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Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas
Escuela Superior de Sanidad “Dr. RAMON CARRILLO”
Universidad Nacional del Litoral
Tema 1: Proceso analítico general
1. Introducción
La química analítica se divide en dos ramas principales: cualitativa y cuantitativa. El
análisis cualitativo determina qué tipo de constituyente o constituyentes se encuentran en la
muestra analítica, y el análisis cuantitativo determina la cantidad de determinada sustancia que
se encuentra en la muestra. Con la instrumentación y la variedad de métodos químicos
disponibles, puede lograrse gran especificidad o selectividad para que las mediciones
cuantitativas también sirvan como mediciones cualitativas. No obstante, las pruebas cualitativas
sencillas suelen ser más rápidas que los métodos cuantitativos.
2. El proceso analítico
El proceso analítico sigue una secuencia: 1) definición del problema; 2) obtención y
disolución de la muestra; 3) llevar a cabo la separación necesaria; 4) llevar a cabo las
mediciones necesarias; y 5) presentación de datos.
2.1
Definición del problema:
El analista debe realizarse las siguientes preguntas: ¿qué información se necesita?, ¿qué
sensibilidad debe tener el método?, ¿qué exactitud y precisión son necesarias?, ¿qué
interferencias puede encontrar y cuales son las separaciones que se necesitan?, ¿cuántas
muestras hay que analizar?, ¿en qué tiempo hay que dar un resultado?, ¿cuántas muestras hay
que analizar?, ¿de qué equipo se dispone?, ¿cuál será el costo?
Para un análisis en particular, pueden existir uno o más procedimientos, por lo cual se
decidirá cual utilizar teniendo en cuenta la disponibilidad de reactivos químicos y equipos en el
laboratorio, la experiencia del analista y la vigencia del método a desarrollar.
2.2
Obtención y disolución de la muestra:
Hay que tomar varias precauciones en el momento de manejar y guardar muestras, con
el objeto de evitar o minimizar la contaminación, pérdidas y descomposición. En general, es
necesario evitar contaminación y alteración de la muestra por el recipiente, la atmósfera o la luz.
Hay que considerar la estabilidad de las muestras, siendo necesario en algunos casos
agregar sustancias que preservan el analito a investigar pero que no interfieran en el análisis.
Las proteínas y las enzimas tienden a desnaturalizarse al reposar, por lo que deberán analizarse
sin pérdida de tiempo. Las trazas de los constituyentes pueden perderse durante el
almacenamiento, por adsorción en las paredes del recipiente.
En algunos casos para preservar la muestra es necesario regular el pH de la muestra a
analizar y la temperatura de conservación de la misma.
Si la muestra es sólida, generalmente se deberá disolver antes de efectuar el análisis. En
ocasiones, los fluidos biológicos pueden analizarse directamente. No obstante, a menudo las
proteínas interfieren y deben eliminarse. Esto se logra mediante técnicas de destrucción, como
son la calcinación o la digestión ácida.
Generalmente la muestra disuelta debe someterse a un tratamiento preliminar para
separar a dicha sustancia de los constituyentes que interfieren, y para transformarla para su
medición.
2.3
Separación:
Existen varias técnicas de separación para eliminar interferencias y lograr la
selectividad deseada. Casi todas las propiedades químicas y físicas permiten aplicar mecanismos
1
de separación, por ejemplo, reacciones de precipitación, solubilidad, volatilidad, congelamiento,
y así sucesivamente. Generalmente, las proteínas pueden eliminarse por precipitación y
posterior filtración de la muestra, con el fin de eliminar interferencias.
2.4
Mediciones de la muestra:
Generalmente se debe saber la cantidad de muestra que se toma para analizar. Esto se
logra pesándola o determinando su volumen, dependiendo si se quiere determinar la cantidad de
sustancia en unidad de peso o de volumen.
Las muestras sólidas suelen contener una cantidad variable de agua adsorbida que será
necesario remover o medir antes de pesar. Por lo general, se elimina secando la muestra en
estufa, siempre y cuando, esta no se descomponga a una temperatura mayor que el punto de
ebullición del agua.
El método que se emplee para medir cuantitativamente la sustancia que se va a analizar,
dependerá de diversos factores, y uno de los más importantes es la cantidad de sustancia
presente y la exactitud necesaria. Muchas de las técnicas disponibles tienen diversos grados de
selectividad, sensibilidad, exactitud, precisión y rapidez.
2.5
Procedimiento de datos:
Existen diversas maneras de expresar la cantidad o concentración de sustancia que se va
a utilizar. En química analítica es necesario que existan buenos registros de laboratorio.
Se calcula la media de los resultados y se expresa con un intervalo de confianza
adecuado.
3. Clasificación de los métodos analíticos
La clasificación de los métodos analíticos pueden realizarse de dos maneras diferentes,
según el tipo de análisis a realizar a la muestra en cuantitativa o cualitativa o según el tamaño de
las muestras, en macro, semimicro, o ultramicro (ver Tabla 1).
Método Masa de la muestra Volumen de la muestra
Macro
>100 mg
>100 l
Semimicro
10-100 mg
50-100 l
Micro
1-10 mg
<50 l
Ultramicro
<1 mg
Tabla 1: Clasificación de lo métodos de análisis según el tamaño de la muestra
Los constituyentes de la muestra se pueden clasificar como principales (más de 1%),
secundarios (0.1%-1%) o trazas (menor del 0.1%). Cuando hay algunas partes por millón de
determinado constituyente, pueden denominarse ultratrazas.
Un análisis podrá ser completo o parcial, es decir, podrán analizarse todos los
constituyentes o tan sólo algunos. A menudo se pide al analista que reporte la concentración de
determinado producto o productos químicos.
4. Errores en el análisis Químico
4.1 Introducción estadística
Es imposible realizar un análisis químico sin que los resultados estén totalmente libres
