto causando el tizón del halo. 7.12. Pseudomonas syringae pv tomato Ataca al tomate causando la peca bacteriana o mancha del halo 7.13. Pseudomonas syringae pv syringae Ataca arroz Causando la mancha bacteriana de la hoja y el grano. Ataca al almendro causando el cancer bacteriano. Ataca al peral causando el tizón bacteriano. Ataca al cerezo, guindo, ciruelo, damasco, duraznero, nectarino, causando el Cancer bacteriano, gomosis o savia ácida. Ataca a la arveja causando mancha café o tizón foliar. 7.14. Streptomvces, scabies Ataca a la papa causando sarna común. 7.15. Xanthomonas campestris pv juglandis Ataca al nogal causando la peste negra. 7.16. Xanthomonas campestris py. phaseoli Ataca al poroto causando el tizón común. 7.17. Xanthomonas campestris pv campestris Ataca a crucíferas causando la mancha angular. 7. 18. Xanthomonas. campestris pv vesicatoria Ataca al tomate causando la mancha bacteriana o tizón bacteriano. VIII CONTROL DE ENFERMEDADES BACTERIANAS Las enfermedades ocasionadas por bacterias fitopatogénicas son especialmente dificiles de controlar y pueden llegar a ser muy destructivas por lo que la mejor estrategia de control se basa en la aplicación de medidas preventivas. 8.a. Variedades resistentes Comúnmente se recomienda utilizar solo variedades resistentes, pero estas no siempre están disponibles o la resistencia puede basarse en una ausencia de síntomas a pesar de que el patógeno puede estar abundantemente presente, con lo cual se aumenta el riesgo de que cultivos vecinos susceptibles adquieran la enfermedad. 8.b. Medidas de exclusión. Otras medidas preventivas comprenden aquellas tendientes a evitar la introducción del patógeno al área del cultivo o que se extienda dentro del área del cultivo. Aquí se consideran medidas cuarentenarias, uso de semilla o material de propagación sanos, certificados, libres del patógeno o sometidos a desinfección por tratamiento con desinfectantes como el hipoclorito de sodio o antibióticos. 8.c. Medidas sanitarias. La adopción de medidas sanitarias preventivas tiene una gran importancia y comprenden la eliminación de vectores, aplicación de medidas sanitarias en las labores de cultivo y durante la cosecha. En el control del Cancro bacteriano del tomate, estas medidas contemplan la desinfección periódica de herramientas y utensilios usados en las labores de poda y deshoje en una solución de hipoclorito de sodio al 1%, trazado de rutas fijas dentro del invernadero, delimitación de áreas manejadas individualmente por los operarios, uso de vestimenta adecuada, etc. Tambien se contempla la eliminación inmediata de plantas con síntomas, así como aquellas vecinas, destrucción de restos infectados e implantación de señales de alerta para el sector infectado. También se contempla la rotación de cultivos, eliminación de hospederos alternativos, malezas y plantas voluntarias, control de insectos vectores. 8.d. Tratamientos químicos. Control químico preventivo con desinfectantes cúpricos (oxicloruro de cobre, oxido cuproso, hidróxido cúprico) o antibióticos (estreptomicina, tetraciclina, terramicina, kasugamicina). IX. CONTROL DE ALGUNAS PATOLOGÍAS BACTERIANAS Control de las Agallas de la corona en frutales Agente etiológico: Agrobacterium tumefaciens Tipo de sobrevivencia: habitante del suelo. Medidas preventivas: 1. Medidas culturales: Rotación de cultivos incluyendo cereales en el terreno destinado al vivero de árboles. Selección de plantas sin agallas. Evitar daños a las raíces y cuello. Control de malezas. 2. Control biológico preventivo, sumergiendo la semilla o raíces en una suspención de Agrobacterium radiobacter raza 84 (K84), sobre 108 células/ml por 5 minutos. 3. Control químico preventivo, tratando semillas o raíces en soluciones antibióticas (estreptomicina, oxitetraciclina) o desinfectantes (hipoclorito de sodio). 