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Biología 135a laboratorio. Resumen para segundo parcial Ricardo Malta Grupo 1.2a Enzimas En el interior de las células procariotas y eucariotas existe un gran número de sustancias especificas de naturaleza proteica, macromoléculas de origen biológico con funciones biocatalizadores llamadas enzimas. Estas aceleran reacciones disminuyendo la energía de activación necesaria para que se lleven a cabo. Estas enzimas trabajan con un substrato especifico, pero pueden ser inhibidas por sustancias que compiten con el sustrato o sustancias que hacen que la enzima pierda su funcionalidad. La catalasa es una hemoproteina enzimaticamente activa, es decir, contiene un protohemo como grupo prostético parecido a la hemoglobina. Se encuentra en grandes cantidades en las células hepáticas. Esta enzima previene la acumulación de peróxidos tóxicos que pudieran formarse durante la respiración celular. La reacción general de esta enzima es: 2H 2O2 2H 2 O O2 En esta reacción el donador de electrones es la segunda molécula de peróxido de hidrógeno. Para la experiencia se preparó 20 gramos de hígado que fue macerado (machacado). Se le agrego 20 ml de agua destilada, se filtro y se preparo dos soluciones: un homogeneizado concentrado y uno diluido. El concentrado es el que se obtiene directamente de la solución y el diluido es otro al cual se le agregan 15 ml mas de agua destilada. Verificación de la liberación de oxígeno en la reacción del peróxido de hidrógeno con la catalasa Unas cuantas gotas de homogeneizado concentrado se hace reaccionar con 5 ml de peróxido de hidrógeno en un tubo de ensayo, luego se acerca un palillo de madera ardiente, sin llama, a la boca del tubo de ensayo. Se aprecia que este vuelve a encender. Esto se debe a que la reacción de la catalasa y el peróxido de hidrógeno libera oxígeno y este promueve la combustión del palillo. Estudio de la cantidad de calor liberado durante la reacción de la enzima con el substrato. En un tubo de ensayo se coloca 10cc de solución de H2O2 3% y un termómetro. Se lee la temperatura inicial y se toma como temperatura de referencia. Luego, se agrega 1 ml de solución enzimática y se lee las variaciones de temperatura cada 30 segundos durante 5 minútos. Los resultados entregaron la siguiente gráfica Concentración Tiempo La temperatura sube hasta llegar a los 41º C. Luego desciende. Esto sucede por que cuando se satura la cantidad de enzimas, la liberación de calor es constante. Cuando la totalidad del substrato es completamente catalizado, la temperatura desciende. La reacción de descomposición del peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, mediado por la catalasa, es un procedo exotérmico. Efecto de la concentración de la enzima en la velocidad de la reacción Si en un determinado volumen de una mezcla de reacción se mantienen constantes el pH, la temperatura y la concentración del sustrato, y se dobla la cantidad de enzima, se aumenta también la cantidad de producto de la reacción. La velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima. Para esto se necesita que la concentración del substrato sea suficientemente elevada, de modo que la totalidad de las enzimas interactúen. Para comprobar esto se colocan uno, dos, tres y cuatro discos de papel filtro con homogeneizado concentrado en cuatro botellas de reacción, de modo que aumente la concentración de enzimas en cada botella. A estas se le agregan 10 ml de peróxido de hidrógeno y se mide la cantidad de oxígeno liberado. Los resultados nos indicaron que al aumentar la concentración catalasa aumentaba la cantidad de oxigeno liberado. El gráfico donde se presentan cada una de las cuatro reacciones, desplazamiento en función del tiempo, es el siguiente Desplazamiento de O2 tiempo El gráfico de velocidad con respecto a la concentración se calculó con la pendiente de cada recta de desplazamiento en función del tiempo, y se graficó en función de la concentración de enzima. Velocidad Concentración Se concluye que la velocidad de reacción de la enzima es proporcional a la concentración de esta misma. A mayor concentración de enzima, mayor velocidad de reacción Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática El aumento de temperatura influye de distinta manera sobre la actividad y la velocidad enzimatica. 