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ÍNDICE GENERAL I LISTADO DE FIGURAS LISTADO DE TABLAS VII XII ABREVIATURAS XIV I. INTRODUCCIÓN 1 1. POSTCOSECHA DE FRUTOS CÍTRICOS 2 1.1 Enfermedades Postcosecha 3 1.2 Principales enfermedades fúngicas postcosecha en frutos cítricos 3 1.3 Control de las podredumbres en postcosecha 5 1.3.1 Fungicidas químicos 1.3.2 Control alternativo 1.3.2.1 Control Físico 1.3.2.2 Control Químico 1.3.2.3 Control Biológico 1.3.2.4 Combinación de tratamientos para el tratamiento integral de enfermedades 6 7 8 9 10 11 2. BIOLOGÍA DE Penicillium digitatum 13 3. INTERACCIÓN PLANTA-PATÓGENO 18 4. FACTORES DE PATOGENICIDAD Y VIRULENCIA EN HONGOS FITOPATÓGENOS 22 4.1 Reconocimiento del huésped y cascadas de transducción de señales 22 4.2 Genes implicados en el metabolismo de nutrientes esenciales 28 4.3 Enzimas degradadoras de pared celular 29 4.4 Efectores 31 4.5 Producción y detoxificación de toxinas 34 4.6 Especies reactivas de oxígeno 35 4.7 Implicación del pH en patogénesis 38 5. DESARROLLO DE HERRAMIENTAS GENÓMICAS EN HONGOS FITOPATÓGENOS 41 5.1 Aproximaciones a la transformación genética 41 5.2 Recombinación homóloga y no homóloga 42 5.3 RNA interferente 5.4 Proteína verde fluorescente 43 44 6. DESARROLLO DE TÉCNICAS -ÓMICAS EN EL ESTUDIO DE HONGOS FILAMENTOSOS 46 II.OBJETIVOS 54 III. MATERIALES Y MÉTODOS 56 1. ORGANISMOS 57 1.1. Material vegetal 57 1.2 Microorganismos 57 1.2.1 Hongos 1.2.2 Bacterias 57 58 2. INFECCIONES DE FRUTOS CÍTRICOS CON P. digitatum 58 2.1 Toma de muestras 59 2.1.1 Tejido fruto de naranja infectado con P. digitatum 2.1.2 Micelio de P. digitatum 59 60 2.2 Análisis estadístico 60 3. AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS 60 3.1 RNA de fruto (infectado y no infectado) y de micelio 60 3.2 RNA de conidios 61 3.3 Purificación de mRNA 61 3.4 Extracción de DNA genómico de P. digitatum 61 3.5 DNA genómico de P. digitatum a pequeña escala 62 3. 6 Purificación de DNA plasmídico 62 3.6.1 Purificación de plásmidos a gran escala mediante lisis alcalina 3.6.2 Purificación de plásmidos a pequeña escala mediante lisis alcalina 3. 7 Purificación de DNA de fósmidos 62 63 63 3.7.1 Purificación de DNA de fósmido a gran escala por lisis alcalina 63 3.7.2 Purificación de DNA de fósmido a media escala por el método de ebullición 64 3.7.3. Purificación de DNA de fósmido a media escala sin amplificación previa 64 4. ANÁLISIS NORTHERN 64 4.1. Preparación de las membranas 64 4.2 Marcaje de sondas 65 4.3 Hibridaciones y análisis de datos 65 5. OBTENCIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES Y TRANSFORMACIÓN 66 5.1 Preparación y transformación de células quimio-competentes de E. coli 66 5.2 Preparación de células electro-competentes de E. coli 66 5.3 Preparación de células electro-competentes de Agrobacterium tumefaciens 67 6. SECUENCIACIÓN 68 6.1 Análisis de secuencias 68 7. CONSTRUCCIÓN DE VECTORES 68 7.1 Diseño de oligonucleótidos 69 7.2 Preparación de vectores 71 7.2.1 Linearización de los vectores 7.2.2 Reacción de clonación USER 7.2.3 Transformación 71 72 72 8. CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO PRF-HU2Fle 73 9. CONSTRUCCIONES DE RNA INTERFERENTE 74 10. TRANSFORMACIÓN DE P. digitatum MEDIANTE A. tumefaciens 75 10.1 Transformación de P. digitatum mediada por A. tumefaciens 75 10.2 Estabilidad mitótica de los transformantes 76 11. CONSTRUCCIÓN DE UNA GENOTECA SUSTRACTIVA DE cDNA ENRIQUECIDA EN GENES DE P. digitatum INDUCIDOS DURANTE LA INFECCIÓN DE FRUTOS CÍTRICOS 11.1 Hibridación sustractiva mediada por PCR supresiva (SSH) 76 76 11.2 Elaboración e hibridación de una macromatriz de cDNA 77 11.3 Análisis de las hibridaciones de las macromatrices 78 12. CONSTRUCCIÓN DE UNA GENOTECA DE DNA GENÓMICO DE P. digitatum 79 13. SECUENCIACIÓN DE GENES DE INTERÉS DESDE LA GENOTECA DE DNA 80 13.1 Cribado de la genoteca 80 13.2 Obtención de secuencias de los genes 81 14. PCR EN TIEMPO REAL PARA LA CUANTIFICACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DE DNA 84 14.1 Reacción de PCR en tiempo real 85 15. