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GENERALES Título del proyecto: Estudio del panqué de frijol negro Frijozac en células cancerígenas, para su prevención en cáncer de colon. Cadena/Sistema producto: Frijol Eslabón: Alimentos Tipo de proyecto: Investigación aplicada Demandas que atiende: Propiedades nutracéuticas presentes en los productos agroindustriales de frijol. Fecha de inicio: Junio 2010 Fecha de término: Junio 2011 Institución ejecutora: INIFAP Responsable técnico: Juan José Figueroa González PROTOCOLO Finalidad: Investigar las propiedades funcionales y nutracéuticas de los productos agroindustriales de frijol, para determinar su contenido nutricional y funcional, para que nos permita presentar al frijol y sus productos agroindustriales como un alimento altamente nutritivo, capaz de competir con la comida chatarra existente en el mercado. Propósito: Hacer una investigación nutracéutica y funcional de los productos agroindustriales ya elaborados a base de frijol, para hacer de estos alimentos funcionales y nutritivos que aporten un bien al organismo. Resumen ejecutivo El frijol, tiene innumerables beneficios, de acuerdo con la compilación realizada por Duke (1985): es anticáncer, antidepresivo, antileucemia, antimelanómico, antiprostático, apoptósico, cardioprotector, hipocolesteronémico, hipotensivo, lipolitico, lipotrópico, además de antibacteriano, antidiabetes, diurético, antiviral, mutagénico, antipirético, fungicida, emoliente, e carminativo, depurativo, hipoglicémico (FLEMING, diaforético, 1998). En emenagogo, los países industrializados ha cambiado el concepto de nutrición, pasando del papel de la dieta de aportar los nutrientes necesarios a la idea de que la dieta puede contener alimentos que, además de nutrir, promuevan específicamente la salud. Así surge el concepto del “alimento funcional” (AF), amplio abanico de productos nutritivos y no nutritivos que no solo alimentan, sino que modulando o actuando sobre determinadas funciones y elementos del organismo, tienen un efecto beneficioso en la salud del individuo (DIPLOCK AT, et al, 1999). Es por ello, que al tener un estudio minucioso de investigación de estos productos agroindustriales de frijol, sobre todo, del panque de frijol negro Frijozac y del totopo con harina de frijol bayo zacatecas, al tener su función en células cancerígenas podemos vender y recomendar este tipo de alimentos como funcionales y/o nutracéuticos de acuerdo a sus componentes que se encuentren durante esta investigación de alimentos. Introducción. En la actualidad los estudios referentes al frijol son de suma importancia debido a sus propiedades benéficas. La piel del frijol tiene gran cantidad de flavonoides con poder antioxidante. Los principales componentes del grano son: proteínas (1630%), fibra (3-8%), glúcidos (55-65%), lípidos (1-5%) y minerales (3-5%) (Rodiño, 2000). El concepto actual de nutrición está evolucionando. La «nutrición adecuada», entendida como «suficiente», dirigida a evitar déficits, ha dejado de ser la meta en las sociedades desarrolladas. Emerge la concepción de la alimentación como «nutrición óptima». Su objetivo es la calidad de vida y el bienestar integral del individuo. La nutrición adquiere un nuevo enfoque terapéutico y preventivo; participa en la promoción de la salud y es ya considerada como factor de protección ante una larga serie de circunstancias patológicas. El reto futuro es la nutrición «a la carta», diseñada a medida de los factores genéticos y medioambientales que constituyen y moldean al ser humano. Uno de los primeros pasos son los llamados alimentos funcionales (AF) (SILVEIRA et al, 2003). Un alimento funcional es el que tiene una apariencia similar a la de un alimento convencional, se consume como parte de una dieta normal y, además de su función nutritiva básica, se ha demostrado que presenta propiedades fisiológicas beneficiosas y/ o reduce el riesgo de contraer enfermedades