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APLICACIÓN DE MÉTODOS MOLECULARES PARA DETERMINAR
DIVERSIDAD MICROBIANA SULFOXIDANTE EN REACTORES DE
CULTIVO CONTINUO E IDENTIFICACIÓN DE AISLADOS
B. M. Pérez Ibarraa, A. Hamdan Partida, S. R. Moiseev, H. Ramírez Saad
a
Departamento de sistemas biológicos laboratorio de ecología molecular. Universidad
Autónoma Metropolitana-Xochimilco. Calzada del hueso No. 1100, Col. Villa Quietud,
C. P. 23-181, D.F, México [email protected]
RESUMEN
Los microorganismos sulfoxidantes provenientes de una comunidad bacteriana en reactores de cultivo
continuo a diferentes condiciones de operación fueron aislados y caracterizados mediante técnicas de
biología molecular para posteriormente, analizar su comportamiento como parte de un consorcio
sometido a proceso de sulfoxidación en presencia de metanol. El proceso fue muestreado en diez tiempos
para observar cambios en la comunidad bacteriana debidos a la presencia de metanol. Al analizar el
patrón de bandas obtenido por DGGE muestra que la población predominante, en cada una de las muestras
obtenidas, corresponde a la de los aislados y a la cepa control Thiobacillus ssp.
INTRODUCCIÓN
En los ecosistemas como sedimentos marinos, tapetes microbianos, y ventanas hidrotermales ocurren las
transformaciones del azufre (sulfato reducción y sulfuro oxidación) recibe el nombre de ciclo sulfureta
(Jorgensen, 1982; Van den Ende et al., 1997). En tales sistemas, la oxidación de HS- puede llevarse acabo
tanto, por microorganismos aerobios como anaerobios fototrófo en presencia de luz. En la ausencia de
luz, las bacterias incoloras del azufre también contribuyen en transferir el azufre. Dichos ecosistemas,
tienen importancia científica por la presencia de microorganismos únicos y específicos, además de una
importancia ambiental.
Procesos biotecnológicos ambientales y el ciclo biológico del azufre
Los biotratamientos son ampliamente empleados para tratar aguas municipales e industriales. Un
biorreactor puede ser aerobio o anaerobio, dependiendo del agua a tratar, los microorganismos en el
reactor actúan como biocatalizadores para degradan los compuestos orgánicos. Cada bioreactor es
acoplado a un proceso de manufactura por tanto la composición del agua de desecho contribuye a
seleccionar naturalmente la comunidad microbiana en el birreactor. Por ejemplo en fábricas de papel y
pulpa los boirreactores encargados del tratamiento de sus aguas estarán enriquecidos de microorganismos
celulolíticos y en el caso, de las refinerías de petróleo contendrá microorganismos degradadores de
hidrocarburos. Conforme se modifican los procesos de manufactura la composición de las aguas de
desecho pueden ir cambiando durante el tiempo, lo que hace que los microorganismos dentro del reactor
se adapten. De este modo, la diversidad microbiana en el bioreactor proporciona un nuevo ambiente en el
cual nuevas vías bioquímicas pueden desarrollarse; así los microorganismos en competencia pueden
continuar explotando los recursos administrados por un corriente de agua de desecho alterada.
Procesos de remoción de azufre
Los procesos tecnológicos ambientales basados en el ciclo del azufre se apoyan en la formación de
intermediarios insolubles, los cuales son separados de la fase acuosa. Como es de esperarse, los mismos
intermediarios sólidos como esos que se acumulan en la naturaleza (CaSO 4, sulfuros metálicos, y azufre)
se usan en tecnologías ambientales. En el proceso más viejo para la remoción de azufre llamado piedra
caliza-yeso, los óxidos de azufre eran removidos de la fase gaseosa por el contacto de dicha fase con una
solución sobresaturada de caliza induciendo así la formación de yeso. El yeso es usado en la construcción,
pero debido a que contamina con metales pesados su uso es limitado. De este modo, grandes cantidades de
este producto de desecho se forma y se requiere eliminar. El uso de sulfuros para producir precipitados de
sulfuros metálicos es un proceso real para el tratamiento de aguas contaminadas con metales pesados. El
sulfuro puede ser adicionado como compuesto químico o bien, puede ser producido en un biorreactor
sulfato reductor. Los sulfuros metálicos necesitan extraerse de las aguas tratadas y además debe
procesarse. Un proceso completo para la remoción de azufre de las aguas de desecho se basa en la
formación de azufre elemental. En este proceso, el sulfuro es producido a partir óxidos de azufre en un
biorreactor sulfato reductor. En un segundo biorreactor, el sulfuro es subsecuentemente convertido a
azufre elemental vía oxidación biológica parcial. El azufre elemental, puede emplearse en la producción
de ácido sulfúrico o en la elaboración de fertilizantes.