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA 86 IV. RESULTADOS 1. HERRAMIENTAS GENÓMICAS 88 89 1.1 Construcción de una genoteca de DNA genómico de P. digitatum 89 1.2 Transformación de P. digitatum mediada por A. tumefaciens (ATMT) 90 1.2.1 Sensibilidad de P. digitatum a higromicina 1.2.2 Transformación de P. digitatum 1.2.3 Análisis molecular de los transformantes 1.2.4 Estabilidad mitótica de los transformantes 1.2.5 Optimización del sistema ATMT para P. digitatum 1.3 Proteína verde fluorescente (GFP, green fluorescent protein) 1.3.1 Vectores de expresión de la proteína verde fluorescente 1.3.2 Microscopía 1.3.3 Ensayos de infección transformantes de GFP 1.4 Obtención de mutantes de P. digitatum carentes del gen ku80 1.4.1 Obtención y caracterización de un mutante de P. digitatum carente del gen ku80 1.4.2 Comprobación número de copias mediante PCR en tiempo real 1.4.3 Análisis morfológico 1.4.4 Ensayos de infección 1.5 Uso de fleomicina como marcador de selección en P. digitatum 1.5.1 Sensibilidad de P. digitatum a fleomicina 1.5.2 Diseño del vector pRF-HU2Fle 1.5.3 Transformación de P. digitatum con el vector pRF-HU2Fle 90 90 91 91 92 93 93 94 96 96 101 103 105 106 107 107 108 109 1.6 Obtención de plásmidos binarios de RNA interferente para P. digitatum 110 2. FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN PacC 111 2.1 Clonación y secuenciación del gen pacC de P. digitatum 112 2.2 Análisis de la secuencia del gen pacC de P. digitatum 115 2.3 Análisis de expresión de pacC 116 2.4 Obtención de mutantes pacC de P. digitatum 2.4.1 Construcción del plásmido de sobreexpresión pRF-HUE-pacCc 2.4.2 Construcción del plásmido de expresión constitutiva pRF-HU2-pacCc 2.4.3 Construcción del plásmido de deleción pRF-HU2-ΔpacC1 2.4.4 Construcción del plásmido de deleción pRF-HU2-ΔpacC2 118 118 119 120 121 2.5 Transformación de P. digitatum con los plásmidos pRF-HU2-pacCc, pRF-HU2-ΔpacC y pRF-HUE-pacCc 122 2.5.1 Ensayos de infección transformantes de PacC 123 3. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE GENES DE P. digitatum QUE SE INDUCEN DURANTE EL PROCESO DE INFECCIÓN DE FRUTOS CÍTRICOS 124 3.1 Secuenciación y análisis de las secuencias de clones de la genoteca PDS 127 3.2 Análisis de expresión de los clones presente en la genoteca PDS 129 3.3 Anotación funcional de las secuencias 134 3.4 Análisis de la expresión génica mediante hibridación Northern 136 4. ANÁLISIS DE GENES PRESUNTAMENTE IMPLICADOS EN PATOGENICIDAD/VIRULENCIA 140 4.1 Poligalacturonasa 1 (pg1) 140 4.2 Poligalacturonasa 2 (pg2) 143 4.3 Pectin liasa (pnl1) 147 4.4 Proteína Rieske (ris1) 150 4.5 Obtención de mutantes nulos de P. digitatum en los genes pg1, pg2, pnl1 y ris1 4.5.1 Comprobación del número de copias de los transformantes mediante PCR tiempo real 154 156 4.6 Análisis morfológico de los mutantes nulos Δpg1, Δpg2, Δpnl1 y Δris1 de P. digitatum 158 4.7 Ensayos de infección de los mutantes nulos Δpg1, Δpg2, Δpnl1 y Δris1 de P. digitatum 159 V.DISCUSIÓN 165 1. DESARROLLO DE HERRAMIENTAS GENÓMICAS PARA P. digitatum 166 1.1 Uso de la proteína verde fluorescente para el estudio de P. digitatum 168 2. IMPLICACIÓN DEL FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN PacC DE P. digitatum EN PATOGENICIDAD 170 3. NUEVAS ALTERNATIVAS PARA LA OBTENCIÓN DE MUTANTES CON EXPRESIÓN REDUCIDA DE GENES DIANA 173 3.1 Obtención de mutantes nulos ku80 (Δku80) 173 3.2 RNA interference (RNAi) 175 4. APLICACIÓN DE HERRAMIENTAS GENÓMICAS EN EL ESTUDIO DE LA INTERACCIÓN P. digitatum- FRUTO CÍTRICO 175 4.1 Identificación de genes de P. digitatum que se inducen durante la infección de frutos cítricos 175 4.2 Respuesta a estrés y detoxificación 178 4.3 Enzimas relacionadas con la pared celular 182 4.4 Resistencia a fungicidas 189 4.5 Glucólisis 192 4.6 Transducción de señales 192 4.7 Otras proteínas 193 5. PROTEASAS 194 VI. CONCLUSIONES 199 VII. BIBLIOGRAFÍA 201