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TEMA 10 CULTIVO Y AISLAMIENTO DE PATÓGENOS VIABLES ÍNDICE DE CONTENIDOS Introducción Preparación de medios artificiales Condiciones para el aislamiento de patógenos Microorganismos y oxígeno Incubación en condiciones anaerobias Incubación de microorganismos capnófilos Temperatura de incubación, pH, humedad Medios artificiales. Ejemplos. Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento) Medios de enriquecimiento Medios selectivos Medios diferenciales Medios cromogénicos Cultivo de patógenos intracelulares obligados Introducción Regla de oro de la microbiología Cultivo y aislamiento de microorganismos Muestra identificación Cultivo puro Realización pruebas susceptibilidad Etapa limitante en la rapidez del diagnóstico microbiológico Medios de cultivo Qué es un medio de cultivo Medios deshidratados Cientos de formulaciones Empresas del sector farmacéutico dedicadas a la producción y control de calidad de los medios Placas de petri y tubos con todos los medios necesarios EXISTEN CIENTOS DE FORMULACIONES DISPONILES EN EL MERCADO Preparación de medios de cultivo artificiales Preparación Esterilización Autoclave Tindalización Filtración Luz UV Estufas a 180 ºC Óxido de etileno Adición de sustancias termolábiles Vertido en placas de petri (medios sólidos) o tubos (medios líquidos o medios sólidos) Condiciones para el desarrollo de patógenos Medio de cultivo No exigentes (nutrientes (C, N, S, P) sales, tampón) Exigentes (ídem. + sustancias complejas (sangre, suero, huevo, patata, factor X, factor V, vitaminas) Condiciones ambientales adecuadas Atmósfera adecuada Temperatura adecuada Humedad Tiempo de incubación pH Ausencia de factores inhibidores o antagonistas del crecimiento Relaciones de los microorganimos con el oxígeno Aerobios Anaerobios facultativos Anaerobios Estufas para anaerobios Bolsas para anaerobios (generan H2 y CO2) (Gas-Pak) Microaerófilos Frascos con vela Agar semisólido Capnófilos Atmósfera de CO2 Sistemas Gas Pak, Bio Bag (bicarbonato y ácidos) Utilización de estufas de CO2 Sistemas para anaerobiosis Sistemas para incubación de microorganismos capnófilos Jarra con vela Estufas CO2 Sistemas Biobag, Gas Pak (bicarbonato y ácidos) CONDICIONES DE INCUBACIÓN Temperatura de incubación 35-37 ºC 30 ºC Otras temperaturas Elevadas (42 ºC) Bajas (4ºC) enriquecimiento en frío Intermedias (22 ºC) Tiempo de incubación pH Clasificación de los medios de cultivo Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento y medios enriquecidos) Medios de enriquecimiento Medios diferenciales Medios selectivos Medios cromogénicos Ejemplos de medios de aislamiento primario o medios de crecimiento y medios enriquecidos Agar nutritivo Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA) Agar triptona soja (TSA) Agar sangre Agar chocolate Agar CLED (urocultivo) Agar de Múeller-Hinton Caldo de carne picada Caldo tioglicolato Agar BHIA (Infusión de cerebro y corazón ) Componentes Cantidad Propiedad Extracto de cerebro 7,8 g/l Fuente de nutrientes Extracto de corazón 9,7 g/l Fuente de nutrientes Peptona 10 g/l Fuente de proteínas Dextrosa 2 g/l Hidrato de carbono Tampón fosfato 2,5 g/l Regulación pH NaCl 5 g/l Sales Agar 15 g/l Agente solidificante Objetivo Medio rico, no selectivo, permite crecimiento de la mayoría de microorganismos no exigentes Ausencia de agentes inhibidores CLED (cistina-lactosa-deficiente en electrolitos Componentes Cantidad Digerido pancreático de gelatina Digerido pancreático de caseína Extracto de carne Lactosa L-cistina Azul de Bromotimol Agar 4 g/L 4 g/L 3 g/L 10 g/L 0,128 g/L 0,02 g/L 15 g/L Medio rico y selectivo Específico para urocultivo Deficiencia de electrolitos inhibe la movilidad de Proteus Características y usos de algunos medios más frecuentemente utilizados Agar sangre Triptona Hidratos de carbono NaCl Tampón Agar 5% sangre desfibrinada Medio enriquecido y selectivo Permite ver distintos tipos de hemolisis, es diferencial Recuento de patógenos mediante la técnica de estría en placa También se utiliza para cuantificación de resultados: Estimación del número de microorganismos en la muestra original en función