4. Medidas terapeuticas de post – infección: extirpar completamente la agalla y tratar la herida con algún protectante. Cancer bacteriano, gomosis o savia ácida en frutales Agente etiológico: Pseudomonas syringae pv. syringae Síntomas: brotación desuniforme o retardada. Atizonamiento de brotes y flores durante la brotación, a veces confundible con los daños por heladas. Muerte de yemas y brotación desuniforme. En el tronco y ramas se desarrollan cancros que exudan goma ambar durante el invierno y primavera. Los tejidos subcorticales presentan lesiones necrosadas con márgenes acuosos y difusos, con un marcado olor a fermentación. Muerte parcial o total de ramas durante los meses de mayor calor. Los árboles enfermos tienden a rebrotar desde sus raíces. Se favorece con temperaturas moderadas o frías (0 – 15°C) y con la presencia de lluvias, rocio o neblina que mantenga mojadas las ramillas durante la caída de las hojas y en la brotación. En arándano se presentan lesiones necróticas en las hojas y en damasco pueden presentarse lesiones necróticas y rojizas sobre los frutos. Tipo de sobrevivencia: Epífito. Control: establecimiento del vivero en zonas semiáridas, poco favorables al desarrollo del cáncer bacteriano. Selección de plantas sanas en que no se observen yemas muertas o cancros en formación. Evitar exceso de fertilización nitrogenada. Eliminación de cancros durante el verano y tratamiento de la herida con alguna pasta protectora (isotiazolín). Incineración de cancros. Evitar podar durante épocas de mayor humedad ambiental. Aplicaciones de óxido de cobre u oxicloruro de cobre + aceite mineral antes de la brotación. En huertos de ciruelos, damascos, duraznos y nectarinos en formación, es especialmente necesario tratar a inicios de la caída de hojas y en estado de yema hinchada con los fungicidas arriba indicados. Cancro bacteriano en tomate Agente etiológico: Clavibacter michiganensis Síntomas: Marchitez, clorosis y desecación del follaje. Estos síntomas aparecen en forma unilateral en la planta. Cancros abiertos se desarrollan a lo largo de los tallos, generalmente precedidos por el desarrollo de estrías blanquecinas. Al cortar longitudinalmente o transversalmente los tallos o pecíolos se observa una amarillez y necrosis del tejido vascular. En los frutos aparecen pequeñas lesiones necróticas rodeadas por un halo blanquecino que otorga el aspecto de un ojo de pájaro. En Chile son poco frecuentes las infecciones al fruto. Tiene gran importancia económica en los cultivos de la zona centro – norte del país, en donde la práctica del monocultivo ha favorecido la persistencia de este organismo en el suelo, intensificando la incidencia y severidad de esta enfermedad. Control: establezca una rotación de cultivos con a lo menos un año libre de tomate, cuando sea posible practique la siembra directa, destruya las plantas enfermas tan pronto como las detecte y elimine completamente los residuos enfermos. Use semilla sana y desinfectada. Durante la poda y el deshoje desinfecte los utensilios en hipoclorito de sodio al 1%. Tratamientos a las semilla: inmersión en : 1. Ácido clorhídrico al 5% por 5 horas, pero puede afectar la germinabilidad de la semilla. 2. Acetato cúprico acidificado al 0,25% a 0,5% por 20 minutos. 3. Agua a 52°C por 20 minutos o a 56°C por 30 minutos. Una reducción parcial se puede conseguir con: hipoclorito de sodio al 1% por 40 minutos. 4. Fermentación de la semilla al momento de extraer la pulpa por 72 a 96 horas a 20°C. 5. Acidificación con ácido clorhídrico al extraer la semilla y un rápido secado a 66°C. Tratamientos al follaje: En general son poco eficientes, pero si fuese necesario es posible la utilización de uno de los siguientes bactericidas: estreptomicina (1000 g.i.a/ha), oxicloruro de cobre (2000 – 3600 g.i.a/ha), hidróxido cúprico (4500 g.i.a/ha).