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Liceo N°1 Javiera Carrera Depto. de Biología C.G.B.T./c.g.b.t. DOCUMENTO DE APOYO 4° MEDIO COMÚN Después que Watson y Crick propusieron el modelo de doble hélice del ADN, tres modelos de replicación del ADN se han propuesto: conservativo, semiconservativo y dispersivo. Modelos de Mecanismos de Replicación: Modelo Conservativo En este modelo las dos cadenas de ADN paternales se vuelven a juntar después de que ocurre la replicación. Esto es, una molécula hija contiene a ambas cadenas paternales, y la otra molécula hija contiene al nuevo material sintetizado. Modelo En este modelo la doble hélice paternal es rota en segmentos de Dispersivo doble cadena de ADN. Al igual que en el modelo conservativo, actúan como moldes para la síntesis de nuevas moléculas de doble hélice. Los segmentos se recomponen en dobles hélices de ADN completas, cada una con segmentos intercalados de padres e hijos. Modelo Semiconservativo En este modelo las dos cadenas paternales del ADN se separan y sirven de molde para la síntesis de una nueva cadena de ADN. El resultado son dos dobles hélices de ADN, donde ambas están constituidas de una cadena paternal y una cadena nueva. La división celular origina dos células hijas a partir de una sola célula madre. Para que estas células hijas sean normales, la división celular debe garantizar que cada célula reciba una copia de toda la información genética de la célula progenitora. Por lo que, antes de la división celular, la célula madre debe sintetizar dos copias exactas de su ADN, proceso que se conoce como replicación del ADN, hecho que ocurre en la etapa S de la interfase celular, estudiado en segundo medio. En la mayoría de las células que se dividen, el inicio de la replicación obliga a la célula a dividirse, de otra manara podría morir. Por eso, el momento de la replicación está regulado de modo que no se inicie a menos que la célula esté preparada para dividiré. Estos controles también garantizan que el ADN de la célula se replique exactamente una vez, no más, antes de cada división celular.e ADN La replicación del ADN produce dos dobles hélices idénticas cada una de las cuales será transmitida, en un cromosoma, a una célula hija. Antes de la división celular, se debe replicar el ADN que está en la cromatina organizada en estructuras individuales llamadas cromosomas, los que contienen una sola doble hélice de ADN. La replicación del ADN se inicia cuando enzimas topoisomerasas desenrollan y separan la doble hélice parental, de tal forma que las bases de las dos cadenas de ADN no estén apareadas. Otras enzimas avanzan a lo largo de cada cadena de ADN parental, seleccionando y uniendo nucleótidos libres complementarios a los de la cadena parental que sirve de molde. Las enzimas unen estos nucleótidos libres para formar dos nuevas. Cuando la replicación ha concluido, cada nueva hebra de ADN se organiza en una doble hélice que contiene una cadena antigua y una cadena nueva, por lello el proceso se denomina replicación semiconservativa. Esto se ha observado gracias al experimento de Meselson y Sthal. Experimento de Meselson y Sthal: Meselson y Stahl (1957) diseñaron un experimento para tratar de averiguar la forma en la que se realiza la replicación del ADN en E. coli, es decir, la pregunta que se plantearon fue: ¿Qué modelo de replicación del ADN sigue E. coli, semiconservativo, conservativo o dispersivo?. Para contestar a esta pregunta, diseñaron un experimento en el que marcaban el ADN de la bacteria E. coli con Nitrógeno pesado N15, para ello hicieron crecer las bacterias durante 14 generaciones sucesivas en un medio que contenía como única fuente de Nitrógeno N15. Durante estas 14 generaciones el ADN de las bacterias las bacterias se había sintetizado con bases nitrogenadas con Nitrógeno pesado (N15). Posteriormente, comprobaron que podían distinguir el ADN del las bacterias que crecían en un medio normal (con N14) del ADN de las bacterias que habían crecido durante 14 generaciones en N15. Para ello extrajeron el ADN de ambos tipos de bacterias y lo centrifugaron en un gradiente de densidad de CsCl. El resultado fue que la densidad del ADN de las bacterias que habían crecido en presencia de N15 era mayor que el ADN de las bacterias que habían crecido con N14. Una vez comprobado que eran capaces de distinguir el ADN de ambos tipos de bacterias, continuaron el experimento de la siguiente forma: Las bacterias que habían estado creciendo en Nitrógeno pesado (N15) las pasaron a un medio de cultivo que contenía