de errores o de incertidumbres. Sin embargo, se espera poder minimizar estos errores y estimar
su magnitud con una exactitud apreciable.
La incertidumbre en las mediciones no puede eliminarse por completo, de tal forma que
siempre se desconoce el verdadero valor para una cantidad determinada. No obstante, con
frecuencia se puede evaluar la magnitud del error en la medición, y así, dentro de un cierto nivel
de probabilidad, es posible definir los límites entre los cuales está el verdadero valor de una
cantidad determinada.
2
No es fácil estimar la precisión y la exactitud de los datos experimentales; pero se deben
hacer estos estimados siempre que se obtengan resultados en el laboratorio, ya que los datos
cuya precisión y exactitud se desconocen son inútiles.
4.1.1
Exactitud
El término exactitud indica qué tan cercana está la medición de su valor verdadero o
aceptado, y se expresa en términos de error. Está relacionada al valor central de una serie de
mediciones, el cual se determina mediante la Media o la Mediana:
 La media, la media aritmética y el promedio son sinónimos para el valor que se
obtiene de dividir la suma de mediciones repetidas entre el número de mediciones en la serie;
X 
N
x
i 1 i
N
Ec.1
Donde xi representa los valores individuales de x que integran una serie de N
mediciones repetidas.
 La mediana es el valor del cual se distribuyen los demás datos por igual. La mitad
de los datos son más pequeños que la mediana y la otra mitad son mayores. La mediana de una
serie, que tiene número impar de resultados se obtiene ordenando los resultados de manera
creciente o decreciente y tomando el valor central. Para un número par de resultados, se toma el
promedio del par central.
Existe una diferencia fundamental entre los términos de exactitud y precisión, ya que
exactitud mide la concordancia entre un resultado y su valor verdadero; y la precisión mide la
concordancia entre varios resultados que se han medido de la misma manera. La precisión se
determina sólo repitiendo una medición, en tanto que la exactitud nunca puede determinarse
exactamente ya que nunca puede conocerse el verdadero valor de una cantidad; así en su lugar
se debe usar un valor aceptado. Debido a lo anterior, la exactitud se expresa en términos de
error absoluto o error relativo.
 Error absoluto E en la medición de una cantidad xi está dado por la siguiente
ecuación:
E  xi  x
Ec. 2
donde xt es el valor verdadero o aceptado de la cantidad. Errores con signo negativo
indican que el valor experimental es menor que el valor aceptado, y a la inversa para valores
positivos.
 Error relativo (Er), con frecuencia es una cantidad más útil que el error absoluto El
porcentaje de error relativo está dado por la expresión:
Er 
4.1.2
xi  xt
 100
xt
Ec. 3
Precisión
El término precisión describe la reproducibilidad de las mediciones, es decir, que tan
cercanos están entre sí los resultados que se han obtenido exactamente. Para describir la
precisión de una serie de datos repetidos se utilizan: la desviación estándar, la varianza y el
coeficiente de variación. Estos términos son una función de al desviación de los datos respecto
de la media.
3
4.2 Tipos de errores en los datos experimentales
4.2.1 Errores aleatorios
Los errores aleatorios o indeterminados se manifiestan cuando un sistema de medición
se utiliza a su máxima sensibilidad. Este tipo de error se debe a las numerosas variables no
controladas que son parte inevitable de toda medición física o química. Muchos factores
contribuyen al error aleatorio, pero ninguno puede identificarse o medirse con certeza ya que
individualmente son tan pequeños que no pueden detectarse. No obstante, el efecto acumulativo
de cada una de las incertidumbres ocasiona que los datos de una serie de mediciones repetidas
fluctúen al azar alrededor de la media.
Empíricamente se ha encontrado que la distribución de los datos repetidos en la mayoría
de los análisis cuantitativos se aproxima a una curva gaussiana.
Las variaciones en los resultados de las mediciones repetidas se deben a numerosos
errores aleatorios que individualmente no son detectables, y que se atribuyen a variables que no
se pueden controlar en el experimento. Estos pequeños errores por lo general se cancelan uno a
otro, por lo que su efecto es mínimo, pero hay ocasiones en que se dan en la misma dirección y
producen un gran error neto negativo o positivo.
Comúnmente el análisis estadístico de los datos analíticos se fundamenta en la
suposición de que los errores aleatorios siguen una distribución normal o gaussiana. Algunas
veces, los datos se apartan significativamente de este comportamiento, pero no es frecuente, por
lo que nos basaremos en errores que siguen una distribución normal. Hay dos términos
importantes que debemos diferenciar: Muestra de datos, que es un número finito de
observaciones experimentales y Población o universo de datos, que es el número infinito de
observaciones.
Las propiedades de la curva gaussiana son:
 La media de la población  y la media de la muestra X : la media de la muestra es
el valor promedio de una muestra limitada obtenida de una población de datos, y se define por la
[Ec. 1], cuando N es un número pequeño. La media de la población es el verdadero valor
promedio de la población, y se define con la [Ec. 1], con la salvedad de que N es tan grande que
tiende a infinito. Cuando no hay error sistemático, la media de la población también es el
verdadero valor de la cantidad medida. La diferencia entre  y X disminuye al aumentar el
número de mediciones que conforman la muestra, y por lo general esta diferencia es
despreciable cuando N tiende a 20 o 30.
 Desviación estándar de la población σ y Desviación estándar de la muestra S: La
desviación estándar de la población σ, es una medida de la precisión de una población de datos y
esta dada por la ecuación


