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LABORATORIO DE BIOQUIMICA 502504
GUIA No 6.1- Enzimas mitocondriales : citocromo oxidasa y succínico deshidrogenasa
I. EL PROBLEMA.
Identificar la actividad de algunas enzimas específicas presentes en el tejido animal como la
citocromo oxidasa y la succínico deshidrogenasa, mediante el uso de aceptores electrónicos
coloreados e identificar el efecto inhibitorio de algunas sustancias sobre este sistema
enzimático.
II. BÚSQUEDA DE INFORMACIÓN.
-
Exprese en forma de ecuación química las reacciones que catalizan las enzimas que se
estudiaran en esta práctica.
Realice la ficha técnica de los reactivos a utilizar en esta práctica, los cuales se especifican
en el numeral 4.
III. FUNDAMENTO TEORICO.
Cadena de transporte de electrones:
La cadena de transporte de electrones o fosforilación oxidativa es un proceso que se lleva a
cabo en la membrana interna mitocondrial y está constituido por una serie de complejos
enzima-coenzima de oxidorreductasas y ferroproteínas. El complejo citocromo oxidasa es el
componente final de la cadena y está constituido por el citocromo a y a3 y dos iones Cu (II).
Aproximadamente el 90% del consumo celular de oxígeno se debe a la acción de este
complejo. Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores electrónicos más fuertes como
el cianuro, azida y monóxido de carbono, entre otros, los cuales inhiben irreversiblemente este
complejo enzimático y se interrumpe el transporte de electrones produciéndose una cianosis
celular.
La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidación de
sustancias como la p-fenilendiamina (pFDH2) en presencia del sistema de citocromos. Esta
sustancia es muy reactiva así que se condensa y polimeriza fácilmente originando mezclas de
pigmentos oscuros.
El ciclo de Krebs y la succínico deshidrogenasa (SDH)
La succínico deshidriogenasa es una enzima que se encuentra asociada a la membrana
interna de la mitocóndria, esta remueve 2 protones y 2 electrones del succinato para dar origen
al fumarato, oxidación asociada a la coenzima FAD, que transfiere los electrones a la cadena
de transporte de electrones. Este proceso es inhibido en forma competitiva con la presencia de
otros ácidos dicarboxílicos como el malonato, malato, oxalacético y oxálico, los cuales se unen
fuertemente al sitio activo de la enzima, lo que genera la acumulación de succinato.
El proceso se puede evidenciar in vitro mediante el uso e un aceptor electrónico artificial como
el azul de metileno, que es coloreado cuando se encuentra oxidado e incoloro cuando se
reduce, en la medida en que se reoxida la coenzima FAD. Cuando el azul de metileno se
encuentra en contacto con el oxígeno del aire, se reoaxida tomando la coloración azul y
formando peróxido de hidrógeno, por esta razón el sistema se aísla mediante una capa de
aceite mineral.
IV. MATERIALES Y REACTIVOS.
Material por grupo de laboratorio.
-
10 tubos de ensayo
dos erlenemeyer de 150ml
un vaso de precipitados de 500ml
Un mortero con mano
Cuatro pipetas de 5ml
Cinco pipetas de 2ml
Dos tubos de centrífuga
Una gradilla
Un pipeteador
Materiales y reactivos generales. (volúmenes calculados para 10 grupos de laboratorio)
-
Arena lavada
Buffer fosfato 0,1M y pH 7.4 (300ml)
Solución malonato de sodio 1% (100ml)
Solución cianuro de potasio 0,05M (50ml) PELIGROSO
Solución de p-fenilendiamina al 1% (100ml)
Solución de succinato de sodio al 1% (100ml)
Solución de azul de metileno 0,01% (100ml)
Aceite mineral (200ml)
Agua destilada
Baño de maría termostatado a 37ºC
Tejido hepático fresco
Tejido cardiaco fresco
Tejido muscular fresco
V. PROCEDIMIENTO.
1. Extracción y preparación de las enzimas y coenzimas.
Tomar una muestra de aproximadamente 5g de tejido libres de sangre y colocarlos en un
mortero con arena lavada, macere cuidadosamente hasta formar una masa suave adicionando
poco a poco tres porciones (cada una de 5ml) de buffer fosfatos hasta completar un volumen
aproximado de 15ml.
Transfiera la mezcla a un erlenmeyer de 150ml y manténgalo en un baño con hielo durante 15
minutos, mezclando ocasionalmente. Pase la muestra a tubos de centrífuga y centrifugue a
1500 rpm por 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a otro erlenmeyer de 150ml y márquelo
como extracto enzimático y manténgalo en baño de hielo hasta su posterior uso.
2. Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa:
Prepare una serie de tubos debidamente marcados según las indicaciones de la Tabla No 1.
TABLA No 1.
REACTIVO (ml)
Buffer fosfato pH 7.4
Malonato de sodio 1%
Cianuro de potasio 0,05M
Agua destilada
Extracto enzimático
p-fenilendiamina 1%
B
1,0
0,0
0,0
2,0
1,0
0,0
1
1,0
0,0
0.0
1.0
1.0
1.0
2
1,0
0,0
1.0
0.0
1.0
1.0
3
1,0
1,0
0.0
0.0
1.0
1.0
Mezcle bien el contenido de cada tubo e incube a 37ºC hasta cuando aparezca el complejo
coloreado. Observe y anote los resultados obtenidos en cada tubo.
3. Seguimiento de la reacción catalizada por la succinico deshidrogenasa:
Prepare una serie de tubos debidamente marcados según las indicaciones de la tabla No 2.
TABLA No 2.
Reactivo (ml)
Buffer fosfato pH 7.4
Succinato de sodio 1%
Azul de metileno
Malonato de sodio 1%
B
3.0
0.0
0.5
0.0
1
2.5
1.0
0.5
0.0
2
2.0
1.0
0.5
0.0
3
1.5
1.0
0.5
0.0
4
1.0
1.0
0.5
1.0
Extracto enzimático
Aceite mineral
1.0
1.0
0.5
1.0
1.0
1.0
1.5
1.0
1.0
1.0
Antes de agregar el extracto enzimático, deje los tubos incubando a 37ºC durante 10 minutos, y
sin retirarlos del baño agregue el extracto enzimático, inmediatamente agite bien y coloque el
aceite mineral.
Tome como tiempo cero el momento en que colocó el extracto enzimático y anote el tiempo
requerido para la decoloración de cada tubo. Anote los resultados de cada tubo.
VI. PARA EL ANÁLISIS DE LA PRACTICA.
-
Datos y observaciones debidamente tabulados
Análisis de las observaciones de la práctica
Revise de nuevo los objetivos de la práctica y evalúe si se cumplieron total o parcialmente,
y redacte unas conclusiones en donde exprese en forma clara lo aprendido.
VII. BIBLIOGRAFÍA.
-
Plummer, D. Bioquímica práctica,1981. Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana, México.
Bohinski, R.C. Bioquímica.1998. Quinta Edición, Pearson Educación. México.