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9.- FIJACION DEL CO2. Introducción. Descubrimiento
del ciclo. Ciclo de Calvin. Fases carboxilativa,
reductiva y regeneradora. Regulación del ciclo de
Calvin. Rutas metabólicas a partir del ciclo de Calvin.
Intercambio de sustancias entre cloroplasto y
citoplasma.
OBJETIVOS:
 Conocer el funcionamiento del ciclo fotosintético de reducción y
asimilación del CO2.
 Entender las rutas metabólicas que siguen los productos
foosínteticos.
 Razonar los procesos de regulación que permiten el correcto
funcionamiento del ciclo.
INTRODUCCION
La asimilación del CO2 tiene lugar en la denominada fase oscura
de la fotosíntesis. Es afótica indirectamente, no necesita luz para su
desarrollo pero si los intermediarios obtenidos en la fase luminosa,
poder asimilatorio, que son el ATP y poder reductor en forma de
NADPH.
Los procesos implicados en la asimilación tienen lugar en el estroma
de los cloroplastos, mientras que la fase luminosa ocurre en la
membrana de los tilacoides.
El proceso global de conversión del CO2 en carbohidratos fue
descubierto por Calvin y Benson en 1949 y se le conoce como ciclo de
Calvin.
DESCUBRIMIENTO Y METODOLOGÍA DEL CICLO
DE CALVIN
El mecanismo más frecuente para la fijación del CO2 fue
identificado por una serie de experimentos de Calvin, Benson y
Bassham en 1949, que llevaron al descubrimiento de los distintos
pasos del proceso global de conversión de CO2 en carbohidratos.
En 1949 se logró disponer de CO2 marcado radiactivamente con el
isótopo de 14C. Aquellos intermediarios que llevaban este isótopo
después de exponer la maquinaria fotosintética al 14CO2 se podían
detectar sensiblemente por su radiactividad. Se desarrolló también la
técnica de cromatografía en papel para separar los distintos
intermediarios, identificándolos por su migración comparándolos con
otros compuestos patrones en cromatografías paralelas. Al revelar
estas cromatografías en papel fotográfico sensible, se podía detectar
la radiación beta emitida por el 14C.
Cuando la exposición del material era muy breve, sólo aparecen
marcados radiactivamente los primeros intermediarios. A tiempos de
exposición más prolongados se marcan (Fig.1. Fig. 11-2) los sucesivos
intermediarios.
Calvin y colaboradores, usaron cromatografía bidimensional en papel
para separar los intermediarios. Realizaron los experimentos con el
alga Chlorella y a distintos tiempos de exposición al 14CO2. Tomaban
fracciones del cultivo líquido de Chlorella y las añadían a etanol al 80
por 100, hirviendo, con lo cual rápidamente mataban las células y
paraban el proceso fotosintético. Extraían los metabolitos
intermediarios y sometían el extracto a cromatografía. Al cabo de un
minuto de exposición, un gran número de productos se marcaban y
cuando la exposición era de sólo dos segundos, la mayor parte del
marcaje radiactivo aparecía sólo en el ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA).
Este era el primer compuesto que resultaba de la incorporación del 14C
del 14CO2 en la materia orgánica.
Para conocer el precursor del 3-PGA sometieron el experimento
a ausencia de CO2 y se vio que en estas condiciones disminuía el
marcaje de 3-PGA pero aumentaba el de ribulosa-1,5-difosfato (RuDP)
lo cual era debido a que ésta no se podia transformar en 3-PGA al
faltar CO2. Sin embargo, si en lugar de suprimir el CO2, se sometía a
periodos de oscuridad (Fig.2. Fig.-10.4) ocurría lo contrario, desaparecía
RuBP y aumentaba 3-PGA. Como conclusión sacaron que era un
proceso cíclico, donde una molécula de CO2 se combinaba con una de
5 átomos de carbono par dar 2 moléculas de 3 átomos de carbono, el
3-PGA. Al prolongar el experimento en el tiempo, la mancha de
radiactividad de 3-PGA se hacía cada vez mayor, esto también
implicaba que el proceso era cíclico ya que cada vez había más
carbonos marcados.
Fig. 1. Consecuencias de las cromatografías en tiempos de Calvin
Fig. 2. Variación en las concentraciones de 3-PGA y de la RuBP en una suspensión de algas
unicelulares al apagar y encender la luz.
FUNCIONAMIENTO DEL CICLO DE CALVIN.
El ciclo de calvin básicamente se divide (Esquema 1) en tres
etapas:
 Fase de carboxilacion: unión del CO2 a la RuDP.
 Fase de reducción.
 Fase de reorganización o regeneración de la RuDP.
La fijación del CO2 se produce en tres fases:
1.Carboxilativa: El CO2 se fija a una molécula de 5C, la
ribulosa 1,5 difosfato, formándose un compuesto inestable
de 6C, que se divide en dos moléculas de ácido 3
fosfoglicérico conocido también con las siglas de PGA
2.Reductiva:El ácido 3 fosfoglicérico se reduce a
gliceraldehido 3 fosfato, también conocido como PGAL
,utilizándose ATP Y NADPH.