N
i 1
( xi   ) 2
N
Ec. 4
N es el número de datos que se repiten y que constituye la población.
Otro tipo de curva normal de error, donde la abscisa es la variable z, se define como:
z
(x  )

Ec. 5
z es la desviación con respecto a la media expresada en unidades de desviación
estándar, esto es cuando x - σ, z es igual a una desviación estándar; cuando x - σ, z es
igual a dos desviaciones estándar y así sucesivamente.
Para un número pequeño de datos, la desviación estándar de la muestra S está dada por
la siguiente ecuación:
S

N
i 1
( xi  x) 2
N 1
4
Ec. 6
Difiere de la [Ec. 4] en que en el numerador aparece la media de la muestra y no la
media de la población y que N se sustituye por el número de grados de libertad (N-1). La
incertidumbre en el valor obtenido para S disminuye al aumentar N, así cuando N sea mayor de
20, S y σ son prácticamente iguales.
Para obtener un estimado ponderado de la desviación estándar, Sponderada, las
desviaciones de la media para cada subserie se elevan al cuadrado; se suman los cuadrados de
cada subseries y se dividen entre el número correspondiente de grados de libertad. Finalmente la
Sponderada se obtiene a partir de la raíz cuadrada del cociente. Se pierde un grado de libertad por
cada subserie, por lo que el número de grados de libertad para la Sponderada es igual al número
total de mediciones menos el número de subseries.
 Otras formas de expresar precisión son: Varianza, Desviación Estándar Relativa,
Coeficiente de variación y Rango
Varianza S2: es el cuadrado de la desviación estándar.
S
2


