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Control Biológico de
Enfermedades de Plantas
Programa de Desarrollo de las Ciencias Básicas (PEDECIBA)
Área Química
Montevideo,
17 al 28 de febrero de 2003
¿Por qué es necesario identificar
un agente biocontrolador?
Dra. María Julia Pianzzola
Montevideo,
21 de febrero de 2003
Identificar para:
• clasificar en grupos existentes (¿es patógeno?) o
es nuevo
• mantenimiento (en el almacenamiento puede
contaminarse o mutar)
• diversidad: distinguirlo de otras cepas de la misma
especie que no posean actividad controladora
• monitoreo: una vez liberado al ecosistema
• registro: propiedad intelectual y comercialización
Identificar ¿cómo?
• ¿Qué tipo de microorganismo?
¿Bacteria?,¿ levadura?,¿ hongo filamentoso?
• Métodos clásicos:
morfología, asimilación de nutrientes, actividades
enzimáticas, etc.
• Bacterias
• Levaduras
• Hongos filamentosos
Bacterias
• Tinción de Gram, Tinción de esporas,
cápsula, etc
• Pruebas primarias
• Pruebas bioquímicas
• Kits comerciales, ej. API
Bergey’s Manual
Levaduras
• Presencia de ascos,
pseudomicelio,
cápsula, etc.
• Kurtzman y Fell,
1998.
Pruebas bioquímicas
Hongos filamentosos
Observación macro y microscópica: hifas, elementos de
propagación y resistencia, etc
Crecimiento en distintos medios (Pitt, 1999)
Muchas veces las características
morfológicas y los cultivos no son
suficientes
para
detectar
la
variabilidad
interespecífica
y
diferenciar cepas muy cercanas
Técnicas moleculares para
identificación de
microorganismos
• Métodos moleculares basados en PCR:
Tratamiento de la muestra (cultivo puro, muestra
de suelo, fruto, etc)
Elección de la secuencia blanco
Sensibilidad
Ejemplos:
• RFLP (restriction fragment length polymorphism): amplificación
por PCR de una secuencia, digestión enzimática y comparación de los
fragmentos resultantes.
• RAPD (random amplifed polymporphic DNA)
• AP-PCR, rep-PCR
Secuenciación
Bacterias:
Amplificación por PCR del gen del 16S
ARNr (1500pb)
• Comparación de la secuencia en bancos de
datos
Búsqueda de agentes
biocontroladores
•
•
•
•
Aislamiento
Selección
Identificación
Potenciación
Aislamiento
• ¿Qué pasa con los microorganismos endófitos (bacterias y
hongos)?
• Existen microorganismos endófitos que residen en los tejidos de las
plantas y en el sistema vascular sin ocasionar síntomas de enfermedad.
• Por mucho tiempo se pensó que eran contaminantes o patógenos
latentes pero se ha demostrado que son capaces de promover el
crecimiento y actuar como agentes biocontroladores.
• Se han aislado unas 129 especies de bacterias de tejidos internos de
plantas, las más abundantes: Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter,
Agrobacterium
• Sin embargo, muchas son difíciles de cultivar por no conocerse las
condiciones de crecimiento o estar en el estado de VBNC.
• ¿Cómo detectarlas y llegar a conocer su identidad?
¿Cómo conocer la identidad de los
endófitos?
• Extracción del ADN de las bacterias a partir de tejido de
planta.
• Amplificación por PCR con primers universales para 16S
rARN de bacterias
• Clonado de los fragmentos amplificados en y un vector
(plásmido)
• Transformación en una cepa de E. coli
• Selección de los recombinates (librería de 16S rARN)
• Secuenciado de los fragmentos clonados en cada uno de
los clones.
• Comparación con banco de datos.
Otras posibles técnicas moleculares :
• T-RFLP (terminal restriction fragment
length polymorphism)
• SSCP (PCR-single-strand-conformationpolymorphism)
• PCR-D/TGGE (denaturing or temperature
gradient gel electrophoresis)
Bacterias viables pero no cultivables
(VBNC)
→ (Xu et al., 1982):“ las bacterias son viables pero incapaces de
dividirse suficientemente en un medio no selectivo para dar un
crecimiento visible
 “Es un estado de dormancia de bacterias no esporuladas”
 Las condiciones que las inducen varían según las bacterias: presión
osmótica, DT, desecación, exposición a metales pesados, falta de
nutrientes.
 ”la resucitación no siempre ocurre al revertir las condiciones que la
ocasionaron”
 Para determinar VBNC se deben usar ensayos de viabilidad
independientes del crecimiento: actividades metabólicas, presencia de
ARN, ATP o integridad de membranas.
Selección
• Si conocemos el mecanismo por el cual el
agente actúa como controlador, ejemplo, un
antibiótico, y conocemos los genes
responsables de su producción y/o
regulación, entonces podemos diseñar
sondas que permitan seleccionar de todos
los aislamientos los que porten dicho gen.