3.Regenerativa/Sintética: Las moléculas de gliceraldehido 3
fosfato formadas siguen diversas rutas; de cada seis
moléculas, cinco se utilizan para regenerar la ribulosa 1,5
difosfato y hacer que el ciclo de calvin pueda seguir, y una
será empleada para poder sintetizar moléculas de glucosa (vía
de las hexosas), ácidos grasos, amoinoácidos... etc; y en
general todas las moléculas que necesita la célula.
Esquema 1. Resumen de las fases de fijación
Fase de carboxilacíon
Se produce la incorporación del CO2 a la RuDP. Este proceso
esta
regulado
por
un
enzima,
la
ribulosa-1,5-bifosfato
carboxilasa/oxigenasa (rubisco). Este enzima (Fig. 3) tiene un centro
activo por el que compiten el O2 y el CO2. Esta fase será carboxilasa
preferentemente.
RUBISCO
Fig. 3. Papel oxidativo y carboxilativo de RUBISCO
El CO2, catalizado por la rubisco, se incorpora a la RuDP de 5 átomos
de carbono generando una molécula de 6 átomos de carbono. Esta
molécula a través de un proceso específico da lugar a una molécula
hidratada que se hidroliza dando un fosfoglicerato (de 3 átomos de
carbono) y una molécula intermedia que por proteolización da lugar a
otro fosfoglicerato.
Fase de reducción.
Es igual que la glucolisis pero en sentido inverso. Hay una
adición de fosfato por una quinasa para pasar el 3-fosfoglicerato a 1,3bifosfoglicerato. Este paso tiene un gasto de energía de 1 ATP. El 1,3bifosfoglicerato se reduce a gliceraldehido-3-fosfato (GAP) catalizado
por una deshidrogenasa y consumiendo poder reductor en forma de
NADPH. De cada 6 moléculas de GAP, una es derivada a la síntesis
de carbohidratos y 5 participan en regeneración de RuDP.
Fase de reorganización o regeneración.
La finalidad de esta etapa (Fig.4) es volver a generar la RuDP.
De GAP se genera de nuevo el aceptor disponible para la próxima
fijación de CO2.
Fig.4. Fases del ciclo de Calvin y gasto de poder asimilatorio.
Fig. 5. Balance del ciclo.
REGULACIÓN DEL CICLO.
Durante la noche, el ATP y NADPH disminuyen pero no hasta
valores despreciables, ya que al llegar el día sería un gran gasto de
energía volver a iniciar el proceso. Siempre hay un nivel mínimo de
ATP Y NADPH en la oscuridad, que se producen por otros
mecanismos. Así pues, debe haber procesos de regulación
específicos.
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD RUBISCO.
Está formada (Fig. 6) por 8 subunidades grandes y 8 pequeñas.
Éstas están reguladas por el genoma nuclear y cloroplástico.
Fig. 6. Organización de Rubisco
La cantidad de luz afecta vía fitocromo a la expresión de los genes del
cloroplasto que codifican a las subunidades grandes, que son las que
tienen los centros activos. El genoma nuclear regula a las pequeñas.
El ensamblaje de las subunidades y la expresión de los mensajeros
están regulados por luz incidente sobre el genoma nuclear o
cloroplástico.
La actividad de la rubisco está controlada por luz debido, entre
otros motivos, a que el enzima necesita un pH óptimo ligeramente
alcalino y requiere Mg2+. El enzima se encuentra en el estroma y es
allí donde se produce una subida del pH, que activa a la RuDP
carboxilasa, producida por el transporte electrónico fotosintético
activado por la luz. Este transporte determina la entrada de protones al
interior de los tilacoides y va acompañado de una salida de Mg2+.
Para que la rubisco sea activa (Fig.7) debe sufrir una
carbamilación, tiene que tener carbamilado un residuo de lisina del
centro activo del enzima. La carbamilación está catalizada por una
activasa que requiere ATP y CO2. La carbamilación, para que se dé,
necesita elevadas concentraciones de CO2 y Mg2+ así como un pH
elevado, condiciones que se producen, precisamente, en presencia de
luz.
Fig.7. Regulación de Rubisco
REGULACIÓN DE OTROS ENZIMAS
La regulación de los enzimas que catalizan las reacciones
unidireccionales está asociada a la existencia de grupos tiol en este
tipo de enzimas. Esta activación se basa en la reducción a grupos –
SH los puentes disulfuro de los enzimas a activar (Fig. 8). Los
electrones necesarios proceden de una cadena de transporte, estos
electrones son excitados por la luz y proceden en último caso del
agua. La luz hace funcionar el transporte de electrones, la ferredoxina
se reduce, ésta mediante ferredoxina-tiorredoxina reductasa reduce a
la tiorredoxina y ésta a grupos –SH los puentes disulfuro del enzima.
