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Prácticas de Bioquímica
Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA
SANGUÍNEA
Objetivos
Al finalizar el trabajo práctico los alumnos estarán en capacidad de:
-
Conocer la forma y condiciones para obtener un preparado de catalasa sanguínea.
-
Verificar el efecto de la concentración de la enzima sobre la actividad de la catalasa
sanguínea.
-
Reconocer el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
-
Demostrar la influencia del pH sobre la actividad enzimática.
-
Probar el efecto de la concentración de substrato sobre la actividad de la catalasa
sanguínea.
-
Verificar la influencia de un inhibidor sobre la actividad enzimática.
Introducción
El metabolismo celular de los tejidos animales y vegetales genera peróxido de hidrógeno
(H2O2), molécula que resulta tóxica para la célula. A través de la evolución estos organismos han
desarrollado sistemas enzimáticos que descomponen este peróxido y evitan daños a la célula.
Uno de estos sistemas enzimáticos lo representa la catalasa.
La catalasa es una cromoproteína porfirínica cuya masa molecular es de 225.000 kDa,
contiene cuatro grupos hemo por molécula y su contenido de hierro es 0.9%. Esta proteína
presenta actividad enzimática de tipo oxido-reductasa sobre el peróxido de hidrógeno (H2O2) el
cual constituye el sustrato para esta enzima y lo descompone en oxígeno y dos moléculas de agua
Su nombre sistemático de acuerdo a la Unión Internacional de Bioquímica es H2O2
oxidoreductasa y cataliza la siguiente reacción:
Catalasa
2H2O2
O2 + 2H2O
Peroxido de hidrógeno
En los mamíferos esta enzima se encuentra en todo tipo de células, siendo su actividad
mayor en el hígado, riñón y eritrocitos. Un mol de catalasa puede descomponer 5.000.000
moléculas de H2O2 por minuto a 37°C, esto se conoce como número de recambio y representa
uno de los más altos de toda la enzimología.
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Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
La actividad de la catalasa de los eritrocitos puede determinarse mediante algunos
principios bioquímicos de los cuales los más sencillos están basados en la desaparición del H2O2
al incubarlos con preparaciones crudas o purificadas de la enzima. A su vez, la desaparición del
H2O2 puede estimarse por varios métodos, uno de ellos es el método titrimétrico por
permanganimetría. En este método una preparación de catalasa se incuba con una concentración
conocida de peróxido de hidrógeno durante cierto tiempo y en condiciones adecuadas. Al cabo
de este tiempo, la reacción se detiene por adición de H2SO4 2N y luego se titula con una solución
de permanganato de potasio (KMnO4).
La reacción de peróxido de hidrógeno con el permanganato de potasio en medio ácido es
la siguiente:
K2SO4 + 2 MnSO4 + 8 H2O + 5 O2
2 KMnO4 + 3 H2SO4 + 5 H2O2
Esta reacción constituye una típica titulación de oxidación-reducción, la ocurre en
proporciones estequiométricas entre el permanganato y el peróxido de hidrógeno.
Los experimentos que se realizarán en este trabajo práctico, se basarán en el método
titrimétrico por permanganimetría y en cada uno de ellos se titularán frascos controles (los
cuales no contienen enzima) y constituyen una medida de peróxido presente al inicio del
experimento.
La titulación de los frascos experimentales
representa
la medida del peróxido
remanente después que la enzima ha actuado sobre el sustrato.
La diferencia entre las dos titulaciones (control – experimental) representa la cantidad de
peróxido descompuesto en una unidad de tiempo, es decir, la velocidad de la reacción.
MATERIALES Y REACTIVOS
-
Matraces erlenmeyer
-
Tubos de ensayo
-
Embudo
-
Bureta y soporte universal
-
Gradilla
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-
Baños de calentamiento
-
Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL.
-
H2SO4 2 N
-
Buffer fosfato 0,01 M, pH 3, 7 y 8. Debe contener H2O2 para gastar aproximadamente 15
mL de KMnO4 0,012 N.
-
KMnO4 0,012 N
-
Solución de KCN 10-3 preparada el día de su uso.
