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"Investigación en heterocigotas de la Gangliosidosis GM2, tipo II (Enfermedad de Sandhoff). Definition genot(pica y caracterización bioquimica de las isoenzimas del sistema de la fl Hexosaminidasa Dra. Ana Maria Oller de Ramirez Resumen Introducción. La Enfermedad de Sandhoff o Gangliosidosis GM2 , Tipo 2, es causada por mutaciónes en el gen HEXB, el cual codifica para la subunidad f de las isoenzimas de la Hexosaminidasa (Hex). Esta enfermedad, aunque rara en la población general, fue reconocida en diferentes grupos étnicos. Al presente, la mayor frecuencia registrada a nivel mundial se encuentra en la comunidad criolla del Valle de Traslasierra de Córdoba, Argentina. La frecuencia de heterocigotas en dicha región fue estimada en 1 por cada 16 - 29 individuos (De Kremer y col., 1987). Objetivos. Los objetivos de este trabajo fueron 1) Medir la actividad de la Hex para definir los genotipos con respecto al gen HEXB de los individuos de la población de riesgo y de la población general. 2) Estudiar la causa de la variación de la actividad enzimática observada entre los distintos grupos de heterocigotas de Sandhoff y 3) Analizar la relación entre el fenotipo bioquimico y el genotipo molecular de esos individuos. Individuos analizados. a) Grupo control normal de referencia: el cual estuvo constituido por individuos normales sanos. El análisiss fue realizado en 134 muestras de plasma y 68 muestras de leucocitos. b) Grupo heterocigotas de Sandhoff referenciales: Este grupo estuvo constituido por 31 portadores de Sandhoff obligados (padres de niños con Enfermedad de Sandhoff) de 18 familias pertenecientes a la zona de riesgo. c) Grupo de estudio: estuvo constituido por miembros (92 personas) de las familias con antecedentes de la enfermedad y por 66 individuos normales de la zona de riesgo sin antecedentes de enfermedad. Resultados. El alto numero de heterocigotas de Sandhoff, que excede ampliamente a las descripciones bibliográficas de origen foraneo, brindaron una extraordinaria oportunidad para establecer los valores referenciales de actividad de la Hex. Se obtuvieron los rangos de actividad enzimática para el estado de portador. En base a los valores de actividad del grupo de heterocigotas referenciales, se identificaron 55 nuevos individuos heterocigotas. La determinación de la actividad de la Hex Total y Hex B, tanto en plasma como en pella leucocitaria se realizo por procedimienios f uorogenicos. La actividad Hex B resulto ser el parámetro de identificación del estado de heterocigota. En aquellos casos donde la actividad medida en plasma se encontró en la zona "gris" (zona de actividad para controles normales y heterocigotas), la definición genotipica se realizo a través del valor de Hex B leucocitaria. Los heterocigotas obligados y los nuevos heterocigotas detectados en el "grupo de estudio" mostraron un amplio espectro de variación en la actividad de Hex B. Un grupo de heterocigotas (5 individuos) quienes tuvieron los valores mas bajos de Hex B en plasma y leucocitos presentaron una mutación en un sitio de "splice" G-+ A (G-. A) y una deleción TG (ATG) en la región 3' no traducida del gen (3' RNT), genotipo G - A//TG. El resto de los heterocigotas (50 individuos), salvo 3 portadores obligados con ascendencia italiana cuyas mutaciones aun no fueron identificadas, presentaron solamente la mutación G- A, genotipo GA/WT. A un grupo de 8 individuos se le identificó solamente la mutación ATG en la 3' RNT, genotipo ATG/WT. Excepto para este ultimo grupo, los resultados obtenidos indicaron que existe una absoluta correlación entre los tests enzimáticos, empleados para determinar el genotipo portador y los análisis de ADN para detectar las mutaciones en el gen HEXB. En el caso de los heterocigotas ATG/WT, ellos no pueden ser sistematicamente detectados midiendo la actividad de la Hex de plasma y a veces aun de leucocitos. Al presente el unico metodo seguro de diagnostico para esta mutación es el análisis de ADN. Se realize el análisis isoenzimático para cada grupo genotipico de portadores. La Hex plasmatica fue separada en 3 picos enzimáticos, Hex B, Hex I y Hex A a través de la cromatografia de intercambio ionico. La cuantifcación la actividad de cada una de las isoenzimas fue determinada y comparada con los valores obtenidos de los controles normales. En muestras correspondientes a los heterocigotas "Bajos" (genotipo G'A/ATG) se evidencio una gran disminución en todas las isozimas, mientras que en los heterocigotas "Altos" (genotipo Gi A/WT) y "Muy Altos" (genotipo ATGIWT), la actividad de las isozimas Hex I y Hex A estuvieron incrementadas, permaneciendo la Hex B disminuida. La cromatografia de enfoque file empleada para separar, cuantificar y determinar los pI de las isoenzimas de la Hex de plasma y leucocitos. Uno de los hallazgos relevantes fue detectar la presencia de la isoenzima Hex S en muestras plasmáticas en controles normales (9 % de la Hex Total). En los portadores, esta enzima también fue encontrada con valores superiores a los controles. La actividad de Hex S plasmática en relación a la Hex Total fue de un 20 % en los heterocigotas "Bajos", 10 % en los heterocigotas "Altos" y 5 % en los heterocigotas "Muy Altos". Datos no publicados previamente. También se encontraron cambios en los pI de las Hex A y Hex I de plasma en los heterocigotas "Muy Altos". La identidad de la Hex S fue verificada por analizar esta enzima de leucocitos de enfermos de Sandhoff. La actividad de Hex S de leucocitos en relación a la Hex Total fue de un 16 % en controles normales, un 55 % en heterocigotas "Bajos", 44 % en los "Altos" y 35 % en los "Muy Altos". Otros hallazgos sobresalientes fueron la similitud encontrada entre los enfermos de Sandhoff (genotipo Go. A/ G -+ A) y los heterocigotas "Bajos". En ambos grupos se encontró: a) un alto porcentaje de Hex S (59 y 55 %, respectivamente), b) la presencia de 2 picos de actividad de Hex S con pI 4.3 y 3.6, c) igual labilidad al calor de la Hex S d) igual pI de la Hex B. Conclusiones. o Se logro realizar la definición genotipica del estado de portador de Sandhoff en base a la combinación de Tests bioquimicos - Tests moleculares. o Se determine que la causa de la variaci6n de actividad de Hex observada entre los heterocigotas puede ser debida: a) un efecto compensatorio realizado por los genes normales de la Hex y b) por la presencia de distintas mutaciónes. >> Se encontro por primera vez la presencia de Hex S en plasma y leucocitos de individuos normales y heterocigotas. La proporción de Hex S de los Heterocigotas "Bajos" fue similar a la de los enfermos de Sandhoff. o Se evidencio que la mutación ATG (no descripta en la bibliografa) afecto la actividad enzimática de la Hex. Se encontro en muestras de individuos con esa mutación un cambio en el pI y comportamiento al calor de las isoenzimas, aunque hasta el presente no es posible conocer si la deleci6n TG es la causa de esos efectos. o Se conoce que el genotipo G-. A/ATG no es responsable para una enfermedad de Sandhoff típica pero se desconoce si puede producir un fenotipo adulto de Sandhoff o si la mutación ATG en homocigosis puede producir una nueva variante de la enfermedad.