Así, el enzima
reducido será
activado. La
forma oxidada
será inactiva.
Fig. 8. Regulación
de
enzimas
asociadas
RUTAS METABÓLICAS A PARTIR DEL CICLO DE
CALVIN.
En la Fig.9. Fig.10.14 se observan todas las salidas del
metabolismo fotosintético del carbono, asociadas todas al ciclo de
calvin. El transporte de electrones en los tilacoides proporciona ATP y
NADPH al ciclo de calvin o al mecanismo de fijación del CO2 en la
fotosíntesis de las C4. También proporciona reducción, vía tiorredoxin,
para la activación por luz de enzimas. Las triosas-P generadas en el
ciclo de calvin pueden ser utilizadas para la síntesis de productos,
como almidón en los cloroplastos o sacarosa en el citoplasma, esto
genera fosfato inorgánico, el cual es devuelto al cloroplasto para ser
usado en la fotofosforilación. El carbono es usado también para la
respiración mitocondrial o biosíntesis de ácidos grasos, aminoácidos,
lípidos… vía PEPcarboxilasa. La RuBP puede tener actividad
oxigenasa, produciendose así la fotorrespiración.
Fig.9. Integración del metabolismo fotosintético del carbono en hojas
SÍNTESIS DE SACAROSA Y ALMIDÓN.
Las triosas fosfato que se forman en el ciclo siguen distintas
vías, o bien la síntesis de sacarosa o bien la síntesis de almidón. Estas
dos vías ocurren en lugares distintos, la síntesis de sacarosa tiene
lugar en el citoplasma de la célula mientras que la síntesis de almidón
ocurre en el estroma del cloroplasto. La síntesis de ambos (Fig.10) es
similar, solo difieren en los dos últimos pasos.
Fig.10. Síntesis de sacarosa y almidón
SÍNTESIS DE SACAROSA.
La síntesis de sacarosa tiene lugar en el citoplasma de la célula,
por lo que la triosa fosfato es transportada al citoplasma a través de un
transportador de membrana interno denominado translocador de
fosfato. Su funcionamiento viene descrito en el apartado “Intercambio
de sustancias entre cloroplasto y citoplasma” que se expondrá a
continuación.
La sacarosa sirve para mantener energéticamente los procesos
metabólicos y además va a ser el vehículo de transporte de carbono
para tejidos o células no fotosintetizantes.
El transporte de triosas fosfato va a ser simultáneo con un
antitransporte de grupos fosfato. La presencia de grupos fosfato por
encima de concentraciones óptimas, tanto en el estroma como en el
citoplasma va a ser inhibidor de la biosíntesis de productos finales.
SÍNTESIS DE ALMIDÓN.
El exceso de triosas fosfato que no se utilizan en la síntesis de
sacarosa se convierten en almidón, que actúa como sustancia de
reserva. Esta síntesis y posterior almacenamiento tiene lugar en el
estroma del cloroplasto, donde se acumula durante el día para ser
movilizado y exportado por la noche. Así, el aporte de carbono
reducido al resto de la planta, se produce tanto de día como de noche.
En muchas plantas los polisacáridos de reserva se acumulan en
forma de fructanos y no de almidón. Estos fructanos resultan de
adiciones de residuos de fructosa a una molécula de sacarosa. Parece
ser que están asociadas a plantas que necesitan una resistencia al
frío.
INTERCAMBIO
DE
SUSTANCIAS
CLOROPLASTO Y CITOPLASMA
ENTRE
En el cloroplasto se encuentra transportadores de triosas que
permiten la intercomunicación entre el cloroplasto y el citoplasma. En
el estroma cloroplástico, se liberan triosas fosfato durante la
fotosíntesis, que son transportadas al citoplasma para la síntesis de
sacarosa mediante el translocador fosfato (Fig. 11). La síntesis de
sacarosa produce un fosfato inorgánico que es intercambiado con el
cloroplasto por una triosa fosfato destinada a la síntesis de sacarosa.
Ese fosfato puede ser usado en la fotofosforilación.
Fig. 11. Funcionamiento del traslocador de fosfato de los cloroplastos
Todo lo descrito hasta ahora corresponde a plantas C3, ya que por
la fijación del CO2 en el ciclo de calvin se obtienen moléculas de tres
átomos de carbono.
BALANCE GLOBAL DEL CICLO
El balance global del ciclo hasta hexosas-fosfato nos da la
reacción global:
6CO2 + 6H2O + 18ATP + 12NADPH
hexosa-P + 12 H+ + 18 ADP + 17 Pi + 12 NADP+
 El coste de fijar 1 CO2 =3 ATP + 2NADPH.
 Se gastan 2 ATP y 2 NADPH en la fase de reducción
por cada molécula de CO2 fijado y 1ATP más en el
último paso de la fase de regeneración para de
RuDP.
Jorge de la Rosa de Saa (2005-06)