Download 34-68-2-SP

Institución Auspiciante del Trabajo: Universidad Politécnica Salesiana
Título: Composición química del aceite esencial de las hojas de Siparuna
schimpffii Diels (limoncillo).
Chemical composition by essential oil from leaves of Siparuna schimpffii Diels
(limoncillo).
Autores.
Paco Noriega Rivera
Investigador del Centro de Investigación y Valoración de la Biodiversidad de la
Universidad Politécnica Salesiana del Ecuador. Av 12 de Octubre y Wilson N2422
Quito-Ecuador.
Alessandra Guerrini.
Investigadora del Departamento de Ciencias de la Vida y Biotecnología (SVeB)-LT
Tierra & agua Tech UR7. Universidad de Estudios de Ferrara, C.so Ercole l d´Este
32,I-44121 Ferrara, Italia.
Edwin Ankuash Tsamaraint.
Investigador de la Estación Biológica Shakaim. Cantón Huamboya, Provincia de
Morona Santiago-Ecuador.
Autor para correspondencia: Paco Noriega Rivera. Email: [email protected]
RESUMEN
Introducción: Siparuna schimpffii Diels, conocida vulgarmente como limoncillo, es
una planta medicinal usada comúnmente por el pueblo Shuar del Ecuador por sus
propiedades analgésicas.
Objetivos: determinar la composición química del aceite esencial extraído de las
hojas de (limoncillo), Siparuna schimpffii Diels.
Métodos: se recolectaron las hojas de Siparuna schimpffii Diels. Posteriormente
se obtuvo su aceite esencial, mediante destilación en corriente de vapor. Para
identificar las moléculas presentes en el aceite se emplearon los métodos: GC,
GC/MS, cálculo del IK, y RMN.
Resultados: fueron detectados un total de 57 componentes, en 41 de ellos fue
determinada su estructura química, lo que equivale al 93,247%. Se confirmó la
estructura del componente mayoritario (germacrene D), por resonancia magnética
nuclear.
Conclusiones: el aceite muestra una composición química mayoritariamente por
compuesta por sesquiterpenos, sobresaliendo: Germacreno D 35,338%,
Biciclogermacreno 8,730%,  muuruleno 7,035%, Germacreno B 6,359% y
cadina-1(2),4-diene trans 5,161%.
Palabras Clave: Siparuna schimpffii Diels, aceite esencial, GC/MS, RMN.
ABSTRACT
Introduction: Siparuna schimpffii Diels, is commonly known as limoncillo, is used
as an analgesic for the indigeneus Shuar of Ecuador.
Objectives: determining the chemical composition of the essential oil extracted
from the leaves of Siparuna schimpffii Diels (limoncillo)
Methods: leaves were collected by Siparuna schimpfii Diels. Essential oil obtained
by distillation in steam current. In identifying essential oils molecules methods were
used: GC, GC/MS, identifying IK and RMN.
Results: 57 components were detected, in 41 it was determined their structure,
equivalent to 93,247%. The most abundant compound structure (Germacrene D)
was determined by nuclear magnetic resonance.
Conclusions: Major compounds are the sesquiterpenes, the most abundant are:
Germacrene D 35,338%, Bicyclogermacreno 8,730%,  muurulene 7,035%,
Germacrene B 6,359% y cadina-1(2),4-diene trans 5,161%.
Key words: Siparuna schimpffii Diels, essential oil, GC/MS, RMN.
INTRODUCCIÓN.
Dentro del género de las Monimiaceae del orden de las laurales, se tienen
alrededor de 34 géneros, muchos de ellos repartidos en las regiones tropicales y
subtropicales de América, el género Siparuna es el más importante de todos con
alrededor de 250 especies1.
Siparuna schimpffi Diels es un árbol o arbusto árbol nativo de los andes y
amazonia ecuatoriana, cuyo hábitat se comprende entre los 0-1500 msm2. Su
altura varía entre 2 y 10 metros de altura y alcanza un dbh de al menos 10 cm;
Ramitas jóvenes aplastadas en los nódulos, densamente cubiertas de pelosidades
de color amarillo-marrón en propagación. Hojas opuestas; peciolos 3-8,5(-10,5) cm
de longitud; lámina de color marrón claro, marrón rojizo o verdoso, cartácea de
obovada a elíptica de 18-36 x 11-18 cm, la base va de obtusa a aguda, el ápice
acuminado, la punta de 1-3 cm, la superficie de las hojas son sencillas
pubescentes cortas, en algunas ramificados con propagación de pelos por debajo
y en las venas secundarias, el margen es doblemente dentado-serrado. Las flores
frescas son de color amarillo,
taza floral masculina ampliamente obconical a
subgloboso, 2,5-3mm de diámetro, 1,5-2 mm de altura, cubierto con ramas cortas
simples, bífidas, o algunos pelos rectos, de vez en cuando algunos de estos
también del lado adaxial de los pétalos glabrescentes, los tépalos 4-5(-6)
triangulares o redondeados, 1-12mm de largo, el techo floral moderadamente
elevado, esencialmente glabro; estambres de 10-15. Apenas excerta en la antesis.
