Download Lab5-Desarrollo_Mapas_Restriccion

Biol. 3030 – Biología del Desarrollo
Ejercicio 5 – Mapas de restricción
Introducción:
Con este ejercicio se pretende demostrar los principios básicos de mapas de plásmidos usando enzimas de
restricción mediante simulaciones, prácticas de bioinformática y el análisis de un ejercicio práctico.
Enzimas de restricción:
Las enzimas de restricción fueron
descubiertas por su habilidad de
degradar, digerir o restringir DNA
extraño y son exclusivas de procariotas.
Estas enzimas nucleasas se clasifican en
endonucleasas
y
exonucleasas
dependiendo si necesitan o no extremos
libres en un DNA para digerir la molécula
Ellas pueden distinguir entre el DNA
normalmente presente en la célula de
aquel DNA que aparece por ejemplo por
la infección de un bacteriófago. Ellas
defenderán a la célula de la invasión
cortando
ese
DNA
extraño
en
fragmentos y dejándolo no funcional.
Las enzimas mayormente utilizadas en la
investigación
reconocen
secuencias
palindrómicas de 4-6 pb. Estas
Figura 1. – Ejemplos de sitios de
secuencias leen lo mismo de 5’3’ en
restricción para varias enzimas conocidas.
ambos lados de la doble cadena, son
Asegúrese de notar el aspecto palindrómico
específicas para cada enzima y son
de la secuencia. Que indican las flechas?
conocidas como lugares de restricción
(Figura 1). La enzima hace un corte en el enlace fosfodiesterico del DNA en una posición específica. Sus
nombres provienen de la bacteria (genero/especie/cepa) de la cual se purifican así como el número
purificadas de esta. Bajo condiciones
apropiadas, (concentración de sal, pH y
temperatura), enzimas como EcoRI
dejan
un
fragmento
escalonado
(mientras AluI dejaría uno romo) en cada
punto de la secuencia que se encuentre
su lugar de restricción. El número de
fragmentos y los tamaño depende de la
ubicación de estos lugares en la
secuencia completa. Se puede aproximar
por 4xdonde x es el numero de bases en
el palíndrome, así EcoR1 debe encontrar
su palíndrome 46= 4096 bases en una
secuencia.
Plásmidos e Ingeniería genética
Figura 2 – Plásmido S5. Note sitio Ori,
secuencia beta lactamase y los múltiples lugares
de restricción
Los
mapas
de
plásmidos
han
revolucionado la biología molecular y
pavimentado el camino para la industria
de la biotecnología. Con esta técnica el
biólogo
molecular
puede
evaluar
rápidamente el éxito que podría tener en
experimentos de clonación, así como
identificar fácilmente plásmidos y los
1
rasgos asociados a estos en los organismos. Los plásmidos son moléculas relativamente pequeñas de DNA
extracromosomal de arreglo circular. Por lo general estos contienen una secuencia que sirve como origen de
replicación (Ori) por lo que se pueden replicar en la bacteria independientemente del cromosoma.
Típicamente también contienen genes que codifican para la resistencia a antibióticos, esto le da a la bacteria
que lo tenga una ventaja de selección sobre otras bacterias que compitan por el medio de crecimiento. y al
científico una forma fácil de detectar que bacteria contienen el plásmido porque son resistentes a cultivos en
medio con dicho antibiótico. Una tercera característica importante en los plásmidos usados como vector es un
lugar para múltiples clonaciones (MCS o polylinker) que consiste de múltiples palindromes para muchas
enzimas de restricción, que permite usar múltiples combinaciones de enzimas a la hora de clonar alguna
secuencia o inserto. Rutinariamente los científicos sacan ventaja del DNA del plásmido y de la defensa natural
de la bacteria (enzimas de restricción) como la base de la biotecnología (Figura 2). Una vez que el plásmido
es cortado en fragmentos por la enzima, estos pueden ser unidos o ligados a un pedazo de DNA de cualquier
otro organismo que también hayan sido cortado con la misma enzima. El DNA-plásmido híbrido o quimérico
resultante se puede introducir en bacterias por transformación. Este híbrido se replicará por si mismo como
antes, solo que el DNA insertado ahora también es perpetuado junto a el. El fragmento de DNA ajeno al
plásmido se le llama que fue “clonado” y al plásmido se le llama “vector”.