De acuerdo, con lo aquí expuesto las comunidades microbianas poseen un gran potencial ya que, llevan
acabo procesos importantes para el sostenimiento de la biosfera a escala global, soportando la vida de
muchos otros organismos, y destruyendo muchos de los productos de desecho de la sociedad humana. Tal
potencial, es explotado en los procesos biotecnológicos para el tratamiento de aguas residuales.
Recientemente, se describió un amplio rango de bacterias sulfato reductoras autótrofas como también,
heterótrofas capaces de crecer en condiciones extremas. Estas incluyen termofilos
(Thermodesulfobacterium hvragerdense y thermodesulfovibrio islandicus; Sonne-Hansen y Ahring,
1999), psicrofilicos (Desulfofrigus fragila, Desulfofaba gelida, y Desulfotalea psychrophila; Knoblauch
et al., 1999), halofilos (Desulfobacter halotolerans; Brandt y Ingvorsen, 1997) y alcalofilos
(Desulfotomaculum alkliphilum; Pikuta et al. 2000). Muchos de estos extremofilos se han aislado de
sedimentos marinos.
El conocimiento de la comunidad bacteriana es la llave para entender procesos tales como, las semejanzas
en evolución microbiana y biodiversidad para su posterior aplicación en la biodegradación y
bioremediación. Por tal motivo, dado a que los ácido nucleicos se encuentran en todas las formas de vida,
su propiedad de ácido nucleico y la diferencia en la secuencia de la estructura primaria es usada para
detecciones especializadas en ambientes complejos. Actualmente, apoyados en estas nuevas herramientas
se conocen catorce principales linajes (Reinos) de bacterias que se han definido sobre la base de la
comparar la secuenciación del gen 16S rRNA de cultivos en laboratorio. Sin embargo, debe tomarse en
cuenta que tales metodologías tiene limitaciones. Por ejemplo en los métodos de extracción de los ácido
nucleicos de las muestras no se asegura la lisis de todos los microorganismos presentes así como, su
recuperación intacta. Además, es importante su purificación para la eliminación de sustancias inhibidoras
de la reacción de PCR o la acción de enzimas de restricción (Wilson I. G., 1997).
Por otro lado, se ha reportado que la técnica de DGGE o TGGE pueden separar fragmentos pequeños, de
hasta 500 pares de bases y esto limita la identificación filogenéticas. Aunque existen reportes sobre la
posibilidad de separar secuencias que difieren en una sola base, también se ha reportado la dificultad de
separar fragmentos que difieren en 2 o 3 bases (Vallaeys T. et al. 1997). Otras limitaciones de estas
técnicas es el número máximo de bandas de DNA que puedan separarse, aunque se ha reportado la
detección de poblaciones que constituyen el 1% de la comunidad por PCR-DGGE (Muyzer G. et al.,
1993). En cuanto a los métodos In situ, puede ocurrir que no se detecte un microorganismo debido a una
permeabilidad insuficiente o a la falta de acceso de las sondas a las regiones a las cuales debe unirse
(Amann R. I., 1995). Sin embargo, los avances recientes en los métodos para el análisis de comunidades
microbianas hacen posible complementase con los métodos tradicionales para obtener información sobre
aspectos importante de la ecología microbiana ambiental desde varios aspectos diversidad, estructura y
función. Además de obtenerse resultados en tiempos más cortos que los métodos clásicos de
microbiología.
MÉTODOS
A partir de tres reactores con diferentes condiciones de operación se aislaron y caracterizaron tres cepas
sulfoxidantes empleando tanto métodos clásicos de microbiología, composición de ácidos grasos así como
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también técnicas de biología molecular (extracción DNA, amplificación del gen 16S rRNA por PCR,
DGGE y por último secuenciación comparando con la base de datos GENBANK).
Por otro lado, en un cuarto reactor alimentado con medio mineral, tiosulfato y metanol fue muestreado en
diez tiempos para observar cambios en la comunidad bacteriana como consecuencia de la presencia de
metanol. Se extrajo DNA de las cepas y del consorcio proveniente del reactor alimentado con metanol.
