Download identificación de e. coli vs. shigella la finalidad del trabajo a realizar

IDENTIFICACIÓN DE E. COLI VS. SHIGELLA LA FINALIDAD DEL
TRABAJO A REALIZAR ES CONOCER EL FUNDAMENTO DE LOS
MÉTODOS EXISTENTES PARA LA IDENTIFICACIÓN MICROBIANA
INTRODUCCIÓN
En el siguiente estudio se pretende identificar cuáles de estas especies bacterianas se encuentran
en una muestra de procedencia por conocer.
GÉNERO SHIGELLA
Concepto
El Género Shigella se encuentra dentro de la Familia Enterobacteriaceae. Son bastones Gram
negativos (solos, en cadenas o de a pares), inmóviles, no esporulados, anaerobios facultativos,
fermentan la glucosa como fuente de energía y otros azúcares sin producción de gas ni SH 2, no
utiliza citrato de Simmons.
Todas las especies producen afecciones graves y muy contagiosas sobre el tracto gastrointestinal
(disentería bacilar), especialmente en ambientes de salubridad baja. Es aerobio, pero anaerobio
facultativamente.
El género está formado por Shigella dysenteriae (serogrupo A); Shigella flexneri (serogrupo B);
Shigella boydii (serogrupo C); Shigella sonnei (serogrupo D).
Propiedades Bioquímicas de Shigella spp.
GÉNERO ESCHERICHIA
Concepto
El Género Escherichia se encuentra dentro de la Familia Enterobacteriaceae. Está constituido
por bacterias con morfología bacilar, aunque las formas jóvenes son de tipo cocobacilar,
fermentadoras de glucosa, móviles, Gram negativo, fermentadores de lactosa con producción de
ácidos y gas, aguantan temperaturas altas (lo que permite diferenciarlo de otros coliformes),
resiste muy bien los agentes externos y es fácil encontrarla en el agua, alimentos... Es saprófito
de la flora aerobia y anaerobia facultativa del tubo
digestivo y, en general, la presencia de éste en aguas y
alimentos es indicativo de contaminación fecal reciente.
Suele crear trastornos gastrointestinales tipo diarreas
debido a la acción de ciertos antígenos, infecciones
urinarias, meningitis en neonatos y, en casos más
excepcionales, y graves bacteriemias.
Nos encontramos con dos especies: E. coli y E. blattae.
Clasificación Escherichia coli
E. coli es el organismo predominante en casi todos los excrementos. Tiene una finalidad útil, al
suprimir el crecimiento de ciertos organismos proteolíticos y al sintetizar grandes cantidades de
vitaminas. Es aerobio, pero facultativamente anaerobio. Es la causa más frecuente de las
infecciones del conducto urinario.
Puede ser móvil (flagelos períticos) o inmóvil. La mayoría de las variedades fermentan la
lactosa. Ensayada en IMViC (indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer y citrato), produce indol a
partir de triptófano, no produce H2S, no forma acetil-metil carbinol y no utiliza el citrato. Se
encuentra en el suelo, agua, en las plantas, en el tracto intestinal de los animales y en varios
alimentos, especialmente productos animales y aquellos manipulados por el hombre. Dada su
termosensibilidad, su presencia en productos pasteurizados o cocinados delata recontaminación
post-tratamiento.
Enrancia los alimentos, y algunas variedades son enteropatógenas o enterotóxicas por lo que son
utilizadas como indicador de contaminación fecal. Su efecto nocivo obedece a su facultad de
desarrollarse en sustratos varios, donde produce ácido y gas a partir de la mayoría de
carbohidratos y sintetiza sus propias vitaminas. Además de la formación de gases, hace que los
alimentos sepan y huelan a “fermentado”. Puede estar asociado con importantes síndromes
patológicos.
Escherichia Coli
Shigella
METODOLOGÍA
Para la identificación y clasificación de estas bacterias utilizaremos los siguientes
métodos:
Reconocimiento Morfológico
Cultivo de Shigella y E.coli respectivamente
Cultivo de Shigella y E.coli respectivamente (Vista acercada)
Tinción Diferencial de Gram
La tinción de Gram será una buena primera prueba para la muestra identificando si encontramos
bacteria Gram positiva o Gram negativa, siendo este último el caso de Shigella y Escherichia.