Mapas de Plásmidos
Los plásmidos se pueden describir o representar en mapas en términos de la localización de los sitios de
restricción usando experimentos simples y lógica. El procedimiento en general es digerir el plásmido con dos
enzimas por separado (digestiones simples) y una digestión simultánea con ambas enzimas (digestión doble).
Los tamaños de los productos de digestión se analizan en una electroforesis y luego se usa la lógica para
determinar la posición relativa de los sitios de restricción. Como los plásmidos son circulares, el número de
fragmentos representan el número de cortes o lugares de restricción. Como sería si el DNA fuera lineal?
Para visualizar este concepto mejor se puede utilizar una banda de goma y cortarla con una tijera una vez,
dos veces y así sucesivamente y contar los pedazos luego de cada corte. La parte mas informativa del los
mapas de plásmidos resulta del uso de la lógica para solapar la información de las digestiones simples con la
de la doble. Como los cortes con una enzima solapan con los cortes de la segunda enzima? Hay detalles
claves que ayudan:
- Queda cualquiera de los fragmentos sin cortarse cuando se usa la segunda enzima.
- Los tamaños de los fragmentos de la digestión doble suman al tamaño de uno de los fragmentos de la
digestión simple?
- Algún fragmento se mantiene del mismo tamaño aun cuando lo exponga a la segunda enzima?
Revise el siguiente ejemplo (figura 3)
Un plásmido de 1000 pb es digerido y los fragmentos separados en gel de agarosa.
Marcador de
tamaño (pb)
1000
700
500
300
200
Sin cortar
(pb)
1000
Corte con Enzima A
(pb)
Corte con enzima B
(pb)
1000
Corte con ambas
(pb)
700
300
500
300
200
Figura 3. Ejemplo de
análisis de datos
sobre digestión de
plásmidos con
enzimas d
restricción.
2
Note que hay dos fragmentos de 1000pb (sin cortar y cortado con la enzima B), pero corren igual en la gel?
No necesariamente! Hay pequeñas diferencias en la migración de un plásmido si está sin cortar-relajado,
lineal, o sin cortar-superenrrollado. También fragmentos de tamaños parecidos pueden co-migrar en la
agarosa y fragmentos muy pequeños pueden no observarse en la gel por la sensibilidad de la tinción o porque
se salen de la misma.
Como se lee un Mapa de plásmido?
Un mapa de plásmido incluye información básica sobre 1) el tamaño, 2) los genes presentes, 3) el origen de
replicación y 4) los lugares de restricción para enzimas. Los plásmidos a utilizarse en este ejercicio salieron
del pTZ18U pero contienen diferentes insertos de DNA. Cualquiera de las enzimas marcadas como presentes
en ellos se podrían usar para analizarlos. Como la molécula es circular hay un 0 arbitrario y todos los lugares
de restricción son indicados con un número entre 0 y el total de pb en el plásmido. Los tamaños de los
fragmentos se calculan restando o sumando los puntos en el plásmido. El nombre del plásmido y su tamaño
aparece en el centro del círculo. El origen de replicación aparece marcado como Ori, el gen para betalactamasa (enzimas que confiere la resistencia contra ampicilina) y la localización para el DNA de
bacteriófago lambda son mostradas (Figuras 2 y 4).
Procedimiento:
1. Se le suministrarán hojas con secuencias para que identifique lugares de restricción para enzimas y
simule la actividad de estas.
2. Se le suministrará un mapa de un plasmido para que conteste preguntas sobre fragmentos, diagrame
geles y construya mapas usando bases de datos de bioinformática y simuladores.
3. Contestara las preguntas que acompañan cada ejercicio.
4. Virtual
lab
para
electroforesis
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/virgel.html
5. Virtual
lab
para
mapas
con
enzimas
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/maps.html
6. Enzimas
de
restricción
y
otras
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/index.html
de
restricción
enzimas
Preguntas sobre lectura de plásmidos:
1. usando el mapa del plásmido 2, prepare
una lista de las enzimas que podrían
dañar el gen de la beta-lactamasa y la
secuencia de lambda.
2.
Cual plásmido es mas grande el 2 el 5?
Porque?
3
3.