Entonces el DNA extraído fue usado para amplificar la región del gen 16s rDNA empleando primers
universales. Una vez determinadas las condiciones de amplificación se procedió a amplificar la región V6V8 del DNA. Para este PCR se adicionaron primers ricos en GC. Los productos obtenidos fueron
colocados en el DGGE (ver fig 1y 2). Las diferentes muestras, tanto aislados como las tomadas del reactor
fueron corridas simultáneamente para comparar los patrones de banda respectivos.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Los datos obtenidos de las diversas metodologías microbiologicas indican que las tres cepas comparten
características morfológicas y fisiológicas muy similares. Por tanto, se procedió a la aplicación de
herramientas moleculares que pudieran poner de manifiesto diferencias para así ser identificadas en
género y especie obteniéndose lo siguiente:
Cepas sulfoxidantes
aisladas
Thiobacillus sp UAM-I
Cepa de referencia
AIMP1
AUAM1
AR3
Comparación de secuencias con
GenBank paquete Blast search
Thiobacillus sp. UAM-I 16S ribosomal
RNA gene, secuencia parcial
Longitud= 1500
Identificación = (98%)
Thiobacillus neapolitanus DSM 581 gen
16S ribosomal RNA, secuencia parcial
Longitud= 1456
Identificación = (98%)
Acinetobacter sp. ANT9054 gen 16S
ribosomal RNA, secuencia parcial
Longitud = 1486
Identificación = (91%)
Thiobacillus neapolitanus DSM 581
gen16S ribosomal RNA, secuencia
parcial
Longitud= 1456
Identifica = 1205/1211 (99%),
De acuerdo, con lo anterior se hace evidente la presencia de dos cepas iguales (Thiobacillus neapolitanus)
y una cepas diferente (Acinetobacter sp) la cual, requiere su confirmación debido al porcentaje de
similitud tan bajo.
Por otro lado, en un cuarto reactor alimentado con medio mineral, tiosulfato y metanol se analizó tanto
químicamente como molecularmente el comportamiento del consorcio sulfoxidante y se comparó con la
huella genómica de los aislados mediante DGGE (ver fig 1y 2). Encontrándose un patrón de tres bandas
A, B, y C que corresponden a una comunidad muy pobre, integrada por tres microorganismos.
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La banda predominante B en cada una de las muestras obtenidas corresponde a la de los aislados. Cabe
señalar que el patrón de bandas de los aislados muestra más de una banda lo cual, requiere ser investigado
con más detalle, puesto que se trata de cepas pura.
AUAM
AR3 T0 T1 T2 T4 T5 T6 T8 T9
A
B
C
AIMP
Thiobacillus sp
Fig. 1 Comportamiento del consorcio bacteriano
sulfoxidante en un reactor de cultivo continuo
alimentado con metanol
*Formamida/urea
44%/52%
Fig. 2 Huella genómica de aislados y
comportamiento del consorcio bacteriano en
presencia de metanol
Al analizar el DGGE obtenido al correr los productos de PCR de la región V6-V8, tanto de los aislados
como de las muestras tomadas del cuarto reactor, se observa que la población predominante, en cada una
de las muestras obtenidas, corresponde a los aislados y a la cepa control Thiobacillus ssp.
CONCLUSIONES
A pesar de las pequeñas diferencias en composición de ácidos grasos, características morfológicas, y
fisiológicas observadas entre los aislados, los análisis moleculares manifestaron diferencias ya que al
analizar la secuencia del gen 16S rRNA de cada uno de los aislados, así como su comparación con el
GeneBank indicó que:
Las cepas AIMP1 y AR3 corresponden a un mismo microorganismo Thiobacillus napolitanus DSM 581
(98% y 99% de semejanza respectivamente).
Cepa de referencia Thiobacillus sp. UAM-I
La cepa AUAM1 corresponde a Acinetobacter sp. ANT9054. (95% semejanza) se requiere confirmar.
En cuanto al analizar el DGGE obtenido tanto de los aislados como de las muestras tomadas del cuarto
reactor, se observa que la población predominante, en cada una de las muestras obtenidas, corresponde a
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la de los aislados y a la cepa de referencia Thiobacillus ssp. y que las tres bandas corresponden a una
comunidad muy pobre integrada por tres poblaciones diferentes.
BIBLIOGRAFÍA
1. Jorgensen, B. B. “Ecology of bacteria of the sulfur cycle with special referente to
anoxic-oxic interface enviroments”. Phil. Tans. R. Soc. Lond B 298, 1982, pp.543-561.
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23, 1997, pp. 65-80.
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10. Amann, R. I. “Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial
cells without cultivation”. Microbiol. Rev. 59: 1995, pp.143-169.
* Agradecimiento: CONACYT proyecto Z 019 por el financiamiento a esta investigación. Beatríz Mónica Pérez Ibarra es becaria
CONACYT.
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