N14 (Nitrógeno normal) y a distintos tiempos, media generación, una generación, dos generaciones, tres generaciones de replicación, tomaban una muestra del cultivo bacteriano, extraían el ADN y centrifugaban en gradiente de densidad de CsCl. Las dos nuevas dobles hélices se mantienen unidas mientras la célula se prepara para dividirse. El cromosoma recibe ahora el nombre de cromososma duplicado. Cada cromosoma duplicado contiene dos cromátidas (cromátidas hermanas) idénticas entre sí, como producto de la replicación del ADN. Cuando las cromátidas hermanas se separan durante la división celular, cada célula hija recibe una cromátida ( un cromosoma simple); así se conserva la intergridad de la información genética de una división celular a la siguiente. Características Generales del Mecanismo de Replicación: Entre las muchas enzimas que participan en la replicación, destaca la ADN helicasa, una enzima que separa la hélice utilizando ATP para romper los puentes de hidrógeno entre pares de bases complementarias. Esta actividad desenrrolla y separa la doble hélice y forma una” burbuja de replicación”. En el interior de esta burbuja de replicación, las bases nucleótidicas no apareadas sirven de molde para la polimerización de las cadenas complementarias. Cada burbuja de replicación contiene dos “horquillas” de replicación donde las dos cadenas de ADN parentales no se han desarrollado aun, se parecen a una bifurcación de caminos. BURBUJA DE REPLICACIÓN: La replicación se inicia en el momento en que la ADN helicasa y otras enzimas que analizaremos más adelante, desenrollan partes de la doble hélice de ADN parental y crean una burbuja de replicación. En las células complejas, la replicación del ADN ocurre simultáneamente en muchos puntos de la doble hélice del ADN parental, lo que se traduce en la formación de numerosas burbujas de replicación. La replicación del ADN termina cuando todas las burbujas de replicación adyacentes se encuentran para formar dos dobles hélices de ADN completas e individuales.Esto se observa en el siguiente esquema: La duplicación de la molécula de ADN se produce según las siguientes normas: 1. Es SEMICONSERVATIVA: cada molécula de ADN está formada por una hebra de ADN original y otra recién sintetizada. 2. Es BIDIRECCIONAL: a partir de un punto dado del cromosoma, la replicación progresa en dos direcciones. 3. En virus y bacterias hay un único PUNTO DE INICIO de la replicación. Mientras que en eucariotas hay varios 4. La replicación AVANZA por adición de mononucleótidos en sentido 5,--3, 5. Es SEMIDISCONTINUA: en una de sus hebras (llamada hebra conductora) se sintetizan fragmentos bastantes grandes de forma continua, mientras que en la otra (llamada retardada) la síntesis es discontinua, es decir, se van incorporando nucleótidos que se disponen de forma separada. 6. La INICIACIÓN de la síntesis de cada fragmento requiere un extremo hidroxilo libre que es proporcionado por un ARN cebador que analizaremos más adelante. La reacción fundamental de la síntesis de ADN es la adición de un desoxirribonucleótido al extremo 3, de una cadena de ADN. Las Enzimas De La Replicación En el proceso de duplicación del ADN intervienen numerosas proteínas que son las que se mencionan en la siguiente tabla: Proteínas Actividades Escinde el ARN cebador. Correctora de pruebas ADN Polimerasas ADN pol I (repara los errores de la síntesis del ADN). Rellena con dNTP el espacio resultante al eliminarse el ARN cebador. ADN pol II Repara pequeñas roturas en una hebra de ADN ADN pol III Polimerización del ADN, ya que presenta una alta procesividad( grado en que sigue añadiendo dNTP una vez que ha comenzado Otras Proteínas TOPOISOMERASAS Desenrollan el ADN HELICASAS Separan las hebras del ADN, para que cada una actúe de molde Proteínas SSB Se unen a las cadenas sencillas, estabilizándolas mientras dura la replicación PRIMASAS(ARN Sintetizan el ARN cebador polimerasas dependientes (primer) usando como de ADN) molde una hebra de ADN NUCLEASAS Rompen una de las hélices, dando lugar a un origen de replicación( creando un ADN primer) LIGASAS Unen fragmentos de ADN adyacentes, mediante enlaces fosfodiéster Las ADN polimerasas, que catalizan la formación de los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos y van añadiendo nucleótidos complementarios al de la hebra molde.Se utiliza desoxirribonucleótidos trifosfato(dNTP) que, además, aportan la energía necesaria para la reacción y desprenden pirofosfato inorgánico. Las Primasas van a originar los ARN cebadores que son complementarios del