Download Practica-5-Actividad-de-la-enzima-succinato-DH

UNIVERSIDAD
AUTÓNOMA
DE CHIAPAS
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA
DE CHIAPAS
Facultad de ciencias químicas
IV (Extensión
Ocozocoautla)
Facultad Campus
de ciencias
químicas
Campus
IV (Extensión Ocozocoautla)
Profesor: Dra. Ana Olvia Cañas Urbina
Licenciatura: Químico Farmacobiólogo
Alumna:
Espinoza López Yuridia
Gómez Pérez Maritza Elizabeth
Hernández Nigenda Diana Laura.
Morales Gonzáles Ana Laura.
Zamayoa Espinosa Aida Patricia
Cuarto semestre
Ocozocoautla de Espinosa Chiapas
BIOQUIMICA
Noviembre del 2015
4° Semestre
1
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
Facultad de ciencias químicas
Campus IV (Extensión Ocozocoautla)
INTRODUCCIÓN
Una oxidorreductasa es una enzima que cataliza la transferencia de electrones
desde una molécula donante (el agente reductor) a otra aceptora (el agente
oxidante) (Jenner Us Martin, 2014). Según González nos dice que las enzimas
oxidorreductasas catalizan reacciones de oxidorreducción, es decir, transferencia
de hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro, según la reacción general:
Ejemplos son la succinato deshidrogenasa o la citocromo oxidasa.
Según Sierra en el 2013 nos dice que las células de la gran mayorías de los
organismos vivos llevan a cabo un conjunto de reacciones de óxido reducción
mediante la cual la gran cantidad de energía liberada a través de la degradación
de moléculas orgánicas es almacenada en moléculas de alto nivel energético
(ATP). La succinato deshidrogenasa es una enzima clasificada dentro del grupo
de las oxidorreductasas, cataliza una reacción muy importante en el metabolismo
oxidativo de la célula: la conversión del succinato en fumarato. Esta enzima se
localiza en eucariontes en la membrana mitocondrial interna. El H2 cedido por el
succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante susceptible como el
azul de metileno que al cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro o
viceversa. Según Gonzalez en el 2010 nos dice la coloración de la oxidación y
reducción del azul de metileno al cambiar su estado redox.
Indicador
Azul de metileno
BIOQUIMICA
Color (reducido) Color (oxidado)
Incoloro
Azul
4° Semestre
2
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
Facultad de ciencias químicas
Campus IV (Extensión Ocozocoautla)
Figura 1.- Reacción del succinato deshidrogenasa del Manual de laboratorio. Bioquímica.
Facultad de Ciencias Químicas Extensión Ocozocoautla. UNACH, citado por Cañas en el 2015.
La succinato deshidrogenada remueve 2H+ y 2 electrones del succinato para
formar fumarato y la coenzima reducida (FADH2). La enzima está sujeta a una
poderosa inhibición competitiva por parte de reactivos como el fenol lo cual
constituye una manera de inhibir la actividad de la enzima a nivel de laboratorio
(Sierra, 2013). Para estudiar el transporte de cargas en la reacción se empleó un
aceptor artificial de electrones (azul de metileno), cuya decoloración permite
diferenciar la actividad enzimática en los ensayos a realizar en la presente
práctica.
OBJETIVO
Que el alumno aprecie la actividad de le enzima Succinato Deshidrogenasa
mediante una reacción colorimétrica.
MATERIALES Y MÉTODO
MATERIALES
2 tubos de ensaye
BIOQUIMICA
Baño maría a 50°C
4° Semestre
3
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
Facultad de ciencias químicas
Campus IV (Extensión Ocozocoautla)
pipetas de 5ml
Pinzas para tubo de ensaye
Reactivos
 NaOH
 Azul de metileno al
0.1%
 Acido succínico
 Aceite mineral
 Fenol al 90%
 Hígado de pollo
METODOLOGÍA
Pesar 1g de hígado
de pollo.
En el mortero molerlo
con 3 o 4 ml de ácido
succínico, hasta obtener
una masa.
Transferir en partes
iguales a 2 tubos.