Hongos y levaduras:
Caracterización de patógenos de citrus
1
2
3
4
5
6 7
8
9 10 11 12 13 14 15
RAPD 5
•
•
•
•
Penicillium digitatum
Penicillim italicum
Penicillium ulaiense
Pencilillium expansum
1
2
3
4
5
6 7
8
9 10 11 12 13 14 15
RAPD 9
1
2
3
4
5
6 7
8
RAPD 10
9 10 11 12 13 14 15
70
80
90
100
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
Penicillium
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
italicum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
digitatum
ulaiense
ulaiense
ulaiense
ulaiense
ulaiense
ulaiense
E2
N13
M4
N17
N3a
M27
A18
L10
L7
L6
M30b
E6
L11
N21b
M15
N20
M33
M34b
M20
CC
M7
A3
M8
E7
PP4
SB
N3c
CS
M1
M39
M2v
N4
N8
L12
B2
V3
B1
Xc
N25
V1
M5
7v
PP1
CA
N6a
N19b
Xa
N3u
M3
Caracterización de patógenos de manzanas
utilizando RFLP y RAPD
Fragmentos de restricción con Hae III
M1
8
9
Pb
Pv
Pc
M1
Fragmentos de restricción con Taq I
M1 M2
7
8
9
Ps
Pb Pv Pc
2
4
10
12 M2
Pv
Fragmentos de restricción con Hind III
M1 M2 Pc Pb
Ps
P7
PC AN P12 P13 P14 P15 P16 P17Pv M1
60
70
80
90
100
P. expansum 14
P. expansum 19
P. expansum 16
P. expansum 13
DSM 1994
P. expansum 3
P.expansum 17
P. expansum 4
P. expansum 2
P. expansum 15
P. expansum 10
P. expansum 12
DSM 2447
P. solitum 8
P. solitum 9
P. solitum 7
CBS 140.86
DSM 2215
Dendograma resultante de la amplificación con el
marcador RAPD 7 para cepas patógenas de manzanas
Diversidad genética de Aureobasidium
pullulans
(Postharvest Biol. Technol. 1999,17: 189-199)
Actividad biocontroladora de diferentes aislamientos
de A. pullulans en manzanas contra B. cinerea
AP-PCR realizados con los aislamientos de A. pullulans con
los primers: A: (GACAG)3 B: (GACA)4, C: (CAG)5
Amplificación por RAPD con el primer
D-20 de A. pullulans L47(1:cultivo puro)
y de los reaislamientos obtenidos de frutas
tratadas con el antagonista
Resultados:
• Alta variabilidad genética de 41 aislamientos de
frutas
• A. pullulans durante muchos años fue conocido
por diferentes nombres: extrema inestabilidad y
heterocarionte
(permitiendo
intercambios
genéticos durante la mitosis).
• Identificar un aislamiento específico es
fundamental cuando el agente es liberado al
ambiente y es necesario monitorear la dinámica de
la población.
Detección molecular de A. pullulans
Plant disease, 2001, 86:54-60
• 205 aislamientos con dos marcadores RAPD.
• Un fragmento característico de L4 se clona, secuencia y se
diseñan primers para región SCAR (sequence–
charactherized amplification region) y una ribosonda de
242 pb
• Límite de detección: 20 pg/ ml
• A partir de uno de los primers se obtiene un primer
Scorpion para detectar un amplicón de 150 pb por
fluorescencia para demostrar la presencia del agente al
penetrar la epidermis
Construcción de cepas de Pseudomonas con
actividad biocontroladora mejorada
• La colonización depende de muchos genes:
• los que codifican el flagelo,
• la señal de quimiotaxis,
• estructuras involucradas en la adhesión y fijación
(fimbrias, lipopolisacárido, etc) y
• multiplicación en los exudados de la raíz.
Ejemplo 1:
• Existe un sistema regulatorio de dos componentes;
ColS/ColR y una recombinasa sitio específica: Sss
necesarios para la colonización de Ps. fluorescens
WCS365
• Un mutante sss- no puede inducir la producción del
sideróforo pioverdina cuando hay un estrés de Zn+2. Si se
introduce un plásmido con el gen sss en mediocres
biocontroladores (cepas WCS307 y F113) aumenta su
actividad contra Fusarium (en un sistema de tomate).
Ejemplo 2:
• El transporte de hierro en Pseudomonas está
ligado a la producción de quelantes de alta
afinidad: pioverdina y salicilato. Estos compuestos
se unen al Fe+3, funcionan como sideróforos y
son reconocidos por receptores específicos en la
membrana externa.
• Dadas 2 P. fluorescens: WCS358 que posee una
variedad de receptores para sideróforos y WCS374
que sólo posee uno lo que le impide competir con
la anterior, si se expresa PupA (por introducción
de un plásmido) en esta cepa aumenta su
población y compite con la otra.
Ejemplo 3:
• Los antibióticos phenazine-1-carboxylic acid
(PCA) y 2,4-diacetylphloroglucinol (Ph1) actúan
contra Gaeumannomyces graminis (Ggt)
• Si en una cepa productora de Ph1 se introduce un
plásmido con la vía biosintética de PCA, se
potencia la actividad biocontroladora.
Conclusiones: las Ps. modificadas mejoraron su
actividad, resta minimizar la transferencia
horizontal (introducir modificaciones en el
cromosoma y no por medio de plásmidos)
Levaduras como agentes de biocontrol
en postcosecha:
1.
Rápidamente colonizan y permanecen largos períodos de
tiempo en la superficie de la fruta bajo diferentes
condiciones.
2. Utilizan los nutrientes limitando su disponibilidad para
los patógenos.
3. Son más resistentes a los fungicidas.
4. Ej: Pichia guilliermondii, Candida oleophila
PERO:
No poseen un comportamiento adecuado en condiciones
comerciales y deben suministrarse con bajas
concentraciones de fungicidas o con tratamientos
precosecha con un antagonista.
Expresión de un péptido antifúngico en
Saccharomyces
• Derivado del Cecropin A inhibe germinación de Colletotrichum
coccodes (patógeno de tomate)
• Amplificación de la región del antibiótico con primers específicos a
partir de una construcción previa
• Construcción de la fusión entre la secuencia señal de la levadura y el
fragmento amplificado y clonación en pRS413
• Transformación en la levadura
• Confirmación de la secuencia en una transformante (aislamiento y
secuenciado del fragmento)
• Análisis Fast protein liquid chromatography (FPLC) en extractos de la
levadura (producción del antibiótico)
• Ensayos de germinación del patógeno frente a extractos de la levadura
y ensayos de protección en la fruta