Download Análisis de alimentos y agua de consumo del comedor del ITM

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MORELIA ¨JOSÉ MARÍA MORELOS Y PAVÓN¨
Análisis de alimentos y
agua de consumo del
comedor del ITM
Presenta:
Yadira Belmonte Izquierdo
6 de Diciembre de 2012
ANÁLISIS DE ALIMENTOS Y AGUA DEL COMEDOR DEL ITM
ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS CONTAMINADOS
Desde hace bastante tiempo se ha reconocido a los alimentos y el agua como portadores potenciales
de enfermedades, las cuales surgen tras la ingestión de patógenos o de sus toxinas.
Los alimentos frescos son alterados por una amplia variedad de bacterias y hongos, cada tipo de
alimento es colonizado generalmente por un microrganismo en particular. Sin embargo, el
crecimiento de los microorganismos en los alimentos es muy variable, pues depende de la. Además
es necesario un tiempo determinado para que la densidad poblacional del microrganismo alcance
un nivel significativo en el producto alimenticio, relacionado con el inóculo inicial y con la tasa de
crecimiento durante la fase exponencial. Para que la alteración del alimento sea perceptible, es
necesario contar con una densidad poblacional elevada, de no ser así pasa desapercibida.
Durante el procesamiento de alimentos es necesario cumplir con normas de sanitización e higiene,
ya que si ocurre un fallo en la correcta manipulación, descontaminación o conservación de los
mismos, puede permitirse el crecimiento y desarrollo de patógenos, resultando en enfermedades
con alta morbilidad y mortalidad.
Las enfermedades que se transmiten por medio de los alimentos se clasifican en:
 Intoxicación alimentaria. Es la enfermedad que resulta de la ingestión de alimentos que
contienen toxinas generadas por los microrganismos, los cuales no necesariamente crecen
en el hospedador. Por ejemplo las toxinas de Clostridium botulinum y las de Staphylococcus
aureus.
 Infección alimentaria. Es la enfermedad que resulta de la infección activa resultante de la
ingestión de un alimento contaminado por un patógeno. Además de la ingesta pasiva de
toxinas el alimento posee un número elevado de microrganismos patógenos vivos que
ocasionan la infección y enfermedad del hospedador. Por ejemplo Salmonella.
Dentro de los microrganismos patógenos más importantes presentes en alimentos contaminados
se encuentran: Escherichia coli O157:H7, Salmonella, Staphylococcus, Shigella y Clostridium
botulinum.
Staphylococcus
Staphylococcus aureus y otros miembros del género son Gram positivos, localizados en la piel y el
tracto respiratorio de los humanos, considerados patógenos oportunistas. Este tipo de Gram
positivos se asocia con intoxicaciones alimentarias porque produce 7 enterotoxinas proteicas
termoestables (aun cuando el alimento es cocinado la toxina seguirá presente, las cuales son
liberadas en el medio colindante (alimentos). Si el alimento contaminado es ingerido, entre 1 y 6
horas después comenzarán a aparecer los síntomas de la gastroenteritis (náuseas, vómitos y
diarrea).
Salmonella
Salmonelosis es una enfermedad gastrointestinal transmitida por los alimentos, los síntomas
aparecen después de la colonización del epitelio intestinal por el patógeno. Salmonella es una
bacteria Gram negativa relacionada con Escherichia coli, Shigella y otras bacterias entéricas.
Salmonella habita el intestino de los animales y hombres, y por ende las aguas residuales. Todas las
especies de Salmonella son patógenas para el humano, específicamente S. typhi provoca la fiebre
tifoidea. La ingestión de alimentos conteniendo 105 – 108 viables de Salmonella provoca la
colonización del intestino delgado y grueso. El tiempo de incubación es de 8 a 48 h. Entre los
síntomas principales se encuentran: dolor de cabeza, escalofríos, vómitos, diarrea y fiebre.
Escherichia coli
Es una bacteria Gram negativa que habita el intestino de los animales. Existen alrededor de 200
cepas patógenas de este microrganismo que ocasionan enfermedades diarreicas y del tracto
urinario (se transmite por alimentos mal cocinados). Existe una cepa en particular (E. Coli 0157:H7),
que puede crecer en el intestino delgado y producir una verotoxina que genera la diarrea
hemorrágica.
Shigella
Bacteria Gram negativa patógena para los humanos. La enfermedad de este microrganismo inicia
con la ingestión de alimentos contaminados, ocasionando disentería (trastorno del colon), que
resulta en destrucción de las células epiteliales. Algunas especies producen una endotoxina y la
toxina Shiga, similar a la verotoxina de la E. coli O157:H7. La enfermedad se caracteriza por presentar
vómitos, nauseas y fiebre.
Es importante destacar que la intoxicación alimentaria por estos microrganismos puede ser
prevenida mediante cuidadosas medidas sanitarias y de higiene, tanto en la producción,
preparación y almacenamiento de los alimentos (Madigan et al., 2002; Prescott et al., 2002).