Incube ambos tubos
por 10 minutos en el
baño maría (50%)
Observe los cambios
BIOQUIMICA
4° Semestre
4
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
Facultad de ciencias químicas
Campus IV (Extensión Ocozocoautla)
RESULTADO
Concentraciones:
𝒈 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕𝒐:
(𝒑𝒐𝒓𝒄𝒆𝒏𝒕𝒂𝒋𝒆 𝒆𝒏 𝒎𝒂𝒔𝒂 ) (𝒈 𝒅𝒆 𝒅𝒊𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏)
𝟏𝟎𝟎
𝒈 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕𝒐:
(𝟗𝟎 % ) (𝟐𝟎𝒈 )
= 𝟏𝟖 𝒈 𝒅𝒆 𝒇𝒆𝒏𝒐𝒍
𝟏𝟎𝟎 %
Se necesitan 18 g de fenol en 20 ml de disolución.
𝒈 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕𝒐:
(𝟑 % ) (𝟓𝟎 𝒈 )
= 𝟏. 𝟓 𝒈 𝒅𝒆 á𝒄𝒊𝒅𝒐 𝒔𝒖𝒄𝒄𝒊𝒏𝒊𝒄𝒐
𝟏𝟎𝟎 %
Se necesitan 1.5 g de ácido succínico en 50 ml de disolución.
Tubo 1: Con fenol
Tubo 2: Sin fenol.
Ilustración 2: El tubo 1 contiene fenol y
el tubo 2 no contiene. En el tubo 2
hubo cambio de coloración a
transparente y en el tubo 1 no hubo
separación y además formo un halo a
incoloro. Después de calentar a baño
maría.
BIOQUIMICA
4° Semestre
5
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
Facultad de ciencias químicas
Campus IV (Extensión Ocozocoautla)
DISCUSION DE RESULTADOS
En la práctica, se utilizó 1 gramo de hígado de pollo y se mezcló con ácido
succínico; esto se hizo debido a que en el hígado se encuentra la enzima de
interés, es decir, la enzima succinato deshidrogena y el ácido succínico es el que
nos ayudó a reducir el azul de metileno en lugar del succinato. (Alberto, 2012)
Después de mezclar el hígado con ácido succínico, obtuvimos una masa que fue
repartida por partes iguales en dos tubos de ensayo; a uno de los tubos se le
añadió fenol (tubo 1), el cual ayudo a inhibir la actividad de la enzima ya que
ocurre una desnaturalización.
En este paso se observó que el tubo 1 (con fenol), separó la masa de hígado con
ácido succínico del fenol agregado.
Posteriormente, se agregó azul de metileno a los dos tubos, haciendo que el tubo
1 se coloreara de azul y el tubo 2 (sin fenol) se coloreara de café, este paso se
realizó, ya que el azul de metileno fue el aceptor de electrones del complejo
succinato-FADH2.
Después, se agregó aceite de bebé, ya que contiene aceite mineral, este se
encargó de aislar los dos tubos de ensayo del aire del ambiente y así prevenir la
oxidación temprana del FADH2. (Alberto, 2012)
Finalmente, se calentó a baño María por 10 minutos a 50°C con el fin de que la
enzima fuera liberada de la mitocondria.
En general, cada uno de los reactivos desempeño una función importante en la
realización de la práctica, como resultado final se obtuvieron dos tubos uno de
color transparente (tubo 2) y en el otro se formó un halo incoloro (tubo 1), en
ambos la enzima succinato deshidrogenasa o deshidrogenasa del ácido succínico
actuó como una oxidorreductasa, ya que cataliza la oxidación del succinato para
formar fumarato siendo la coenzima el FAD.
El succinato cedió un H2 que es transferido del FADH2 al azul de metileno, por lo
que este cambio su estado redox de coloreado a incoloro o viceversa. (Alvarado &
et. Al. 2008)
BIOQUIMICA
4° Semestre
6
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
Facultad de ciencias químicas
Campus IV (Extensión Ocozocoautla)
CONCLUSIÓN.
Se logró llegar al objetivo debido a que se obtuvo como se esperaba una
decoloración en el tubo 2, ya que hubo una reducción del azul de metileno que
fueron cedidos desde el FADH2 obteniendo FAD oxidado y azul de metileno
reducido, y en el tubo 1 no hubo una decoloración debido a la inhibición del
fenol, con la realización de esta práctica se comprobó la acción de la enzima
succinato deshidrogenasa.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son los colores del azul de metileno en sus estados oxidado y
reducido?