Obtención de un preparado de catalasa sanguínea: (será preparada con anticipación por el
docente).
Para obtener una preparación cruda y altamente activa de la enzima se sigue el siguiente
procedimiento:
1.- Pipetear 25 mL de agua destilada en un frasco Erlenmeyer y enfriarla sobre hielo picado.
2.- Con ayuda de una lanceta estéril, extraer sangre capilar (del dedo pulgar), descartar la primera
gota de sangre y luego pipetear 0,02 mL de sangre con una pipeta de Shalli.
3.- Agregar los 0.02 mL de sangre en los 25 mL de agua destilada fría. Lavar varias veces la
pipeta en el agua.
4.- Mantener la preparación de enzima en baño de agua helada con suficiente hielo para prevenir
el deterioro de la misma.
Experimento 1. Efecto de la concentración de enzima
La velocidad de reacción es afectada por la concentración de enzima presente en el medio
de incubación. A medida que se incrementa la concentración de enzima, la velocidad de la
reacción es mayor. En este experimento se variará la concentración de enzima y se mantienen
constantes todos los demás factores.
Procedimiento:
a. Tomar 5 frascos Erlenmeyer de 125 mL c/u; rotularlos del 1 al 5 y proceder a agregar los
volúmenes que se indican en la siguiente tabla:
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Frasco
N°
H2O2
pH 7
1
2
3
4
5*
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
Enzima
Tiempo
en min
H2SO4 2N
0,1 mL
0,2 mL
0,4 mL
0,8 mL
-----
5'
5'
5'
5'
5'
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
mL
gastados
KmnO4
*Tubo control.
b. Al momento de agregar la enzima al primer frasco, poner en marcha el cronómetro a fin
de que en cada frasco transcurran exactamente 5 minutos de reacción con la enzima.
c.
Transcurridos los 5 min, detener la reacción con ácido sulfúrico (en todos los frascos).
d. Titule los frascos con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente..
Anote el volumen de permanganato gastado para cada frasco.
e. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales
Volumen de
enzima
0,1 mL
0,2 mL
0,4 mL
0,8 mL
Concentración
de
Enzima (UI)
2 x 10-3
4 x 10-3
8 x 10-3
1,6 x 10-2
Velocidad de reacción
(Calculada)
f. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y la
concentración de la enzima. Nota: usar papel milimetrado.
Experimento 2. Efecto de la temperatura.
Toda reacción enzimática presenta una temperatura óptima la cuál es definida como la
temperatura a la cual la velocidad de la reacción es mayor, manteniendo constante los otros
factores. En este experimento se utilizarán tres temperaturas diferentes para observar el efecto de
la misma sobre la actividad de la catalasa.
Procedimiento:
a. Preparar tres series de tubos de ensayo (cada serie consta de dos tubos).
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b. Proceder a rotular los tubos de la siguiente manera:
-
1era serie: tubos 1A y 1B.
-
2da serie: tubos 2A y 2B.
-
3era serie: tubos 3A y 3B.
Los tubos "A" serán controles y los "B" experimentales.
c. Agregar a cada uno de los tubos los reactivos y volúmenes indicados en la siguiente tabla:
Tubo
Nº
H2O2
pH 7
Temperatura
Enzima
Tiempo
H2SO4 2N
1A
1B
2A
2B
3A
3B
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
10°C
10°C
37°C
37°C
60°C
60°C
-0,5 mL
-0,5 mL
-0,5 mL
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
mL
gastados
KmnO4
d. Al momento de agregar la enzima al primer frasco, poner en marcha el cronómetro a fin
de que en cada frasco transcurran exactamente 5 minutos de reacción con la enzima.
e.
Transcurridos los 5 min, detener la reacción con ácido sulfúrico (en todos los frascos).
f. Transfiera el contenido de los tubos a frascos erlenmeyer y titule con KMnO4 hasta que
aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el volumen de permanganato gastado
para cada frasco.
g. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales
Temperatura
°C
Velocidad de
reacción
(calculada)
10
37
60
h. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y la
temperatura. Nota: usar papel milimetrado.