N
i 1
( xi  x) 2
N 1
Ec. 7
Obsérvese que la desviación estándar tiene las mismas unidades que los datos, mientras
que la varianza tiene las unidades de los datos al cuadrado. Los científicos tienden a usar la
desviación estándar en lugar de la varianza como medida de precisión, porque es más fácil
interpretar los resultados cuando tienen las mismas unidades.
Desviación estándar relativa DER y coeficiente de variación CV%: DER se calcula
dividiendo la desviación estándar entre la media de la serie de datos y a menudo se expresa
como partes por mil (ppmil) o en porcentaje multiplicando este cociente por 1000 ppmil o por
100 %, respectivamente. Así, por ejemplo,
DER 
s
 1000 ppmil
x
Ec.8
A la DER multiplicada por 100 % se la conoce como coeficiente de variación (CV%)
CV % 
s
 100%
x
Ec. 9
Dispersión o rango W: se utiliza para describir la precisión de una serie de resultados
repetidos, y es la diferencia entre los valores más altos y más bajos de la serie. Esta forma de
expresión de la precisión es utilizada cuando la mediana es el valor central de la población.
 Intervalo de confianza cuando S es una buena aproximación de σRearreglando la
[Ec. 5] se encuentra una expresión general para los límites de confianza IC de una sola medición
( z puede tener valores positivos o negativos) por lo que
IC para   x  z
Ec.10
Para obtener la media de N mediciones, en lugar de σ se utiliza el error estándar de la
media, σ/ √N, es decir
IC para   x 
z
N
Ec.11
 Intervalo de confianza cuando no se conoce σ
La S calculada a partir de una pequeña cantidad de datos puede ser incierta, razón por la
cual los límites de confianza son más amplios cuando no se tiene un buen estimado de σ.
Para justificar la variabilidad de S utilizamos un parámetro estadístico importante, el
valor de t, que se define como
5
t
x
S
Ec.12
t depende del nivel de confianza deseado; pero también del número de grados de
libertad con que se calculó S. Cuando el número de grados de libertad se hace infinito t→ z.
Los límites de confianza para el promedio X de N mediciones repetidas pueden
obtenerse a partir de t por la siguiente ecuación:
IC para   x 
zs
N
Ec.13
4.2.2 Errores sistemáticos
Los métodos sistemáticos o determinados tienen un valor definido, se les atribuye una
causa y tienen la misma magnitud en las mediciones repetidas efectuadas de la misma manera.
Existen generalmente, tres tipos de errores sistemáticos:
 Errores de instrumento, que se originan por ejemplo, por imperfecciones de los
aparatos para medir; oscilaciones en el suministro de energía; pipetas o matraces que entregan o
retienen volúmenes distintos a lo que indica la graduación; entre otras.
 Errores del método, debido al comportamiento físico o químico no ideal de los
sistemas analíticos.
 Errores personales, que resultan de la falta de cuidado, distracción o poca destreza
del analista.
 Impurezas de reactivos, que suele ser proporcional al tamaño de la muestra.
Los efectos que pueden ocasionar los errores sistemáticos en un resultado analítico, son
constantes o proporcionales. La magnitud de un error constante absoluto no depende de la
magnitud de la cantidad medida, en tanto que los errores proporcionales absolutos aumentan o
disminuyen en proporción con el tamaño de la muestra que se analiza.
4.2.3 Errores gruesos
Cuando una serie de datos contiene un resultado discordante que es muy diferente al
promedio, se debe decidir aceptarlo o rechazarlo. Para ello se evalúa con la prueba Q:
La prueba Q
En esta prueba el valor absoluto de la diferencia d se divide entre el resultado dudoso x d
y el resultado vecino más próximo xn, entre la dispersión w de la serie completa para dar la
cantidad Qexp:
Qexp 
x d  xn
d

w
x1  xn
Ec.14
Esta relación se compara luego con los valores de rechazo Qcrit de tabla. Si el Qexp es
mayor que el Qcrit, el resultado dudoso puede descartarse con el correspondiente grado de
confianza.
6
4.3 Pruebas de significancia
Al desarrollar un nuevo método analítico a menudo conviene comparar los resultados de
dicho método con otros obtenidos con un método aceptado (probablemente alguna norma). Se
realiza mediante la prueba F para comparación de desviaciones estándares de ambas
poblaciones, y a partir de este resultado se realiza la comparación de las medias muestrales
mediante la prueba t de Student:
Prueba F
Es una prueba diseñada para indicar si existe diferencia significativa entre dos métodos,
basándose en sus desviaciones estándar. F se define en términos de la varianza de los dos
métodos, en donde la varianza es el cuadrado de las desviaciones estándar.
F
s12
s22
Ec.15
en donde s12 > s22. Existen dos distintos grados de libertad, v1 y v2, y estos grados de
libertad se definen como N – 1, el numero de mediciones menos uno.
Cuando el valor calculado para F mediante la Ec. 15, excede el valor tabulado para F en
el nivel de confianza elegido, existe una diferencia significativa entre los dos métodos.
Prueba t de Student
En este método se realiza la comparación entre dos conjuntos de replicas de mediciones
efectuadas por dos métodos distintos, uno de ellos será el método de prueba y el otro el método
aceptado. Se calcula un valor estadístico t según las desviaciones de las muestras sean iguales o
diferentes:
 Para muestras que poseen desviación estándar sin diferencia significativa:
x
Donde, s 2 