La tinción se deberá realizar de la siguiente manera lavando entre cada tincción exceptuando
tras el alcohol y la sapranina:

Primero se añade cristal violeta.

Luego se añade una solución de lugol.

Luego se añade alcohol.

Finalmente se añade safranina.
Interpretación (microscopio)


Si la bacteria es Gram positiva aparecerá de color violeta
Si la bacteria es Gram negativa aparecerá de color rosado.
Fundamento
Lo que la tinción de Gram realmente nos indica es si la bacteria tiene 2 membranas plasmáticas
con una capa de peptidoglicano en medio o una membrana plasmática (bacterias Gram -) y una
capa externa de peptidoglicano (bacterias Gram +).
Esto se debe a que en el proceso primero se ha teñido las células de violeta y se ha fijado con un
mordiente en los 2 pasos iniciales. Pero luego el alcohol ha disuelto y arrastró los lípidos. Por
tanto, las bacterias que en su parte más externa tengan lípidos, como la membrana plasmática
externa de las bacterias Gram -, perderán el color fijado que será arrastrado junto con la
membrana y se le fijará el tinte de safranina añadido al final.
En el caso de Shigella y Escherichia coli ambas pertenecen a la familia Enterobacteriaceae las
cuales son Gram negativas y por tanto tienen una membrana externa.
Si sometemos una muestra de un cultivo de estas especies a una tinción de Gram todas nos
aparecerían rosadas.
Pruebas Bioquímicas
Para distinguir entre la multitud de
especies enterobacterianas se
realizan una serie de pruebas que
sirven para identificar una
característica particular de cada
género. Entre éstas las que
aparecen en la tabla van a ser
utilizadas para diferenciar entre la
E.coli y Shigella:
Diferenciación de Shigella spp. y
E. coli.
PRUEBA DEL MUCATO
El propósito de la prueba es identificar si el microorganismo en cuestión es capaz de utilizar el
ácido múcico o el mucato como fuente de carbono.
Procedimiento
Se prepara un medio de cultivo con ácido múcico y NaOH para que formen mucato sódico.
Luego se añade azul de bromotimol, que será nuestro indicador, y se busca el pH neutro
mediante NaOH y HCl. Luego se coloca la muestra en este medio en un tubo de ensayo y se
cultiva a 37ºC durante 48 horas comprobando cada 24 horas.
Viraje del Indicador
El azul de bromotimol es:
Azul: pH > 7,6
Verde: 7,6 > pH > 6
Amarillo: pH < 6
Interpretación
Si el bromotimol cambia a amarillo querrá decir que el microorganismo metaboliza el mucato
acidificando el medio. En cambio si no utiliza el mucato el medio permanecerá azul-verdoso sin
viraje del indicador.
Ensayo positivo: viraje del color al amarillo o amarillo verdoso.
Ensayo negativo: no hay cambio de color el medio permanece azul verdoso.
Para el caso de Shigella y E. coli:
Shigella: mucato (-)
E. coli: mucato (+)
PRUEBA DEL ACETATO
El propósito de la prueba es identificar si el microorganismo en cuestión es capaz de utilizar
acetato como única fuente de carbono y energía.
Procedimiento
Se prepara un medio de cultivo en el cual el acetato sódico es la única fuente de carbono y sales
inorgánicas de amonio son la única fuente de nitrógeno. Se añade azul de bromotimol, que será
nuestro indicador, procurando un medio neutro. Luego se cultiva con una parte muestra a 37ºC
durante 48 horas comprobando cada 24 horas.
Viraje del Indicador
El azul de bromotimol es:
Azul: pH > 7,6
Verde: 7,6 > pH > 6
Amarillo: pH < 6
Interpretación:
Si utilizan el acetato como fuente de carbono durante el proceso se descomponen las sales de
amonio en amoníaco. Este aumento de la concentración de amoníaco incrementa el pH
cambiando el color a azul. Si por el contrario no se está utilizando el acetato permanecer verde.
Ensayo positivo: viraje del color al azul.
Ensayo negativo: no hay cambio de color el medio permanece verde.
Para el caso de Shigella y E. coli:
Shigella: acetato (-)
E. coli: acetato (+)
PRUEBA DEL CITRATO DE CHRISTENSEN
El propósito de la prueba es indentificar si el microorganismo en cuestión es capaz de usar el
citrato como fuente de carbono y energía en presencia de nitrógeno orgánico. Es muy similar al
citrato de Simmons que es con nitrato inorgánico. También se conoce a esta prueba como la
prueba de urea de Christensen.