crónicas. Una segunda categoría de alimentos funcionales son aquellos que han sido fortificados para aumentar el nivel de un nutriente específico o componente alimentario que ha sido asociado con la prevención o tratamiento de una enfermedad u otra condición clínica (PALENCIA, 2005). El frijol posee elevada cantidad de calcio, hierro y vitaminas tales como la Tiamina y ácido fólico. Dentro del contenido de proteínas del frijol se destaca la abundancia de lisina, la cual permite fortificar algunos alimentos con este tipo de aminoácidos, y poco contenido de aminoácidos azufrados (metionina y cisteína) (BELLO, 2006). Los conceptos de alimentación se están expandiendo, dejando de centrarse sobre la supervivencia, la satisfacción del hambre, y la prevención de efectos adversos, promoviendo un estado de bienestar y una mejor salud, ayudando a reducir el riesgo de enfermedades. Estos conceptos son importantes debido al alto costo de cuidado de la salud, el aumento constante de la esperanza de vida, y el deseo de las personas mayores para mejorar la calidad de sus últimos años (ROBERFROID, 2000). Dentro de los alimentos funcionales y de un buen valor nutritivo encontramos el poroto común o frijol, que presenta un alto contenido de proteínas, almidones de velocidad de digestión intermedia, un alto contenido de fibra dietética, fitatos, taninos y oligosacáridos no digeribles (GUZMANMALDONADO, et al, 1998). Justificación. Como se ha probado a lo largo de la historia, la nutrición, la salud, la educación y la cultura de los originarios de un país son parte integral de la calidad de su capital humano, el recurso más valioso para su desarrollo social y económico (MARTINEZ, et al, 2005). La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha considerado a la obesidad como una verdadera enfermedad epidémica, “El nuevo azote de la Humanidad”. México, un país con población tradicionalmente desnutrida, no está libre de esta epidemia. Quizás uno de los factores que explican esta transición nutricional sea la aparente mejoría en el nivel socioeconómico de los mexicanos en la última década, aun cuando estamos muy lejos de lograr una situación óptima, ya que la distribución de la riqueza sigue siendo sumamente desigual en algunas regiones de nuestro país. Estamos cambiando nuestros hábitos de alimentación dejando a un lado la dieta tradicional, rica en cereales como el maíz, del que se hacen las tortillas y leguminosas como el fríjol, para adoptar una nueva cultura de la comida rápida, con alto valor energético, pero deficiente en algunos nutrientes esenciales. ¿Hacia dónde vamos? ¿De la desnutrición a la obesidad? Finalmente, otra forma de mala nutrición (RAMIREZ, et al, 2003). Se ha demostrado que el consumo de bebidas gaseosas y comida chatarra está asociado con un aumento en la obesidad; se observa un reemplazo de la leche, dando como resultado un déficit de calcio y un aumento en las caries dentales, asociado también al consumo de “snacks y dulces” (CASTILLO, et al, 2006). Hay una diferencia de ingesta de legumbres, pescado, frutas y verduras. Por último, a medida que aumenta la edad, disminuye el consumo de lácteos y aumenta el de zumos y bebidas azucaradas (DELMAU, et al, 2004). Esto nos lleva a investigar de manera íntegra los productos agroindustriales elaborados a base de frijol (totopos, snacks, barra nutritiva y panqué), con la finalidad de conocer sus propiedades nutricionales y funcionales, haciendo de ellos, alimentos funcionales que nos permitan contrarrestar la comida chatarra que se vende y se consume, sobre todo en las escuelas de nivel básico. El panqué que actualmente se está elaborando en el Campo Experimental Zacatecas, tiene una presentación sensorial y de textura aceptable por lo que se requiere de hacer una investigación del contenido de almidones presentes en esta leguminosa, hacer una investigación de digestibilidad in vitro, para poder determinar su uso y su comportamiento