Usando el plásmido 2, cuantos lugares para PvuII hay. Cual es la localización de cada uno? Si lo usaras
para digerir este plásmido, cuantos fragmentos se obtendrían?
4.
Cuales son los tamaños de los fragmentos generados por PvuII en S2?
5.
Como se verán en una gel? Dibuja la gel y rotula carriles y los fragmentos con sus tamaños
6. Ahora simularas una doble digestión con EcoRI y PstI. Determina los tamaños. Completa la siguiente
tabla:
Enzimas 
Fragmentos
Plásmido S2 (5869 pb)
EcoRI
PstI
Ambas
Total
7. Si el plásmido S2 fuera digerido y analizado en una gel de Agarosa como se vería la gel? Diagrame
la gel con los cortes simples en carriles separados y con la digestión doble en un tercer carril.
4
Construcción de un Mapa de Plásmido
1. El primer paso en la construcción de un mapa de restricción de un plásmido es determinar cuantas
veces se encuentra en el un lugar de restricción. Veamos la data para el plásmido S5. Los datos en la
siguiente tabla son de digestiones dobles usando a Eco RI y Pst I. Tambien hay datos de digestiones
simples con las mismas enzimas. Los números en las columnas representan los tamaños de los
fragmentos generados al digerirlo con cada enzima.
Enzimas 
Fragmentos
9481
Plásmido S5(9841 pb)
EcoRI
PstI
2860
2838
1986
1093
468
164
72
Ambas
2832
2817
1986
1093
468
164
72
43
Total
Preguntas para el mapa de plásmido
1. Cuan grande es el plasmido S5? Como lo sabes?
2. Observa los datos de la digestión con EcoRI. Cuantos fragmentos hay? Cortó la enzima el plásmido o
este se quedó como un circulo? Como puedes estar seguro?
3. Compara los datos de la digestión con PstI con los de la digestión con EcoRI. Cuantos fragmentos
hay con PsTI? Cuantos lugares de restricción hay para PsTI?
4. Cuantos fragmentos hay cuando ambas enzimas se usan simultáneamente para digerir a S5?
Contesta esto la pregunta si EcoRI digiere o no al plásmido? Porque?
5. Algun fragmento de la digestión con PsTI posee también un lugar de reconocimiento para EcoRI?
Cual es? Como sabes esto?
5
6. Dibuja el fragmento de PstI que también es reconocido por EcoRI para documentarlo.
Preparación de un Mapa
La preparación de un mapa de restricción es un ejercicio de pensamiento crítico y lógica. El plasmido S5 es
difícil para formar su mapa por que tiene mucho lugares para PstI. Con estos datos se hace muy difícil colocar
todos los lugares de restricción en orden. Es mas fácil un mapa del plásmido S3.
7. En la siguiente tabla están los datos generados de la digestión del plásmido S3 con las mismas enzimas.
Cuantas veces corta cada enzima? Cuales son los tamaños de los fragmentos?
Enzimas 
Fragmentos
6504
863
Plásmido S3 (________________pb)
EcoRI
PstI
4507
2860
Ambas
3687
2817
820
43
Total
8. De los datos de la digestión simple con EcoRI se desprende que los tamaños no son iguales. Prepara
un posible mapa y rotula los lugares para Eco R1con sus tamaños.
9. Ahora dibuja un mapa sugerido para los lugares de PstI en S3. Recuerda rotular lugares y tamaños de
los fragmentos.
10. Dibuja el mapa circular del plásmido S3 digerido con ambas enzimas. Marca los tamaños de cada
fragmento y rotula los lugares de restricción con las enzimas correspondientes.
6
11. Habrá algún otro orden posible para los lugares de restricción en el plásmido S3 para estas dos enzimas?
Como tu resolverías entre estas posibilidades cual es las mas correcta?
12. Si hubieras corrido una gel con estos fragmentos, faltaría alguna banda o fragmento en la gel? Cual?
Porque?
Enlaces de interés.
Biotechnology and Genetic Engineering
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/index.html
Molecular toolkit
http://www.vivo.colostate.edu/molkit/
Restriction Maps
http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Restmap.html
Restriction Digest Maps
http://www.nslc.wustl.edu/courses/bio2960/labs/07dna/restriction/
7