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Experimento 3. Efecto del pH
La mayoría de las enzimas muestran su máximo de actividad en un rango limitado de pH.
Es conocido que la conformación del sitio activo y su relación con el sustrato son afectadas por
este factor. Esto es el resultado de la suma de una serie de factores tales como: ionización de la
enzima, ionización del substrato, difusión de productos, etc. En este experimento se determinará
la actividad de la catalasa a diferentes valores de pH, para observar el efecto de este importante
factor sobre la velocidad de la reacción.
Procedimiento:
a. Rotular tres series de Erlenmeyer al igual que en el experimento anterior.
b. Adicione los reactivos y sus volúmenes según la siguiente tabla:
Frasco
N°
H2O2
pH 3
H2O2
pH 7
H2O2
pH 8
Enzima
Tiempo
H2SO4 2N
1A
1B
2A
2B
3A
3B
5 mL
5 mL
-----
--5 mL
5 mL
---
-------5 mL
5 mL
-0,5 mL
-0,5 mL
-0,5 mL
5'
5'
5'
5’
5’
5’
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
mL gastados
KmnO4
c. Al momento de agregar la enzima al primer frasco, poner en marcha el cronómetro a fin
de que en cada frasco transcurran exactamente 5 minutos de reacción con la enzima.
d.
Transcurridos los 5 min, detener la reacción con ácido sulfúrico (en todos los frascos).
e. Titule con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el
volumen de permanganato gastado para cada frasco.
f. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales
pH
Velocidad de reacción
(calculada)
3
7
8
g. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y el pH.
Nota: usar papel milimetrado.
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Experimento 4. Efecto de la concentración del substrato
A medida que aumenta la concentración del sustrato, la velocidad de reacción aumenta,
sin embargo, la concentración de sustrato puede llegar a sobrepasar la capacidad de la enzima de
convertirlo en producto, alcanzando la velocidad máxima. (Vmax). . En este experimento se
utilizarán tres concentraciones de sustrato diferentes para determinar su efecto sobre la actividad
de la catalasa.
Procedimiento:
a. Rotular tres series de Erlenmeyer al igual que en el experimento anterior.
b. Adicione los reactivos y sus volúmenes según la siguiente tabla:
Frasco
No.
H2O2
pH 7
H2 O
destilada
Enzima
Tiempo
H2SO4
2N
1A
1B
2A
2B
3A
3B
1,25 mL
1,25 mL
2,50 mL
2,50 mL
5 mL
5 mL
3,75 mL
3,75 mL
2,50 mL
2,50 mL
-----
-0,5 mL
-0,5 mL
-0,5 mL
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
mL gastados
KmnO4
c. Al momento de agregar la enzima al primer frasco, poner en marcha el cronómetro a fin
de que en cada frasco transcurran exactamente 5 minutos de reacción con la enzima.
d.
Transcurridos los 5 min, detener la reacción con ácido sulfúrico (en todos los frascos).
e. Titular con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el
volumen de permanganato gastado para cada frasco.
f. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales
Volumen de
sustrato
1,25 mL
2,5 mL
5 mL
Concentración de
Sustrato
1,25 x 10-2 M
2,5 x 10-2 M
5 x 10-2 M
Velocidad de reacción
(calculada)
g. Construya un gráfico que muestre la relación entre la velocidad de reacción y la
concentración de sustrato. Nota: usar papel milimetrado.
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Experimento 5. Efecto de la concentración progresiva del substrato en presencia de un
inhibidor
La actividad de la catalasa es fuertemente inhibida por agentes capaces de combinarse con
el hierro de su grupo prostético porfirínico, tales como el KCN. Indudablemente la mayor parte
de los efectos letales del cianuro se deben a la inhibición de enzimas ferroporfirínicas como la
catalasa, citrocromo-oxidasa, etc. En este experimento se demostrará el efecto inhibitorio del
cianuro en presencia de dosis progresivas de substrato sobre la velocidad de reacción enzimática.
Este ensayo permite a su vez, determinar el tipo de inhibición producida por el cianuro sobre la
enzima.