 x2
1
1
s

n1 n2
t
n1 1s12  n2 1s22
n1  n2  2
1
 Para muestras que poseen desviación estándar estadísticamente diferentes:
t
Con grados de libertad =
x
1
 x2

s12 s22

n1 n2
 s12 s22 
  
 n1 n2 
2


s4
s4
 2 1

 2 2
 n1 (n1  1) n2 (n2  1) 
El valor calculado de t se compara con un valor tabulado para el número de pruebas que
se han evaluado, al nivel de confianza que se desee. Cuando el valor calculado para t excede el
valor tabulado, existe una diferencia significativa entre los dos métodos en ese nivel de
confianza. Cuando no excede el valor tabulado, puede predecirse que no existe diferencia
7
significativa entre ambos métodos. Esto no implica de ninguna manera que los resultados sean
idénticos.
Por lo general la prueba a un nivel de confianza de 95 % se considera significativa y la
prueba para un nivel de 99 % es altamente significativa.
4.4 Métodos para presentar los datos analíticos
Para la correcta expresión de un resultado se debe proceder de la siguiente manera:
 Ajustar el número de cifras significativas de cada una de las réplicas de datos
obtenidas, siguiendo los siguientes puntos:
1) Identificar la ecuación que dio origen al resultado de cada réplica.
2) Obtener las incertidumbres absolutas (Ia) de los datos que intervienen en el cálculo.
Estas Ia se obtienen de tablas, solo hay dos casos especiales que son la bureta y la masa, estas se
evalúan con la siguiente ecuación: Ia 
I
a1
2  I a 2 2  .
3) Calcular las incertidumbres relativas de los datos, como: Ir = Ia/valor obtenido.
4) Calcular la incertidumbre relativa del resultado.
5) Calcular la incertidumbre absoluta del resultado.
6) Ajustar el número de cifras significativas de cada réplica al nivel de incertidumbre
calculado siguiendo las reglas de redondeo. Estas consisten en que si el número es mayor que 5
se aumenta una unidad al último digito; si es menor que 5 se lo conserva y si es igual a 5 se
observa el valor a continuación, si este es par se mantiene el valor del último digito y si es impar
se aumenta una unidad.
 Ordenar la serie de datos ajustados y aplicar test Q para rechazo de datos dudosos.
 Calcular los estadísticos x y S.
 Buscar en tabla el valor de t0.95n-1.
 Calcular el intervalo de confianza: IC 
ts
n
 Si es necesario ajustar nuevamente el Número de cifras significativas del promedio
al nivel de incertidumbre del Intervalo de Confianza.
 Expresar el Resultado como: x 
ts
 x  IC
n
4.5 Trazabilidad
Es una palabra clave en química analítica que esta relacionada con tres predefiniciones:
 Ciencia de las medidas bioquímicas;
 Ciencia metrológica bioquímica;
 Ciencia de las mediciones bioquímicas.
La trazabilidad es un concepto abstracto, equivale a conceptos genéricos tales como
honestidad en el ámbito social y rentabilidad en lo económico.
El significado mas genérico de trazabilidad es su faceta de rastreo, seguimiento. Esta
faceta se concreta en la historia de la producción del resultado o del funcionamiento de un
sistema.
Bibliografía
-Skoog Douglas A., West Donald., Holler F. James. Química Analítica. Sexta Edición
México. Editorial: Mc Graw-Hill. Año: 2004.
-Gary D Christian. Química Analítica segunda edición. Editorial Limusa México.
-James N Miller- Jane C Miller. Estadística y Quimiometría para Química Analítica.
Cuarta Edición. Editorial: Prentice Hall, Madrid, 2002.
Realizado por:
Bioq. S. Vanesa Kergaravat
Lic. Julio Macagno
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