del crecimiento: Crecimiento escaso Crecimiento moderado Crecimiento abundante Recuento de patógenos mediante el uso del asa calibrada (u.f.c.) Y también se utiliza para recuento de microorganismos mediante siembra con asa calibrada, recuento de unidades formadoras de colonias por mililito (u.f.c./mL) Caldo con carne picada para cultivo de anaerobios Es un medio rico , pero es un caldo, un medio líquido Caldo con carne picada fuente de proteínas y nutrientes, potencial redox bajo (ambiente reductor) Añadido o no de glucosa Anaerobios (parafina líquida) Ejemplos de caldos de enriquecimiento Son medios líquidos que llevan una concentración baja de agentes inhibidores Retrasan el crecimiento de los microorganismos comensales de la microbiota Permiten enriquecer la muestra en un determinado patógeno que era menos abundante respecto al resto de la microbiota Caldo selenito Caldo tetrationato Caldo Gram negativos Subcultivar en medios más selectivos al cabo de 6-8 horas Salmonella Salmonella y Shigella Salmonella y Shigella Caldo selenito Componentes Cantidad Propiedad Peptona 5 g/l Fuente de proteínas Lactosa 4 g/l Hidrato de carbono Selenito de sodio 4 g/l Fosfato de sodio 10 g/l Agente inhibidor de la mayoría de Enterobacterias, incluyendo muchas especies de Shigella Tampón Objetivo Enriquecimiento de especies de Salmonella en muestras de heces, aguas fecales, etc. Subcultivar al cabo de 8-12 horas en medio más selectivo (agar SS o agar sulfito de bismuto) Medios selectivos Llevan una concentración alta de agentes inhibidores Permiten crecer a unos microorganismos pero inhiben el crecimiento de otros Los agentes inhibidores son sustancias de diferente naturaleza química Agentes inhibidores: colorantes (azul de metileno, cristal violeta, verde brillante, eosina), antibióticos, metales (Se, Bi), sales biliares, azida, alcoholes (alcohol feniletílico), cloruro sódico a alta concentración Ejemplos de medios selectivos Moderadamente selectivos MacConkey EMB Altamente selectivos Agar salino manitol Medio SS Agar Hektoen Agar sulfito de bismuto Agar xylosa-lisina-dexosicolato Agar PEA Agar Columbia CNA Staphylococcus Salmonella y Shigella Salmonella y Shigella Salmonella y Shigella Salmolella y Shigella Gram positivos Gram positivos Agar MacConkey Componentes Cantidad Propiedad Peptona 17 g/l Fuente de proteínas Polipeptona 3 g/l Fuente de proteínas Lactosa 10 g/l Azúcar fermentable Sales biliares (conc. moderada) 1,5 g/l Inhibidor de gram positivos Cristal violeta 0,001 g/l Inhibidor de gram positivos NaCl 5 g/l sales Rojo neutro Agar Indicador de pH 13,5 g/l Agente solidificante Objetivo Aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos gram negativos fermentadores y no fermentadores de la lactosa Agar MacConkey Diferenciación de bacilos entéricos gram negativos fermentadores y no fermentadores de lactosa Colonias rojas/rosa Fermentadores de lactosa No patógenos (E. coli, Klebsiella, Citrobacter) Colonias transparentes No fermentan la lactosa Patógenos (Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Yersinia, Proteus) Agar entérico Hektoen Componentes Cantidad Propiedad Peptona 12 g/l Fuente de C y N Extracto de levadura 3 g/l Fuente de N Sales biliares (alta conc.) 9 g/l Inhibidor de gram positivos Lactosa 12 g/l Azúcar fermentable Sacarosa 12 g/l Azúcar fermentable NaCl 5 g/l Sales Tiosulfato de sodio 5 g/l Fuente de azufre e inhibidor Citrato férrico amónico 1,5 g/l Producción sulfuro Salmonella/ inhibidor Azul de timol 0,04 g/l Agar 14 g/l Indicador de pH Agente solidificante Objetivo: Aislamiento y diferenciación de especies de Salmonella y Shigella de otros bacilos entéricos gram negativos en muestras fecales Propiedades diferenciales del medio Agar entérico Hektoen Los fermentadores de lactosa (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) se ven amarillas. Los no fermentadores se ven incoloros. Salmonella tiene un punto negro central por la producción de sulfuro. La mayoría de las especies de Shigella no producen sulfuro. Medio agar salino manitol (agar de Chapman) Agente inhibidor NaCl al 7,5% sólo crecen Staphylococcus y Microccocus Incluye manitol y rojo fenol como