en el tracto digestivo. De igual manera conocer cada una de sus propiedades funcionales y nutracéuticas con la finalidad de colaborar con la disminución de los problemas de salud antes mencionados. Todos y cada uno de los productos antes mencionados requieren de un análisis funcional para determinar su capacidad y competencia en el mercado. El INIFAP tiene 5 años de trabajar en los compuestos del frijol, aplicados en células de cáncer, por lo que actualmente se tiene avances en el estudio de células cancerígenas. Por lo que este estudio requiere de una gran parte económica del proyecto para solventar los gastos en la investigación de células cancerígenas de colon y mama aplicando dosis de alimentos a base de frijol (panqué y totopos), para determinar el control, reducción y prevención de cáncer. Planteamiento del problema. El frijol no cotiza en bolsa y no existe alineación de su precio con el precio de algún genérico, éste está en función de la oferta y la demanda; sin embargo, es un mercado muy desordenado donde acopiadores y mayoristas influyen fuertemente en el establecimiento del precio (FIRA, 2008). En 1990, cada mexicano comía en promedio 18 kilos 900 gramos de frijoles al año; ahora cada uno consume solo 11 kilos 900 gramos al año. Eso indica que ahora cada mexicano come 7 kilos menos. Sagarpa dice: “Se ha reducido el consumo per cápita de frijol, debido al cambio en preferencias de los consumidores por productos de mayor facilidad en el consumo (alimentos preparados) y por la sustitución de la proteína de origen vegetal por proteína animal” (EXCELSIOR, 2007). Cabe mencionar, que la comida rápida ha traído problemas de salud severos en la sociedad. Desde 1998 la Organización Mundial de la Salud considera la obesidad una epidemia global. Hay un exceso de ingestión de alimentos de origen animal (carnes procesadas) y de alimentos manufacturados ricos en azucares refinados, sodio, ácidos grasos saturados y colesterol. De igual manera hay una deficiencia de ingesta de legumbres, pescado, frutas y verduras. A medida que aumenta la edad, disminuye el consumo de lácteos y aumenta el de zumos y bebidas azucaradas (DALMAU, et al, 2004). Estamos cambiando nuestros hábitos de alimentación dejando a un lado la dieta tradicional, rica en cereales como el maíz, del que se hacen las tortillas y leguminosas como el fríjol, para adoptar una nueva cultura de la comida rápida, con alto valor energético, pero deficiente en algunos nutrientes esenciales. ¿Hacia dónde vamos? ¿De la desnutrición a la obesidad? Finalmente, otra forma de mala nutrición (RAMIREZ, et al, 2003). METODOLOGÍA: Se utilizará como materia prima los productos agroindustriales de frijol ya elaborados en el Campo Experimental Zacatecas. Los productos a utilizar serán panque de frijol Negro Frijozac. La investigación se hará de la siguiente manera: 1. Se hará una prueba en células con cáncer de colon, utilizando como muestras el panqué de frijol negro Frijozac . Efecto Citotóxico sobre células de cáncer de colon. Las muestras (150 g) de los alimentos a base de frijol liofilizado y molido serán extraídas con 250 mL de metanol:agua (80:20, v/v) por 120 min a temperatura ambiente. Después de centrifugar las muestras, el sobrenadante será recuperado. El sobrenadante será sometido al análisis para compuestos fenólicos como se explica mas adelante. Para determinar el posible efecto citotóxico de los compuestos presentes en los alimentos a base de frijol, se prepararán concentraciones de los extractos a base de frijol (EBF) entre 0.3 y 0.001 mg de EBF/mL de medio de cultivo libre de suero, suplementado con albúmina sérica de bovino (Serological No. A440) al 0.5%. Brevemente, se sembrarán células ZR-75-1 de cáncer de mama ductal o células de cáncer de colon HeLa a 3x104 células por pozo en placas de 24 pozos (Nunc) en DMEM alto en glucosa (Gibco, No. 11995) con 10% de suero fetal bovino (Gibco No. 10091), L–Glutamina (Gibco, No. 25030), piruvato de sodio (Gibco, No. 11360), antibióticos: estreptomicina (Sigma No. S9137) 100mg/L y penicilina (Sigma No. P3032) 62.1 mg/L y antimicótico: anfotericina (Gibco No. 04195780 D) 1mg/mL. Después de 48 horas, se les agregarán diferentes concentraciones del extracto de los productos a base de frijol y se determinará el número de células a las 24 h por recuento directo al microscopio (García-Gasca et al., 2002). A mayor número de células sobrevivientes, menor el efecto citotóxico del alimento a base de frijol. 