Procedimiento:
a. Rotular tres series de Erlenmeyer al igual que en el experimento anterior.
b. Proceder de igual forma al experimento N° 4. La única diferencia entre ambos
experimentos es la presencia en todos los tubos, de KCN. Contrastando los datos con los
del experimento 4, podremos determinar qué tipo de inhibición lleva a cabo el cianuro de
potasio sobre la catalasa sanguínea.
c. Coloque en los frascos lo que se indica en la siguiente tabla:
Frasco
N°
H2O2
pH 7
1A
1B
2A
2B
3A
3B
1,25 mL
1,25 mL
2,50 mL
2,50 mL
5 mL
5 mL
H2 O
KCN
-3
10 M
Enzima
Tiempo
H2SO4 2N
3,75 mL
3,75 mL
2,50 mL
2,50 mL
---
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL
0,5 mL
-0,5 mL
-0,5 mL
-0,5 mL
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
mL
gastados
KmnO4
d. Al momento de agregar la enzima al primer frasco, poner en marcha el cronómetro a fin
de que en cada frasco transcurran exactamente 5 minutos de reacción con la enzima.
e.
Transcurridos los 5 min, detener la reacción con ácido sulfúrico (en todos los frascos).
f. Titule con KMnO4 hasta que aparezca un color rosado pálido permanente. Anote el
volumen de permanganato gastado para cada frasco.
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Práctica: Actividad de la Catalasa Sanguínea
g. Tabule los resultados y calcule la velocidad de reacción para los tubos experimentales, así
como los inversos de las velocidades 1/[V] y de las concentraciones de sustrato 1/[S] de
los experimentos N° 4 y 5 (gráfico de los inversos recíprocos)
Volumen
de
sustrato
1,25 mL
2,5 mL
5 mL
Concentración
de sustrato
Velocidad de
reacción
1 / [S]
Exp 4
1 / [S]
Exp 5
1 / [V]
Exp 4
1 / [V]
Exp 5
h. Construya un gráfico que muestre la relación entre el inverso de la velocidad de reacción
y el inverso de la concentración de sustrato en presencia o no del inhibidor. Nota: usar
papel milimetrado.
Cálculos de la velocidad de reacción
La velocidad de reacción para cualquier tubo experimental se expresa en la siguiente
unidad: = mmoles de H2O2 destruidos / minuto.
Para obtener el resultado de velocidad expresado en esa unidad deben realizarse los
siguientes cálculos siguiendo esta secuencia:
a. mEq de KmnO4 = N KMnO4 x Volumen gastado (mL)
b. mEq de H2O2 = mEq de KmnO4
c. mmoles de H2O2 = mEq de H2O2 / N° de hidrógenos (2)
d. mmoles destruidos de H2O2 = mmoles totales (control) – mmoles remanentes
(experimental)
e.  (velocidad de reacción) = mmoles destruidos de H2O2 / tiempo de reacción (5 minutos)
Los cálculos deberán realizarse para cada tubo experimental en todos los experimentos.
Construya las siguientes gráficas:
a. Concentración enzimática contra velocidad de reacción (Experimento 1)
b. Temperatura contra velocidad de reacción (Experimento 2)
c. pH contra velocidad de reacción (Experimento 3)
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d. Concentración de sustrato contra velocidad de reacción (Experimento 4)
e. Concentración progresiva de inhibidor contra velocidad de reacción (Experimento 5)
Auto evaluación
1. ¿Cómo cree usted que será el efecto de las temperaturas 15°C, 37°C y 60°C sobre la actividad
enzimática de la catalasa sanguínea?
2. Explique ¿Qué diferencia existe entre los tubos controles y experimentales de esta práctica?
3. ¿En que se basa el método titrimétrico por permanganimetría?
4. ¿Qué función cumple el H2SO4 N en los experimentos de esta práctica?.
Bibliografía
Plummer, David. Bioquímica práctica. Mc Graw Hill. 1981.
Robyt, John; White Bernard. Bioquemical Techniques. Waveland Press. 1987.
Universidad Simón Bolívar. Prácticas de Bioquímica I: BC-3181. Departamento de Biología
Celular. 1999.
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