Taza floral femenina subglobosa, 2,5-3,2 mm de diámetro, 3,2 a 3,5 mm de altura.
Los sépalos similares a los de las flores masculinas, el techo floral casi plano
hundido alrededor del poro, el indumento similar al masculino, 15-20 estilos,
apenas excerta. Frutos con receptáculos globosos, de alrededor de 1,5 a 2 cm de
diámetro, con una superficie verrugosa y coronada por tépalos persistentes, de
color naranja amarillento a rojo y con un olor astringente3.
G.G. Leita˜o et al 1999 . Chemistry and pharmacology of Monimiaceae: a special focuson Siparuna and Mollinedia.
Journal of Ethnopharmacology 65 (1999) 87–102.
2
Jørgensen, P.M. & S. León-Yánez (eds.). 1999. Catalogue of the vascular plants of Ecuador. Monogr. Syst. Bot.
Missouri Bot. Gard. 75: i–viii, 1–1182.
3
S.S Renner, A.E Schawazbach, L Hohmann. Siparunaceae. Flora neotropica Vol 95: 103-104pp.
1
En Ecuador la planta al igual que otras del género Siparuna toma el nombre
común de limoncillo (Figura 1).
Figura 1. Siparuna Schiffii Diels (limoncillo). Fuente Herbario del Centro de
Investigación y Valoración de la Biodiversidad.
Son pocos los estudios químicos realizados en este tipo de especies. Son
destacables los estudios realizados en el aceite esencial de Siparuna thecaphora,
en donde se aprecia la presencia mayoritaria de: germacrene D, alfa y beta pinene
y trans caryophyllene4.
José F. Cicció, Jorge Gómez Laurito 2002. Volatile constituents of the leaves of Siparuna thecaphora (Siparunaceae)
from Turrialba, Costa Rica. Rev. biol. trop v.50 n.3-4 San José dic. 2002.
4
En
extractos
de
Siparuna
macrotepala
han
sido
identificados
varios
sesquiterpenos entre los que destacamos: cadalene, calamenene, 7-hydroxycalamenene, dimeros del
nuevos
compuestos
7-hydroxy-calamenene de configuración S,S, y dos
el
1-hydroxy-calamenene
y
el
1,6-
dimethyltetrahydronaphthalenone-45.
En Siparuna pauciflora se han detectado varios sesquiterpenos entre los que
destacan el germacreno sipaucina A, el elemano sipaucina B y sipaucina C.6
Sin lugar a dudas la especie que ha sido estudiada con mayor detenimiento es
Siparuna guianensis. Un estudio realizado en aceites esenciales de sus hojas y
frutos presenta en sus hojas como componentes mayoritarios al ácido decanoíco y
al 2-undecanona; mientras que en sus frutas tenemos al 2-undecanona,  pineno y
limoneno7. En esta especie existen otras investigaciones en donde se describen
composiciones químicas diversas como es aquella realizada en la amazonia
brasileña en donde se tienen como componentes más abundantes al epi--cadinol
y 2-udecanona y el terpinoleno8.
Para llegar a una determinación completa de las moléculas que componen un
aceite esencial una de las técnicas más empleadas es aquella que combina la
cromatografía gaseosa, comparación de índices de retención, cálculo de los
índices de Kovats y la espectrometría de masas910, que puede ser complementado
con estudios de Resonancia Magnética Nuclear11.
5
Hesham El-Seedi, Felipe Ghia and Kurt B.G. Torssell. Cadinane sesquiterpenes from Siparuna macrotepala.
Phytochemistry Vol 35(6) 2001: pp 1495-1497.
6
Kristina Jenett-Siems, Carola Kraft, Karsten Siems, Jasmin Jakupovic, Pablo N. Solis,Mahabir P. Gupta, Ulrich Bienzle
Sipaucins A–C, sesquiterpenoids from Siparuna pauciflora. Phytochemistry, Volume 63, Issue 4, June 2003, Pages
377–381.