ADN correspondiente. Son ARN – polimerasas ADN dependientes, ya que pueden sintetizar una cadena de ARN usando una hebra de ADN molde. Las Topoisomerasas actúa desenrollando el ADN. Entre ellas destaca la ADN Girasa porque desespiraliza el ADN. Las Helicasas separan las dos hebras de la doble hélice. Las proteínas SSB mantienen separadas las dos hebras monocatenarias. Estas actúan conjuntamente con las helicasas. Las Nucleasas rompen los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos. Pueden atacarlos empezando por un extremo hidroxilo 3, libre o por el extremo 5, Las Ligasas que unen los fragmentos de polinucleótidos adyacentes mediante enlaces fosfodiéster. MECANISMO MOLECULAR DE LA REPLICACIÓN El ADN es una doble hélice trenzada muy estable y debe abrirse para replicarse (de ADN siempre presenta una hebra original y otra recién sintetizada) y lo hace en puntos llamados de inicio o de origen. En estos puntos es separada en una pequeña porción mediante una enzima llamada helicasa.Esta enzima ubica el punto de inicio u origen de la replicación. La enzima Helicasa se desplaza separando la doble hélice formando un pequeña horquilla de replicación, simultáneamente, actúan enzimas topoisomerasas, de tipo Girasa que desenrollan las hebras o hélices y proteínas SSB se adosan a las hebras en separación para estabilizarlas y así evitar que ambas hebras vuelvan a unirse y enrollarse. En este proceso la hélice rota en 100 revoluciones por segundo, esto generaría un sobre enrollamiento de la doble hélice en otros puntos, lo que es evitado por otras enzimas topoisomerasas, de corte de las hebras y, otra que luego las sellan. El nuevo ADN no puede volver a fabricarse mientras no sea cebado, es decir, hasta que se haya formado un partidor, llamado primer. El primer corresponde a un pequeño trozo fragmento de ARN que es complementario al ADN correspondiente. Esto lo realiza una enzima llamada ARN polimeraza dependiente del ADN, que se denomina Primasa, en el mismo punto de la replicación. Este partidor de ARN luego será removido. Este partidor es importante porque el último nucleótido del ARN que posee, proporciona un OH3` libre para el primer desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP) de la hebra del ADN que está copiando. La enzima ADN polimerasa III (ADNpol III), se encarga de añadir dNTP complementarios a la hebra molde del ADN en el extremo OH- 3` libre del ARN cebador. A esto se debe que la enzima ADN pol III no puede comenzar la síntesis de nuevas cadenas por si sola por ello es imprescindible la participación de la enzima primasa que se desplaza o que recorre la hebra molde del ADN en sentido 3`→ 5´ sintetizando el fragmento ARN complementario y antiparalelo en sentido 5´→3` añadiendo rNTP (ribonucleótido trifosfato) en los OH- 3` libre de cada nucleótido del ARN. La enzima ADNpol III además es capaz de continuar la polimerización del ADN siempre que posea OH- 3` libre donde seguir añadiendo nuevos dNTP, estos son proporcionados por los mismos dNTP que se van añadiendo. La ADN pol III al igual que el ARN polimerasa también se desplaza o recorre la hebra molde del ADN en sentido 3`→ 5´ ubicando nucleótidos (dNTP) para la nueva hebra complementaria en sentido 5´→3`. La ADN pol III reconoce los nucleótidos de la hebra molde y los empareja con los dNTP libres que han llegado al núcleo desde el citoplasma donde son sintetizados o proporcionados por la dieta, enfrentando los nucleótidos de acuerdo a su complementariedad de sus bases, A = T y C=G. Para ambas hebras se desplaza una enzima ADNpol III debido a que son antiparalelas, una en un sentido y la otra en el sentido contrario. En una de las hebras llamada continua o conductora la síntesis de la nueva hebra es sin interrupción, mientras que la otra hebra, llamada retardada, la síntesis es discontinua. Esto último se debe a que la enzima ADNpol III al desplazarse en sentido 3`→ 5´ de la hebra del ADN llega a un punto en que no puede continuar la síntesis y vuelve a empezar en una zona más atrás donde no se ha producido replicación. Para continuar con la replicación la enzima primasa debe armar otro partidor quedando a lo largo de la hebra retardada del ADN una complementaria formada por fragmentos llamados de OKASAKI. De acuerdo a esto cada fragmento de Okasaki, esta formado por un segmento de ARN (primer), seguido por otro mucho mayor de ADN. Luego la enzima ADNpol I elimina el cebador mediante su actividad exonucleasa (extrae) 5´→3` rompiendo los enlaces fosfodiéster que existen entre los nucleótidos. Además la