En estado reducido el color es azul y en su estado oxidado es incoloro.
2. ¿Cuál es la función del fenol en la reacción?
El fenol inhibe la actividad de las enzimas ya que desnaturaliza las proteínas,
en este caso
actividad.
a la enzima deshidrogenasa, provocando la pérdida de su
3. ¿En qué vía metabólica está involucrada la enzima succinato
deshidrogenasa? Lista los activadores, inhibidores, Km y mecanismo de
rx de ésta enzima
La oxidación del succinato a fumarato está involucrada en la reacción 6 del
ciclo de Krebs.
Activadores: α glicerofosfato, acido beta oxibutirico, isocitrato y proteína SDHA
F2.
Inhibidores: 2-Oxoglutarato, oxalato y ácido oxaloacético
Km: 0.3 mM
En la succinato deshidrogenasa el anillo isoaloxazina del FAD está unido
covalentemente a la cadena lateral de una histidina del enzima. El FAD es el
aceptor de hidrógeno en esta reacción por que el cambio de energía libre es
insuficiente para reducir al 𝑁𝐴𝐷 + .
BIOQUIMICA
4° Semestre
7
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
Facultad de ciencias químicas
Campus IV (Extensión Ocozocoautla)
REFERENCIAS
Alberto.(04 de marzo de 2012).Determinación de la actividad de succinato
deshidrogenasa.
Recuperado
de
http://www.buenastareas.com/ensayos/Determinaci%C3%B3n-De-La-ActividadDe-Succinato/3600966.html.
Alvarado
&
et.al.
(2008).
BIOQUIMICA
II.
Obtenido
de
http://quimicosfarmacobiologos.bligoo.com.mx/media/users/10/523320/files/51871/
Ma.
BRENDA. (2015). Información sobre EC 1.3.99.1 - succinato deshidrogenasa.
Recuperado el 07 de noviembre de 2015 de: http://www.brendaenzymes.org/enzyme.php?ecno=1.3.99.1&Suchword=succinato+deshidrogenasa&
organism%5B%5D=#INHIBITORS
Berg, J., Tymoczko, J. & Stryer, L. (2008). Bioquímica. El oxalacetato se regenera
por oxidación del succinato. (pp. 487-488). Barcelona: Reverté. Recuperado de:
https://books.google.com.mx/books?id=HRr4MNH2YssC&pg=PA487&lpg=PA487&
dq=MECANISMO+DE+RX+DEL+SUCCINATO+DESHIDROGENASA&source=bl&
ots=LUtJN3Ci9x&sig=jdxTYlxJ-6wXAD96uB9SGdTllc&hl=es&sa=X&ved=0CCwQ6AEwA2oVChMI044uN3_yAIVwUImCh11BQsz#v=onepage&q=MECANISMO%20DE%20RX%20DEL
%20SUCCINATO%20DESHIDROGENASA&f=false
Cañas, A. (2015). Reacción del succinato deshidrogenasa del Manual de
laboratorio. Bioquímica. Facultad de Ciencias Químicas Extensión Ocozocoautla.
UNACH. Obtenido de: https://anacanas.files.wordpress.com/2015/09/prc3a1ctica5.pdf
González, J (s.f.). CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS.
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz13.htm#c1
Obtenido
de:
González, M. (2010). Química. Indicador redox. Recuperado el 07 de noviembre
de 2015 de: http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/indicador-redox
Gonzalez, M. (26 de Octubre de 2010). Indicador redox. Obtenido de:
http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/indicador-redox
Jenner Us Martin. (12 de marzo de 2014). Oxidorreductasa. Obtenido de:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz13.htm#c1
BIOQUIMICA
4° Semestre
8
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
Facultad de ciencias químicas
Campus IV (Extensión Ocozocoautla)
Sierra, I. (28 de junio de 2013). Practica transporte de cargas 7. Obtenido de:
http://es.slideshare.net/ingridjohanasierramejia/practica-transporte-de-cargas-7
BIOQUIMICA
4° Semestre
9