Download Congreso Nacional del XIV Verano de la Investigación Científica del

XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE UN PACIENTE AFECTADO POR
DEFICIENCIA DE ADHESIÓN LEUCOCITARIA TIPO 1 (LAD-1)
Ernesto Acevedo Ochoa. Química y Biología de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez,
[email protected]. Asesor Dr. Leopoldo Santos Argumedo. Centro de Investigaciones y Estudios
Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, [email protected].
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La deficiencia de adhesión leucocitaria tipo I es una inmunodeficiencia caracterizada por
la existencia de mutaciones en el gen ITGB2, el cual codifica para la cadena beta-2
(CD18) de las proteínas pertenecientes a la familia de las integrinas. En este estudio se
reporta el caso de un paciente, en el cual se observó previamente una nula expresión de
CD18 por citometría de flujo. Además, mediante estudios funcionales se observó una
capacidad limitada de las células del paciente para adherirse a diferentes sustratos, así
como una limitada función para fagocitar glóbulos rojos de carnero opsonizados. De
forma paralela se realizaron estudios de secuenciación mediante los cuales se identificó
una mutación en el RNA mensajero que codifica para esta proteína. Para confirmar que
el cuadro clínico del paciente es derivado directamente de esta mutación, es necesario
realizar una co-expresión del complejo integrina con la subunidad beta-2 en un sistema
heterólogo que corrobore el fallo en la expresión del heterodímero.
METODOLOGÍA
Se amplificó por PCR el RNA mensajero que codifica para CD18, a partir del cDNA del
paciente. Se realizó la clonación de CD18 en el vector pTracer CMV2 por medio de una
digestión previa del vector y del producto de PCR con enzimas de restricción adecuadas,
seguido de una reacción de ligación. Posteriormente se transformó el producto de la
reacción de ligación en bacterias competentes de la cepa DH5-, procediendo a la
selección de transformantes por medio del gen de resistencia a ampicilina presente en el
vector. Se realizará una co-transfección por electroporación de un vector de expresión
conteniendo el gen de CD11a y otro con el CD18 mutante del paciente a células de
ovario de hámster chino (CHO por sus siglas en inglés), debido a que éstas no expresan
integrinas beta-2. Posteriormente se realizará la cuantificación de la expresión de CD18
en la membrana de las células transfectadas por medio de citometría de flujo, utilizando
anticuerpos monoclonales específicos para teñir a ambas subunidades de integrina.
CONCLUSIÓN
A la fecha, el estudio por citometría de flujo de células CHO transfectadas se encuentra
en proceso. De acuerdo a los estudios realizados previamente y a la identificación de
una mutación en el gen ITGB2 del paciente, es posible predecir que el cuadro clínico
presentado es derivado de la herencia de una mutación en este gen, la cual impide la
expresión de esta proteína en la membrana de distintos leucocitos y que tiene por
consecuencia la deficiencia en la adhesión de las células del paciente, generando
distintos cuadros infecciosos.
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Agosto 2014