MEDIOS DE CULTIVO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
PATÓGENOS
Para detectar la presencia de microrganismos patógenos se deben tomar muestras de interés que
se traten a la brevedad. Posteriormente, es necesario inocular dichas muestras en medios
enriquecidos, seguidos de medios diferenciales o selectivos para su aislamiento e identificación.
Medios para identificación de Coliformes
Caldo lactosado
Es utilizado para el cultivo de Salmonella y organismos coliformes en agua, productos lácteos,
alimentos y productos farmacéuticos. Es frecuentemente utilizado como un medio de preenriquecimiento en la búsqueda de Salmonella en alimentos y derivados lácteos, lo cual permite
reparar el daño celular y diluir las sustancias tóxicas e inhibidoras proporcionando factores
nutricionales especialmente para el desarrollo de Salmonella. En este medio el extracto de carne y
la peptona proporcionan la fuente de carbono y nitrógeno. La lactosa es el carbohidrato
fermentable.
Verde Brillante Bilis 2% Caldo
Este medio está recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, por la técnica del
número más probable. La peptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la
bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram
positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono
fermentable.
E. C. Medio.
Medio utilizado para el recuento de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli en agua,
alimentos y otros materiales. El contenido de lactosa favorece el crecimiento de bacterias lactosa
positivas, mientras que las sales biliares inhiben el crecimiento de gran parte de la flora
acompañante.
Agar E.M.B.
Medio utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y
escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae. Donde la eosina y azul de metileno ejercen un efecto inhibitorio sobre las
bacterias Gram positivas. Cepas como Escherichia coli y Citrobacter presentan un característico
brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada,
mientras que las que no lo hacen son incoloras.
Medios para identificación de Staphylococcus, Salmonella Y Shigela
Caldo nutritivo
Es utilizado para procedimientos en el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia
sanitaria. Es un medio no selectivo, contiene pluripeptona y extracto de carne que constituyen la
fuente de carbono y nitrógeno necesarios para el desarrollo bacteriano. Además es utilizado como
cultivo de preenriquecimiento en la búsqueda de Salmonella a partir de alimentos, ya que permite
recuperar células dañadas, diluir metabolitos tóxicos y sustancias inhibitorias.
Agar Salmonella-Shigella
Es un medio selectivo y diferencial, la selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante,
que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo
invasor del Proteus spp. Es diferencial porque las colonias fermentadoras de lactosa producen ácidos
y cambian el color del medio a rosa. Como Shigella y Salmonella no utilizan este azúcar forman
colonias transparentes. El tiosulfato es la fuente de azufre para la producción de ácido sulfhídrico
de las bacterias sulfato-reductoras, el cual reacciona con la sal de hierro y se forma sulfuro de hierro
de color negro. Las colonias de Salmonella se observan transparentes con un precipitado negro en
el centro.
Agar MacConkey
Es un medio selectivo y diferencial recomendado para el cultivo y aislamiento de microorganismos
Gram negativos a partir de muestras clínicas, de alimentos, agua, productos lácteos y productos
farmacéuticos. En este medio se aislan y diferencían bacilos entéricos Gram negativos
fermentadores y no fermentadores de la lactosa. La fórmula de este agar permite detectar la
presencia de colonias de Salmonella y Shigella. Contiene cristal violeta y sales biliares como
inhibidores de organismos Gram positivos. Las colonias aisladas de bacterias que fermentan la
lactosa son rosadas, mientras que las colonias que no fermentan la lactosa (como las de S. typhi, S.
paratyphi y S. disentery) permanecen incoloras.
Estafilococo Medio 110
Medio selectivo para el aislamiento y diferenciación presuntiva de estafilococos, en base a la
producción de pigmentos, la fermentación de manitol y la hidrólisis de gelatina, a partir de alimentos
y otras muestras. En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los nutrientes
para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración,
inhibiendo el desarrollo de la flora acompañante excepto Staphylococcus spp.
METODOLOGÍA
Se tomaron muestras de tres alimentos (chilaquiles, burritos y fruta picada) y una
bebida (agua de horchata). Todos fueron adquiridos como ¨una comida normal¨ en
el comedor. Sin embargo, los alimentos tras ser entregados fueron almacenados en
una bolsa hermética estéril, en el caso del agua, la bolsa que lo contenía fue
amarrada con la menor cantidad de aire posible. Posteriormente bajo condiciones
asépticas en el laboratorio fue de vertida en un frasco de vidrio estéril.
En el caso de los alimentos fue necesario realizar un licuado en seco de los mismos
bajo condiciones rigurosas de asepsia. Los vasos de la licuadora se hirvieron por 20
min. *Es importante destacar que se introdujeron de forma discreta 3 tubos con medio nutritivo al comedor.
Metodología para detección de Staphylococcus.
Metodología para detección de Salmonella
Metodología para detección de Shigella
Metodología para detección de Coliformes.