Procedimiento
Se prepara un medio de cultivo con citrato amónico de hierro (III) como la única fuente de
carbono y nitrógeno. Se añade el rojo de fenol como indicador. Se introduce la muestra a
identificar y se incuba a 35ºC durante 48 horas comprobando cada 24 horas. Se debe dejar los
tubos destapados para que se desprenda el anhídrido
carbónico.
Viraje del Indicador
El rojo de fenol es:
Rojo: pH > 8,2
Amarillo: pH < 6,8
Interpretación
Si utilizan el citrato como fuente de carbono durante el proceso se forma también amoníaco.
Este aumento de la concentración de amoníaco incrementa el pH cambiando el color a rojo. Si
por el contrario no se está utilizando el acetato permanecer amarillo.
Ensayo positivo: viraje del color al rojo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color el medio permanece amarillo.
Para el caso de Shigella y E. coli:
Shigella: citrato de Christensen (-)
E. coli: citrato de Christensen (+)
PRUEBA DEL INDOL
El propósito de la prueba es identificar si el microorganismo en cuestión es capaz de producir
indol a partir del amino ácido triptófano.
Fundamento
El indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio rico
en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehídos
para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido para detectar
organismos productores de indol.
Como indicador de la presencia del aldehído se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente útil
en la identificación preliminar de Escherichia coli. (Dr. Carlos G. Malbran, 2005)
Procedimiento (Raquel Granados Pérez, Mª Carmen Villaverde Peris, 2007):
Se prepara un medio de cultivo ácido al que se le añade p-dimetilaminobenzaldehído para que
reaccione con el indol. El indol se extrae del cultivo en agua de peptona con un pequeño
volumen de xilol, añadiéndose luego el reactivo. (Ramón Parés y Antonio Juárez, 1997).
Método de Kovacs
-
En el tubo con agua de peptona, se siembra el microorganismo problema. El medio de
cultivo es el agua de peptona, pues este medio tiene triptófano. El medio no debe tener
glucosa, pues la fermentación de la glucosa eleva la acidez del medio y puede inhibirse
la triptofanasa, ya que el enzima triptofanasa, actúa a un pH óptimo de 7.4-7.8
-
-
Incubar a 37 ºC, durante 24-48 horas.
Añadir al cultivo 5 gotas de reactivo indol de Kovacs. El reactivo indol de Kovacs debe
ser fresco, pues con el tiempo cambia el color de amarillo a castaño y pierde
sensibilidad. Puede conservarse en nevera a 4-10 ºC algunos días, debe conservarse en
frasco color topacio con cierre hermético.
Agitar suavemente el tubo y dejarlo unos minutos en reposo.
Método de Ehrlich
-
-
En el tubo con agua de peptona, se siembra el microorganismo problema. El medio de
cultivo es el agua de peptona, pues este medio tiene triptófano. El medio no debe tener
glucosa, pues la fermentación de la glucosa eleva la acidez del medio y puede inhibirse
la triptofanasa, ya que el enzima triptofanasa, actúa a un pH óptimo de 7.4-7.8
Incubar a 37 ºC, durante 24-48 horas.
Añadir 1ml de éter etílico al cultivo y esperar a que suba a la superficie del tubo.
Añadir 5 gotas de reactivo de Ehrlich resbalando por las paredes del tubo.
Interpretación de los resultados con el método de Kovacs
Indol positivo: aparece un anillo color rojo en la superficie del medio.
Indol negativo: el medio toma el color del reactivo añadido en su
superficie.
Interpretación de los resultados con el método de Ehrlich
Indol positivo: aparece en la superficie de la capa acuosa un anillo
rojo. Nunca se observa en la etérea.
Indol negativo: la capa acuosa toma el color del reactivo de Ehrlich
amarillento.
PRUEBA DE LA ORNITINA DESCARBOXILASA
El propósito de la prueba es identificar si el microorganismo en cuestión utiliza el amino
ornitina como fuente de energía. De ser así estará presente la enzima ornitina descarboxilasa. No
todas la usan y por ello sirve de identificador.
Procedimiento
Se prepara un medio de cultivo con ornitina y una cantidad moderada de
glucosa. El indicador bromocresol púrpura será también será el indicador.