Dominique C.H. Fischer, Renata P. Limberger, Amélia T. Henriques & Paulo R.H. Moreno Essential oils from fruits and
Leaves of Siparunaguianensis (Aubl.) Tulasne from Southeastern Brazil Journal of Essential Oil ResearchVolume
17, Issue 1, 2005.
7
8
Francisco A. Viana, Manoel Andrade-Neto, Yvone B.M. Pouliquen, Daniel E. A. Uchoa, Maria Milagros S.Z.
Sobral & Selene M. de Morais . Essential Oil of Siparuna guianensis Aublet from the Amazon Region of Brazil. Journal
of Essential Oil ResearchVolume 14, Issue 1, 2002.
Paco Noriega Rivera 2009. Extracción, química, actividad biológica, control de calidad y potencial económico de
los aceites esenciales. La Granja. Vol. 10(2). Pp 3-15. ISSN: 1390-3799.
9
MATERIALES Y MÉTODOS.
Recolección del material vegetal.
La muestras fueron recolectadas en la estación biológica Shakaim, Provincia de
Morona Santiago, cantón Huamboya, en el sur oriente ecuatoriano, ubicada en las
siguientes coordenadas geográficas: latitud S 02º03`52.2”, longitud
W
77º52`32.5”, altura 1200 msm. La Fecha de recolección fue el 24/02/2011, una
copia de la especie reposa en el herbario del Centro de Investigación y Valoración
de la Biodiversidad (CIVABI), de la Universidad Politécnica Salesiana del Ecuador,
No de ejemplar 0000913.
Extracción del aceite esencial.
La extracción del aceite esencial se realizó utilizando un destilador de acero
inoxidable de 250 litros de capacidad, el cual funciona con el mecanismo de
destilación de agua y vapor de agua. El equipo está diseñado de tal forma que
tanto el agua y el material vegetal se hallan en el mismo recipiente, se separan
entre sí por la presencia de una malla perforada, el agua permanece unos
centímetros por debajo de la planta y el calentamiento se lo hace de forma
directa12. El material vegetal empleado fue fresco.
Cromatografía Gaseosa acoplada a masas.
El aceite esencial fue analizado por cromatografía gaseosa acoplada a
espectrometría de masas (GC/MS). Se utilizó un equipo de cromatografía gaseosa
marca Varian GC, con una columna FactorFour Varian VF5ms (5%-fenil-95%dimetil-polisilossano; diámetro interno: 0,25 mm longitud: 30 m, film: 0.25 µm),
acoplado a un espectrómetro de masas Varian MS 4000.
10
Alessandra Guerrini, Gianni Sacchetti, Damiano Rossi, Guglielmo Paganetto, Mariavittoria Muzzoli, Elisa Andreotti,
Massimiliano Tognolini, Maria E. Maldonado, Renato Bruni (2009). Bioactivities of Piper aduncum L. and Piper obliquum
Ruiz & Pavon (Piperaceae) essential oils from Eastern Ecuador. Environmental Toxicology and Pharmacology 27 (2009)
39–48
11
Damiano Rossi, Alessandra Guerrini, Silvia Maietti, Renato Bruni, Guglielmo Paganetto, Ferruccio Poli, Laura Scalvenzi,
Matteo Radice, Katia Saro, Gianni Sacchetti. Bioactivities of Piper aduncum L. and Piper obliquum Ruiz & Pavon
(Piperaceae) essential oils from Eastern Ecuador. Food Chemistry 126 (2011) 837–848.
12
Sharapin, N. (1999). Fundamentos de Tecnología de Productos Fitoterapéuticos. CITED. pp 101-107.
Las condiciones operativas fueron las siguientes:
La muestra se preparó pesando 30mg del aceite esencial diluida en 1mL de
diclorometano, el volumen de inyección fue de 1uL.
Gas carrier He (1mL/min); programa de temperatura: de 55ºC a 100ºC a una
velocidad de 1ºC/min, de 100ºC a 250ºC a una velocidad de 5ºC/min, para
finalmente permanecer constante a esa temperatura por 15 minutos, la duración
total del análisis es de 90 minutos. Temperatura de inyector 280ºC; Split 1/50.
Las condiciones experimentales del espectrómetro de masas fueron las siguientes:
energía de ionización 70eV, corriente de emisión 10uA, 1scan/seg, rango del
análisis de masa 40-400 Da, temperatura de la trampa iónica 150ºC, temperatura
del transfer-line 300ºC.
Para la elucidación estructural el equipo cuenta con la base de datos NIST 2001
para la comparación de espectros de masas, complementariamente se analizó los
índices de retención teóricos de cada compuesto13.