indicador (medio diferencial) Los microorganismos que fermentan el manitol se observan como colonias amarillas Los que no fermentan el manitol se observan blancos o del color del medio Agar Alcohol Feniletílico (PEA) Componentes Extracto de carne Triptosa Cantidad 3 g/L 10 g/L Propiedad Fuente de C y N Fuente de N Feniletanol 2,5 g/L Inhibidor de Gram negativos Cloruro de sodio 5 g/L Estabilizador osmótico Agar 15 g/L Agente solidificante Aislamiento de microorganismos Gram positivos, especialmente estafilococos y estreptococos, a partir de diversas muestras con microbiota mixta. La adición de alcohol fenil etílico inhibe o reduce drásticamente el crecimiento de bacterias Gram negativas porque inhibe la síntesis de ADN. Además, previene la proliferación de colonias invasivas tipo “swarming”. El alcohol fenil etílico es un antimicrobiano, antiséptico y desinfectante que también se utiliza como esencia aromática y preservativo en farmacia y perfumería. Las placas de este medio recién preparadas huelen a rosas. Agar Alcohol Feniletílico (PEA) Cuando a este medio se le adiciona sangre de oveja al 5%, se convierte en un excelente medio para el aislamiento de bacterias anaerobias presentes en muestras clínicas donde hay una microbiota abundante y heterogénea que contiene bacterias Gram negativas de crecimiento rápido tal como Proteus. Medios diferenciales Permiten distinguir entre bacterias diferentes en base a un comportamiento bioquímico (p.e., fermentación o no de la lactosa, fermentación del manitol, producción o no de sulfuro, distintos tipos de hemolisis, etc.). Pueden ser, a su vez, ricos, enriquecidos o selectivos Ejemplos de medios diferenciales MacConkey (moderadamente selectivo y diferencial) EMB (moderadamente selectivo y diferencial) Agar CLED (no selectivo, medio rico y diferencial) Agar sangre (no selectivo, medio enriquecido y diferencial) SM, SS, HE, XLD (altamente selectivos y diferenciales) Agar sangre, CLED Agar XLD, EMB, MacConkey; SS; HE; ADC Agar SM Medios cromogénicos Medios diferenciales Incorporan sustancias cromogénicas Detección de actividades enzimáticas características de determinados géneros o especies de bacterias β- galactosidasa β- glucosidasa β- glucuronidasa Producción de un color característico identificación β- galactosidasa ONPG Incoloro ONP + galactosa amarillo Ejemplos de medios cromogénicos CPS ID3 Chromogenic UTI (infecciones tracto urinario) ChromAgar Orientation UriSelect 4 (urocultivos) Identificación bacterias en infecciones urinarias Tres tipos de enzimas Se puede añadir triptófano (prueba del indol o TDA) se incrementa el número de microorganismos que se pueden identificar Medios diferenciales cromogénicos para la identificación de bacterias en muestras de orina E. coli Enterococcus faecalis Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa MEDIOS CROMOGÉNICOS PARA LEVADURAS Un ejemplo de medio cromogénico ChromAgar Candida Permite diferenciar e identificar tres especies de este género (colonias verdes, azules y transparentes) Medios específicos BCYE (agar tamponado con carbón y extracto de levadura) Bordet-Gengou Regan-Lowe Thayer-Martin New York City Lowestein-Jensen CIN (cefsulodina-irgasán-novobiocina) TCBS (tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa) Pico de flauta de Loeffler Diamond Sabouraud CCF, CCYE Legionella Bordetella pertussis Bordetella pertussis Neisseria meningitidis y N. gonorrhoeae Neisseria gonorrhoeae y micoplasmas genitales Mycobacterium tuberculosis Yersinia Vibrio cholerae Corynebacterium difteriae Trichomonas vaginalis Hongos Clostridium difficile Patógenos intracelulares obligados Crecen sólo dentro de las células No se ha encontrado un medio completamente artificial para su desarrollo Treponema pallidum No se pueden cultivar Mycobacterium leprae en medios artificiales (Legionella pneumophila BCYE) Cultivos de tejidos en el laboratorio Cultivos celulares Cultivos primarios nº Cromosomas=2n Células de riñón Fibroblastos Líneas celulares continuas aberraciones en el nº de cromosomas aneuploidía Hep-2, HeLa, Vero McCoy A-549, RD, MDCK efecto citopático de la toxina de Clostridium difficile Clamidias Virus