1. 2. 3. 4. En la estabilidad de la enzima En la velocidad de escisión del complejo Enzima-Substrato En la afinidad de la enzima por su substrato En la afinidad entre la enzima y sus inhibidores y activadores En los casos 2, 3 y 4, al aumentar la temperatura, se observa un aumento en la velocidad de la reacción. En cambio, en el primer caso, al verse afectada la estabilidad de la enzima se puede producir una disminución de la velocidad de reacción de esta. Para todas las enzimas existe una temperatura óptima en la cual desarrollan su máxima acción. Por debajo de esta temperatura la enzima es más estable y puede actuar por mas tiempo, pero al velocidad de reacción que esta ejerce es menor. Por encima de la temperatura óptima, la velocidad de reacción aumenta, pero la enzima puede ser rápidamente inactivada debido a que se desnaturaliza a mucha temperatura. Para el estudio de este efecto se midió la velocidad de la reacción de la catalasa a diversas temperaturas, 8ºC, 37ºC y 60ºC. El gráfico que representa los resultados es el siguiente: Temperatura óptima velocidad 8ºC 37ºC 60ºC temperatura La temperatura óptima de la catalasa esta en un rango de 37ºC, es decir que a 37ºC la velocidad de reacción de la catalasa es máxima pues su temperatura es óptima. Por lo tanto, la velocidad de reacción de una enzima aumenta al presentarse en una temperatura óptima. Efecto del pH sobre la actividad enzimática Todas las reacciones enzimáticas son influenciadas por el pH del medio. Cada enzima tiene un pH óptimo, en el cual esta ejerce su máxima acción. La mayor parte de las enzimas intracelulares tienen un pH óptimo cerca de la neutralidad, por lo que puede actuar en medio ácidos o básicos, pero los ácidos y bases enérgicos las inactivas irreversiblemente. La acción del pH sobre la actividad enzimática es debido: 1. 2. 3. 4. El efecto sobre la velocidad de desnaturalización de la enzima Al efecto sobre el substrato Al efecto sobre los centros activos de la enzima Al efecto sobre los grupos que participan en la reacción Los resultados de la velocidad de reacción de la enzima catalasa para los pH 4, 7 y 9 fueron representados en el siguiente gráfico velocidad 4 pH óptimo 7 9 pH El pH óptimo de la catalasa es cercano a 7, por que la velocidad de reacción aumenta en ese valor. De esto podemos concluir que la velocidad de reacción aumenta al presentarse en un pH óptimo Efecto de la concentración del substrato La velocidad de la reacción enzimática se encuentra también influida por la concentración del substrato. Al aumentar la concentración del substrato, aumentará la velocidad de la reacción, hasta alcanzar la velocidad máxima. Se alcanza esta velocidad por que la todos los sitios activos de las enzimas están saturados. Aquí la velocidad de reacción se hace constante. Para esta experiencia se utilizaron 3 sistemas con: - 5 ml de H2O2 + 10 ml de agua destilada - 10 ml de H2O2 + 5 ml de agua destilada - 10 ml de H2O2 Los resultados para estos experimentos están representados en el siguiente gráfico: Velocidad Concentración del sustrato La gráfica nos permite concluir que la concentración de sustrato influye en la velocidad de la reacción, llegando a ser constante cuando todos los sitios activos de la enzima catalasa están saturados. Metabolismo La suma de todos los cambios químicos que tienen lugar en la célula constituye el metabolismo. Una metabolito es una sustancia que se ocupa o se deshecha en las reacciones metabólicas. El metabolismo se divide en dos partes que se llevan a cabo al mismo tiempo en los procesos de la célula: Catabolismo y Anabolismo. En las reacciones catabólicas o de degradación ocurre una ruptura de las moléculas en partes cada vez más pequeñas. En el anabolismo o reacciones de síntesis se integran partes pequeñas para dar moléculas más complejas. Respiración aerobia, producción