Análisis del Germacreno D aislado por RMN.
El Germacreno D es aislado por cromatografía en capa fina preparativa en una
placa TLC 20x20 cm de gel de sílica 60F254, marca Merck; Rf= 0,80. La fase
móvil utilizada fue n-hexano, tomando como antecedente la investigación realizada
en separación de sesquiterpenos14.
Las condiciones del análisis RMN 1H fueron:
Espectrómetro de Resonancia Magnética Nuclear Varian Gemini-400, que opera a
399,97 MHz y a una temperatura of 303K, 4 mg de la fracción Rf 0,8 se disolvió en
13
Gianni Sacchetti, Silvia Maietti, Mariavittoria Muzzoli, Martina Scaglianti, Stefano Manfredini, Matteo Radice, Renato Bruni
(2005). Comparative evaluation of 11 essential oils of different originas functional antioxidants, antiradicals and
antimicrobials in foods. Food Chemistry 91 (2005):pp 621-632.
14
Renzo Bortolomeazzi, Pierpaolo Berno, Lorena Pizzale, and Lanfranco S. Conte (2001). Sesquiterpene, Alkene, and
Alkane Hydrocarbons in Virgin Olive Oils of Different Varieties and Geographical Origins. Journal Food and Feed
Chemistry 2001 Vol 49: pp3278-3283.
cloroformo deuterado (0,8mL) en un tubo de RMN de 5mm; la señal del solvente
para el espectro de calibración (1H 7,26 ppm). El espectro 1H uso un estándar
secuencial de pulso “s2pul”.
RESULTADOS.
Extracción del aceite esencial.
Se obtuvo el aceite esencial con un rendimiento promedio de 0,015%, de color
amarillo tenue y olor cítrico.
Composición química del aceite esencial.
El aceite esencial está compuesto mayoritariamente por hidrocarburos 91,689% , y
compuestos oxigenados 8,311% Figura No 2. De estas moléculas un 97,218% son
sesquiterpenos y un 2,782% monoterpenos.
Los
componentes
más
representativos
son:
Germacreno
D
Biciclogermacreno 8,730%,  muuruleno 7,035%, Germacreno B
35,338%,
6,359% y
cadina-1(2),4-diene trans 5,161% Figura No 3.
No
TR (min)
Compuestos
Método
de
IK ª
RAA% ᵇ
930
0,638
939
0,284
identificación
1
7,527
Thujene
GC/MS
2
7,647
-pinene
3
9,779
-pinene
GC/MS
979
0,187
4
10,667
Mircene
GC/MS
991
0,457
5
40,448
Undecanone (-2)
GC/MS
1294
1,216
6
44,315
-elemene
GC/MS
1338
0,374
7
45,595
-cubebene
GC/MS
1351
2,028
8
47,098
Cyclosativeno
GC/MS
1371
0,231
9
47,384
-Ylangene
GC/MS
1375
0,289
10
47,886
Copaene
GC/MS
1377
3,672
11
48,364
-bourbonene
GC/MS
1388
1,782
12
48,511
-cubebene
GC/MS
1388
0,223
13
48,828
Iso-longilofolene
GC/MS
1390
0,931
14
48,984
-elemene
GC/MS
1391
1,292
15
49,339
Nd
GC/MS
0,358
16
49,824
Nd
GC/MS
17
50,466
-Caryopyllene
GC/MS
1419
0,154
1,749
18
51,060
-copaene
GC/MS
1432
0,970
19
51,194
-guaiene
GC/MS
1439
0,318
20
51,418
Nd
GC/MS
0,619
21
51,746
Nd
GC/MS
0,363
22
51,991
cis-muurola-3,5-diene
GC/MS
1450
0,263
23
52,220
-humulene
GC/MS
1455
0,246
24
52,398
Nd
GC/MS
25
52,544
cis-muurola-4(14),5-diene
GC/MS
1467
0,589
26
52,822
 muuruleno
GC/MS
1478
7,035
25
53,027
Nd
GC/MS
0,214
28
53,200
Nd
GC/MS
1,654
29
53,387
Germecrene D
GC/MS, RMN
1485
35,338
30
53,641
-selenine
GC/MS
1490
0,478
31
53,747
-amorphene
GC/MS
1496
1,048
32
53,927
Bycliclogermacrene
GC/MS
1500
8,730
33
54,117
-muurolene
GC/MS
1500
1,409
34
54,253
-cuprene
GC/MS
1506
0,496
35
54,338
Nd
GC/MS
0,859
36
54,496
Nd
GC/MS
0,229
37
54,601
-cadinene
GC/MS
1514
1,614
38
54,821
Nooktatene
GC/MS
1518
5,161
39
54,941
Nd
GC/MS
40
55,280
-cadinene