2. Conocer las propiedades nutracéuticas presentes en los productos agroindustriales (totopos, snacks, panqué y barra nutritiva). Determinación de Compuestos fenólicos. Obtención de extractos para el análisis de fenoles totales, ácidos fenólicos y flavonoides. Se utilizarán 200 mg de harina, se mezclarán con 1 ml de metanol 80% y se agitarán a 80 rpm durante la noche. Al siguiente día se centrifugarán a 13 000 rpm por 10 min, la pastilla se resuspenderá en un ml de metanol 80% y se mantendrá en agitación por 2 hr y se almacenará a 4°C hasta su uso y protegido de la luz. Los fenoles totales se determinarán por el método de Folin-Ciocalteu, descrito por Singleton y Rossi (1965). A partir de 50 ul de extracto se mezclarán con 200 ul de agua y 250 ul del reactivo del Folin-Ciocalteu y se mezclará vigorosamente durante 3 min. Se adicionarán 500 ul de Na2CO3 y se mezclarán vigorosamente. Las muestras se incubarán a 45°C por 15 min se leerá la absorbancia a 760 nm en espectrofotómetro. Para determinar la concentración se preparará una curva estándar con ácido gálico y los resultados serán expresados en mg de ácido gálico por gramo de harina de frijol. Los taninos condensados se determinarán por el método de la vainillina-HCl (Deshpande y Cheryan, 1987). Se obtendrá un extracto a partir de 100 mg de harina de frijol y 1 ml de etanol acidificado al 1% se mantendrá en agitación por 8 h y se centrifugará a 13000 rpm para obtener el extracto. Se utilizarán 166 ul y se adicionarán 834 ul del reactivo de vainillina al 0.5%, se agitarán vigorosamente y serán incubados a 30°C por 20 min hasta su lectura a 500 nm en espectrofotómetro. Se construyó una curva de calibración de catequina y el contenido de taninos fue expresado como miligramos equivalentes de catequina por gramo de harina de frijol. La determinación de ácidos fenólicos se realizará a partir de extractos metanólicos hidrolizados (Graham, 1991). 1 ml del extracto será evaporado en rotavapor a 40°C. El residuo se diluirá con 3 ml de HCl 2N y calentado a 95°C por 2 h. Los compuestos orgánicos se extraerán a partir de la solución acidificada con 4 ml de acetato de etilo; separando la fase orgánica del resto de la mezcla. El acetato de etilo se removerá en rotavapor a 40°C. Finalmente el residuo se resuspenderá en 0.1 ml de metanol 80%, y centrifugado a 13 000 rpm y se utilizará para su análisis en HPLC. Los análisis de HPLC se realizarán utilizando un detector PDA, módulo de separación 2690 (Waters Milford MA USA) y una columna de separación Platinum EPS C-18 (7X 57 ml) Rocket (Deerfield, IL, USA) el solvente A será agua ajustada a PH 2.8 con ácido acético y el solvente B acetonitrilo. El volumen de inyección fue 30 ul con un flujo de 2.5 ml por min. Para la elusión de los ácidos fenólicos el gradiente lineal será: 6% B en 8 min 12% B en 14 min, 20% B en 18 min, 35% B en 24 min, inmediatamente 3. Determinacion de fibra soluble e insoluble. Este análisis se realizará mediante los procedimientos oficiales de la AOAC (2000), los cuales consisten en una digestión enzimática secuencial de la muestra con una αamilasa termoestable, una proteasa y una amiloglicosidasa para la remoción de proteína y almidón, además de un tratamiento con alcohol para remover la fibra soluble, el contenido de fibra soluble e insoluble será determinado mediante el filtrado y pesado de los residuos solubles e insolubles deshidratados. 