de CO2 Se introducen 40 semillas en germinación de frijoles en un matraz tapado. Un tubo conecta este matraz con otro matraz que contiene Ba(OH)2. Otra abertura del mismo tapón esta unida a un embudo. Se deja una hora para luego sacar las pinzas de los tubos y dejar caer el agua hacia el sistema. El agua provocará que el CO2 avance desde el matraz con los frijoles hasta el matraz con Ba(OH)2, reaccionando con este, produciendo BaCO3 + H2O y un leve burbujeo. El BaCO3 se presenta como un precipitado blanco. Respiración anaerobia, producción de CO2 Es similar a la experiencia anterior, solo que en vez de frijoles se utiliza levadura. Esta levadura, gracias al proceso de fermentación, libera CO2. Un tubo conecta este matraz con otro matraz que contiene Ba(OH)2. Otra abertura del mismo tapón esta unida a un embudo. Se deja una hora para luego sacar las pinzas de los tubos y dejar caer el agua hacia el sistema. El agua provocará que el CO2 avance desde el matraz con la levadura hasta el matraz con Ba(OH)2, reaccionando con este, produciendo BaCO3 + H2O y un fuerte burbujeo. El BaCO3 se presenta como un precipitado blanco. Efecto de un antimetabolito en la respiración de las células de levadura La enzima enolasa cataliza la reacción que convierte el 2PG en PEP. La enolasa para reaccionar requiere la presencia de iones Magnesio. El fluor se presenta como un antimetabolito pues precipita los iones Mg y asi inhibe la reacción. Esta inhibición se puede detectar por la disminución de la velocidad del proceso respiratorio. 3PG(1) 2PG(2) PEP(3) Puruvato(4) Acetaldehido CO2 (5) E tan ol Las enzimas que realizan este proceso son: (1) (2) (3) (4) (5) Fosfogliceromutasa Enolasa Piruvato cinasa Piruvato descarboxilasa Alcohol deshidrogenada El antimetabolito es NaF y actúa inhibiendo a la enolasa. Esto es debido a que el Fluor precipita los iones Mg que requiere la enolasa para poder llevar a cabo la reacción. El resultado observable de esta inhibición es la no producción de CO2 Tubo 1: 5 ml de una suspensión de levadura + 10 ml de agua destilada Tubo 2: 5 ml de una suspensión de levadura + 5 ml de glucosa + 5 ml de agua destilada Tubo 3: 5 ml de una suspensión de levadura + 5 ml de glucosa + 5 ml de NaF 0,01M Tubo 4: 5 ml de una suspensión de levadura + 5 ml de glucosa + 5 ml de NaF 0,05M Tubo 5: 5 ml de una suspensión de levadura + 5 ml de glucosa + 5 ml de NaF 0,10M Colocados a 37ºC los resultados de liberación de CO2 fueron los siguientes: Tubo 1 : No libera CO2 Tubo 2 : Bastante liberación de CO2 Tubo 3 : Descenso de la liberación de CO2, 2 ml Tubo 4 : Descenso de la liberación de CO2, 1 ml Tubo 5 : Descenso de la liberación de CO2, 0,5 ml Se conluye que la liberación de CO2 esta dada indirectamente por la acción de la enolasa, que es inhibida por el antimetabolito NaF. A mayor concentración de antimetabolito, menor respiración celular. Medición de la velocidad del proceso respiratorio en los animales Se pesan dos animales de la misma especie y se encierran (por separado) en una cámara de respiración junto con un tubo de ensayo con Na(OH) levemente tapado para no quemar al animal. El hidróxido de sodio absorbe el CO2 producido en la respiración y esto produce un cambio en la presión. Este cambio representa el oxígeno consumido por el animal. Con este valor podemos determinar el consumo de oxígeno por hora. Por ejemplo: si la marca se desplazo 5 ml en 5 minutos, tenemos: 5mlO2 XmlO2 15 min 60 min X corresponde a la cantidad de O2 consumida por hora. Los resultados fueron que a mayor peso del animal, mayor consumo de oxígeno. La gráfica de consumo de oxigeno por hora vs peso del animal es la siguiente: Consumo de O2 Peso del animal La tasa metabólica corresponde al consumo de oxígeno dividido por el peso del animal. Consumo de O2 tasa metabolica peso Al ser el animal con mayor peso el que consume más oxigeno, tenemos una relación inversamente proporcional. El gráfico es el siguiente: Tasa metabólica Peso del animal La tasa metabólica es menor para animales con mayor peso por que estos poseen tejidos que consumen menos oxígeno.