enzima ADNpol I tiene una acción polimerasa 5´→3` rellenando el espacio dejado por el fragmento de ARN partidor que ha sido removido con un fragmento de cadena de ADN. Por último los ADN libres derivados del fragmento de Okasaki más el de relleno son unidos por enzimas topoisomerasa de tipo ligasa. En ambos casos, tanto la enzima ARN polimerasa (primasa), como la ADN pol III añaden nuevos nucleótidos que se van uniendo en cadena mediante puentes covalentes fosfodiéster con energía proporcionada por los mismos nucleótidos, ya que estos son trifosfatos, liberándose un pirofosfato inorgánico(PPi). También puede participar la enzima ADN pol II que en su acción exonucleasa 3`→ 5´ y polimerasa 5´→3` repara en la hélice sencilla pequeñas roturas que ocurren en una hebra del ADN. En eucariontes existe mucha mayor cantidad de ADN que en procariontes por lo tanto la replicación en eucariontes debería ser mucho más lenta, pero no es así, porque en los eucariontes existen muchos puntos de origen o inicio de replicación, mientras que en procariontes existe solo uno. Esto significa que los organismos eucariontes poseen muchas unidades de replicación, las que se denominan replicaciones, cada uno con un punto de origen y dos puntos de término. El ADN de eucariontes está asociado a proteínas histonas formando los nucleosomas, esto dificulta el progreso de la ADN pol III, por ello el ADN debe desaparearse de la histona y se requiere una síntesis de histona coordinada con la replicación. Para ello, mientras en una zona del ADN está formándose replicaciones en otra se está transcribiendo ARN para la síntesis de nuevas proteínas histonas Los esquemas precedentes tienen el objeto que observes esquemáticamente el mecanismo de la replicación del ADN. El ADN conserva absolutamente la información genética a través de innumerables divisiones celulares. Esto se debe a la existencia de tres procesos enzimáticos. Dos de ellos se encargan de prevenir errores y el tercero se encarga de la corrección de errores. Cada uno de los mecanismos que aseguran una correcta replicación son los siguientes: 1.- Selección de nucleótidos (dNTP) es realizada por la enzima ADN polimerasa III y se basa en que la estabilidad del complejo formado por ADN pol III. El ADN molde y el dNTP es máxima si el dNTP es complementario. 2.- Corrección de pruebas: es realizada por la enzima polimerasa I mediante su acción exonucleasa, que tiende a eliminar cada nucleótido recién añadido. La existencia de un nucleótido desemparejado detiene la adición del siguiente y la exonucleasa, ADNpol I, tiene tiempo par retirar el nucleótido. La ADN pol III busca de nuevo la pareja adecuada. La corrección de errores es más compleja que la corrección de pruebas. Las enzimas deben reconocer, eliminar y sustituir por otro el nucleótido mal emparejado. El problema está en distinguir la cadena molde (original) de la recién sintetizada. En procariontes el nucleótido se metila después de la síntesis del ADN. Pero hay un breve tiempo en que permanece sin metilar y en ese intervalo la cadena nueva y vieja se diferencia por el grado de metilación. En eucariontes no se produce metilación, y no se sabe cómo se distinguen ambas hebras. La formación de puentes de hidrógeno entre pares de bases complementarias proporciona gran exactitud a la replicación. Sin embargo, ningún proceso celular es perfecto, ni siquiera la replicación de ADN. En parte, dado que la replicación es tran veloz ( hasta 800 nucleótidos por segundo), la ADN polimerasa enlaza bases incorrectas una vez por cada 10 mil pares de bases, pero las cadenas de ADN terminadas contienen solo aproximadamente un error en cada 1000 millones de pares de bases. Esta gran exactitudse consigue por la acción de las ADN polimerasas reparadoras, descritas anteriormente, que corrigen las cadenas hijas durante y después de su síntesis. A pesar de todo, algunos errores no son reparados. Una célula con errores en su ADN puede funcionar normalmente si este error se produce en segmentos no críticos del ADN, o puede morir si el error afecta segmentos genéticos fundamentales de la célula. Los errores (mutaciones) que escapan a los mecanismos de control constituyen una fuente importante de variación genética necesaria para que ocurra evolución. Los efectos de estos errores dependen del organismo y de las condiciones ambientales que lo rodean. Cuando estas son favorables, los cambios (mutaciones) no suelen ser beneficiosos; pero si las condiciones ambientales son desfavorables, un cambio (mutación) si puede resultar ventajoso.