4. Capacidad antioxidante. Según la metodología desarrollada por RE et al. y descrita por KUSKOSKI et al. el radical ABTS•+ se obtiene tras la reacción de ABTS (7 mM) con persulfato potásico (2,45 mM, concentración final) incubados a temperatura ambiente (±25ºC) y en la oscuridad durante 16 h. Una vez formado el radical ABTS•+ se diluye con etanol hasta obtener un valor de absorbancia comprendido entre 0,70 (±0,1) a 754 nm (longitud de onda de máxima absorción). Las muestras filtradas (antocianos) se diluyen con etanol hasta que se produce una inhibición del 20 al 80%, en comparación con la absorbancia del blanco, tras añadir 20 µL de la muestra. A 980 µL de dilución del radical ABTS •+ así generado se le determina la A754 a 30ºC, se añade 20 µL de la muestra (dilución de antocianos) y se mide de nuevo la A754 pasado 1 minuto. La absorbancia se mide de forma continua transcurridos 7 minutos. El antioxidante sintético de referencia, Trolox, se ensaya a una concentración de 0-15 µM (concentración final) en etanol, en las mismas condiciones, lo que se hace también con ácido ascórbico (0-20 mg/100 mL). Los resultados se expresan en TEAC (actividad antioxidante equivalente a Trolox) y en VCEAC (actividad antioxidante equivalente a vitamina C), en este último caso por tratarse de alimentos. Productos a entregar: 1) Folleto técnico donde se detallen las propiedades nutracéuticas y/o funcionales de los alimentos de frijol, 2) Folleto técnico sobre el impacto del panque en cáncer de colon. Actividades por producto: 1) Ordenar la información de los diferentes análisis realizados, para darle estructura al folleto técnico, donde se aprecien las diferentes propiedades nutracéuticas y funcionales de los alimentos, y su digestibilidad in vitro, determinando una ración adecuada de este tipo de alimentos. 2) Folleto técnico donde se detallen las propiedades nutricionales de los productos agroindustriales elaborados. Fecha de entrega de productos: Diciembre 2011. Supuestos: La reducción del presupuesto y que éste no se entregue en tiempo y forma. BENEFICIARIOS DIRECTOS: Nombre Comité estatal del Sistema Producto Frijol Curp CES - 091103 - SY8 EQUIPO DE COLABORADORES Nombre CURP Juan José FIGJ81011HZSGNN05 Figueroa González Dirección Calle Nieve No. 26, Cañada de la Bufa, CP 98619, Guadalupe; Zacatecas Dirección Km 24.5 C. ZacatecasFresnillo Especialidad Ing. en Industrias Alimentarias Teléfono (492) 89 9 07 18 (492) 89 9 28 75 Institución INIFAPZacatecas Ma. AAND420327MZSLVL01 Km 6.5 C. Guadalupe CelayaHerrera San Miguel Hernández Allende Cinthya Km 4.5 Adriana C. Nava DurangoBerumen El Mezquital Salvador Km 6.5 C. Horacio CelayaGuzmán San Miguel Maldonado Allende M. C. Ciencias de los Alimentos INIFAPBajío M. C. Bioquímica de alimentos INIFAPValle del Guadiana Dr. INIFAPBiotecnología Celaya de Alimentos INFORMACION FINANCIERA Presupuesto solicitado al componente de Transferencia de Tecnología. Presupuesto año 1 $ 455,000.00 Aportación de productores Aportación 2010 $ 195,000.00 Desglose anual del proyecto 2010 PARTIDAS PRESUPUESTALES Personal IMPORTE JUSTIFICACIÓN 30,000.00 Material de laboratorio (baño maría, cleaner ultrasonic, vortex shaker, stirrer scholar y vortex heldolph)/Suministros Reactivos y vidriería. Servicios generales 350,000.00 Contratación de mano de obra para el análisis de muestras en el laboratorio. Para realizar los análisis programados en el proyecto. Materiales de consumo de uso directo 35,000.00 25,000.00 Servicio de mantenimiento y reparación de equipo de laboratorio. Combustible, afinación, lubricantes para la Acervos bibliográficos/servicio de información y de papelería TOTAL DE PARTIDA 15,000.00 colecta de las muestras a estudiar. Congresos nacionales y presentación de resultados, bibliografía. 355,000.00 Calendograma de ministraciones Ministración 1 Ministración 2 Monto 150,000.00 150,000.00 Fecha Junio 2010 Octubre 2010 Ministración 3 55,000.00 Febrero 2011 Ministración 4