GC/MS
1539
0,285
41
55,418
-calcorene
GC/MS
1546
0,464
42
56,089
Germacrene B
GC/MS
1561
6,359
43
56,722
(-)-Spathulenol
GC/MS
1578
1,408
44
56,987
Viridiflorol
GC/MS
1593
0,454
45
57,239
Guaiol
GC/MS
1601
0,408
46
57,340
Nd
GC/MS
0,267
47
57,634
Nd
GC/MS
0,166
48
57,858
1,10-di-epi-cubenol
GC/MS
1619
0,182
49
58,032
1-epi-cubenol
GC/MS
1629
0,134
50
58,109
Nd
GC/MS
0,282
51
58,206
Nd
GC/MS
0,407
52
58,384
Nd
GC/MS
0,519
53
58,620
Cedrelanol
GC/MS
1640
0,693
54
58,688
tau-Muurolol
GC/MS
1642
0,660
55
58,761
-muurolol
GC/MS
1646
0,294
0,196
0,249
56
58,986
-cadinol
GC/MS
57
60,095
Nd
GC/MS
% Total
1654
2,862
0,217
93,247
identificado
Figura No 2. Componentes del aceite esencial de hojas de Siparuna Shimpffi
Diels.
ª Compuestos por orden de elución en columna DB515,16.
ᵇ Porcentaje de área relativa (picos relativos en función del área total de los picos)
Figura No 3. Moléculas más abundantes del aceite esencial de hojas de Siparuna
Shimpffi Diels.
Análisis del Germacreno D aislado por RMN.
La Fracción aislada presento las señales siguientes Figura 4, la cual es
comparada con análisis previos de identificación para el Germacreno D en
investigaciones anteriores y que se detallan a continuación.
15
Adams, R.P (2001). Identification of essential oil components by gas-chromatography/quadrupole mass
spectrometry. Carol Stream Il, USA: Allured.
16
Adams, R.P (2009). Identification of essential oil components by gas-chromatography. Carol Stream Il, USA: Allured.
1H NMR: δ 5.78 (d, J = 15.7 Hz, 1H; H-5), 5.25; 5.25(dd, J = 10 and 15.9 Hz, 1H;
H-6), 5.13 (dd, J = 4.3 and10.1 Hz, 1H; H-1), 4.81 (d, J = 2.4 Hz, 1H; H-15a),
4.72(d,J = 1.7 Hz, 1H; H-15b), 2.40 (m, 1H; H-3a), 2.29 (m, 1H; H-2a), 2.22 (m, 2H;
H-9), 2.05 (m, 1H; H-3b), 2.01 (m, 1H; H-7), 1.98 (m, 1H; H-2b), 1.59 (s, 3H; H-14),
1.48 (m, 2H; H-8), 1.43 (m, 1H; H-11), 0.86 (d, J = 6.6 Hz, 3H; H-12), 0.81 (d, J =
6.6 Hz, 3H; H-13) 17.
Normalized Intensity
2.0 banda_rf08
1.5
1.0
0.5
9.5
9.0
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
Chemical Shift (ppm)
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
Figura 4. Espectro de Resonancia Magnética Nuclear de la Fracción aislada por
cromatografía preparativa correspondiente al Germacrene D.
DISCUSIÓN.
Los cinco componentes más abundantes encontrados en el aceite esencial de
Siparuna schimpffii Diels, son sesquiterpenos no oxigenados que representan el
62% de la totalidad del aceite.
Al comparar la composición química observamos que existe cierta similitud en los
componentes principales en los aceites extraídos
Siparuna thecaphora y
Chana de Medeiros da Silva,Aline Abati Bolzan,Carlos Augusto Mallmann,Patrícia Pozzatti,Sydney Hartz Alves,Berta
Maria Heinzmann (2010) . Sesquiterpenoids of Senecio bonariensis Hook. & Arn., Asteraceae. Brazilian Journal of
Pharmacognosy 20(1): 87-92, Jan./Mar. 2010
17
0.5
Siparuna pauciflora con el de Siparuna schimpffii Diels, de manera especial por la
presencia de los diversos tipos de isómeros del germacreno.
El conocer la composición química del aceite esencial de esta planta medicinal,
deja abierta la puerta para iniciar los estudios de actividad biológica, y de esta
manera
valorar
la
biodiversidad
farmacéuticas o cosméticas.
ecuatoriana
con
miras
a
aplicaciones