RESULTADOS DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
Determinación de coliformes presuntiva utilizando caldo lactosado (CL).
Dilución
Muestra
(CL-1)
(CL-0.1)
(CL-0.01)
NMP
NMP/ml
NMP/100 ml
A
5
5
5
>161
>1610
>161000
F
5
5
4
161
1610
161001
C
5
4
4
35
350
35000
B
5
5
5
>161
>1610
161001
A= Agua
C=Chilaquiles
F=Fruta
B=Burritos
Determinación de coliformes totales confirmativa utilizando lactosado bilis verde
brillante (LBVB).
Dilución
Muestra
(LBVB-1)
(LBVB-0.1)
(LBVB-0.01)
NMP
NMP/ml
NMP/100 ml
A
5
5
5
>161
>1610
>161000
F
4
3
1
3.3
33
3300
C
4
3
1
3.3
33
3300
B
5
4
4
35
350
35000
A= Agua
C=Chilaquiles
F=Fruta
B=Burritos
Determinación de coliformes fecales confirmativa utilizando caldo E. coli (EC).
Dilución
Muestra
(EC-1)
(EC-0.1)
(EC-0.01)
NMP
NMP/ml
NMP/100 ml
A
5
5
5
>161
>1610
>161000
F
4
3
1
3.3
33
3300
C
4
2
1
2.6
26
2600
B
5
A= Agua
C=Chilaquiles
F=Fruta
B=Burritos
2
2
9.4
940
9400
RESULTADOS DEL SEGUIMIENTO DE pH
De los tubos inoculados en medio CL.
pH (27 de Noviembre de 2012)
pH (28 de Noviembre de 2012)
Muestra
(CL-1)
(CL-0.1)
(CL-0.01)
(CL-1)
(CL-0.1)
(CL-0.01)
A
7
7
7
5.5
5.5
5.5
F
6.5
6.5
6.5
3
3
3
C
6.5
6.5
6.5
4
5
5
B
6.5
6.5
6.5
5
5
5.5
A= Agua
C=Chilaquiles
F=Fruta
B=Burritos
De los tubos inoculados en medio LBVB
pH (28 de Noviembre de 2012)
pH (29 de Noviembre de 2012)
Muestra
(LBVB-1)
(LBVB-0.1)
(LBVB-0.01)
(LBVB-1)
(LBVB-0.1)
(LBVB-0.01)
A
6
6
6
5
5
5
F
6
6
5
5.5
5
5
C
6
6
6
4
4.5
5
B
6
6
6
6
5
5
A= Agua
C=Chilaquiles
F=Fruta
B=Burritos
De los tubos inoculados en medio EC
pH (28 de Noviembre de 2012)
pH (29 de Noviembre de 2012)
Muestra
(EC-1)
(EC-0.1)
(EC-0.01)
(EC-1)
(EC-0.1)
(EC-0.01)
A
7
7
7
5
5
5
F
7
7
7
5
5
6
C
6.5
6.5
6.5
5.5
6
6
B
7
7
7
5
5
5
A= Agua
C=Chilaquiles
F=Fruta
B=Burritos
RESULTADOS DEL CRECIMIENTO EN MEDIOS DE CULTIVO
De los tubos positivos para coliformes fecales en medio EC obtuvimos una cepa
verde brillante en EMB, parecida a la que se muestra en fotografías de literatura en
el mismo medio.
Figura 1. Cepa de E. coli literatura (izquierda), cepa encontrada en chilaquiles (intermedia), cepa
encontrada en agua (derecha).
En medio McConkey obtuvimos colonias rosadas, por lo tanto indica la presencia de
bacterias que fermentan la lactosa, lo cual nos lleva nuevamente a la presencia de
enterobacterias como E. coli.
Figura 2. Colonias de color rosado (fermentadoras de lactosa), Salmonella y Shigella no fermentan la
lactosa.
En medio SS obtuvimos colonias amarillitas con pigmentación de color negro (en la
foto se percibe muy poco), sin embargo nos induce a pensar en la presencia de
Salmonella en los alimentos, de acuerdo a lo reportado.
Figura 3. Colonias de color amarillito con pigmentación negra en las muestras de chilaquiles,
probablemente Salmonella.
En medio Staphylococcus 110 obtuvimos colonias beige similares a las que se
reportan en literatura para Staphylacoccus.
Figura 4. Colonias de color amarillito reportadas para Staphylococcus.
CONCLUSIONES
Hasta el momento no podemos concluir definitivamente, dado que aún se está
analizando la información obtenida a partir de las pruebas bioquímicas, sin embargo,
es importante resaltar que los medios utilizados son selectivos y diferenciales para
ciertos microorganismos, por lo cual los resultados obtenidos hasta el momento nos
inducen a considerar la presencia de Escherichia coli, Salmonella y Staphylococcus
en los alimentos y agua de consumo del comedor del ITM. Lo anterior permite sugerir
se revisen las medidas sanitarias y de higiene en la preparación y producción de los
alimentos de consumo humano.
ANEXOS