Se cultiva en este medio durante 48 horas a 35-37ºC comprobando cada 24
horas.
Viraje del Indicador
El bromocresol púrpura es:
Púrpura: pH > 6,8
Amarillo: pH < 5,2
Interpretación
Primero el organismo utilizará la glucosa y con ello el pH descenderá cambiando el bromocresol
de púrpura a amarillo. En este medio ácido la enzima ornitina descarboxilasa actuará si presente.
La enzima para aprovechar el carbono del amino ácido lo descarboxila en este proceso se
liberan las diaminas cadaverina y putrescina que incrementan el pH recuperando el color
púrpura del bromocresol púrpura.
Ensayo positivo: viraje del de amarillo a púrpura.
Ensayo negativo: no hay cambio de color, permanece amarillo.
Para el caso de Shigella y E. coli:
Shigella: ornitina descarboxilasa (-). Aunque Shigella sonnei es ornitina descarboxilasa (+)
E. coli: ornitina descarboxilasa (+) pero también puede ser (-)
PRUEBA DE LA GLUCOSA (GAS)
El propósito de la prueba es ver si el microrganismo en cuestión es capaz de fermentar glucosa
como fuente de carbono a base de ver si esta fermentación produce compuestos gaseosos.
Procedimiento
Se prepara un medio de cultivo con glucosa y el indicador rojo de fenol. Como la reacción de
fermentación puede emitir algún gas que nos interesa usaremos unos tubos de durham para
retener el gas. Se trata de unos tubos invertidos de menor tamaño que contienen el medio de
cultivo y al producirse el gas retendrán las burbujas. Se añade la muestra y se cultiva a 37ºC
durante 24 horas.
Viraje del Indicador
El rojo de fenol es:
Rosa/Magenta: pH > 8,2
Rojo: 8,2 > pH > 6,8
Amarillo: pH < 6,8
Interpretación
La fermentación de la glucosa produce hidrógeno y CO2. Estos gases reducen el pH del medio y
viran el color rojo del rojo de fenol. De no producirse gas no virará. Además se verá el depósito
de gas en el tubo de durham indicando su producción.
Ensayo positivo: viraje del rojo a amarillo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color, permanece rojo.
Para el caso de Shigella y E. coli:
Shigella no produce gas de la fermentación de la glucosa por tanto daría un resultado negativo.
E. coli produce gas de la fermentación de glucosa por tanto daría un resultado positivo.
PRUEBA DE LA SACAROSA
El propósito de la prueba es ver si el microorganismo en cuestión es capaz de fermentar el
disacarido sacarosa (glucosa+fructosa).
Procedimiento
Se prepara un medio de cultivo con sacarosa. Se le añade el indicador rojo de fenol. Se añade la
muestra y se cultiva 24 horas a 37ºC.
Viraje del Indicador
El rojo de fenol es:
Rosa/Magenta: pH > 8,2
Rojo: 8,2 > pH > 6,8
Amarillo: pH < 6,8
Interpretación
La fermentación de la sacarosa descenderá el pH por lo que el indicador
virará a amarillo. De no fermentarse permanecerá rojo.
Ensayo positivo: viraje del rojo a amarillo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color, permanece rojo.
Para el caso de Shigella y E. coli:
Shigella puede dar resultado tanto positivo como negativo.
E. coli puede dar resultado tanto positivo como negativo.
PRUEBA DE LA MOVILIDAD
El propósito de la prueba es medir la capacidad de propulsión del microorganismo en cuestión
por medio de flagelos, pero la presencia de flagelos no implica movilidad.
Procedimiento
Se prepara un medio de cultivo llamado agar de movilidad que es
semisólido. Luego se pincha la muestra con la punta de un asa de pico
y se pincha luego el medio con el agar de movilidad.
Interpretación
Si el microorganismo no es móvil tendrá lugar una franja lineal en la
zona donde fue pinchado. Si el microorganismo es móvil se
distribuirá por el medio.
En el caso de Shigella y Escherichia:
Shigela no es móvil por tanto daría un resultado negativo.
E. coli puede ser o no móvil por lo que puede dar un resultado tanto positivo como negativo.
En el caso de ser del género Shigella
para identificar de que especie se
trata utilizaríamos las siguientes
pruebas bioquímicas:
Pruebas bioquímicas para identificar especies de Shigella
PRUEBA DEL D-Manitol
El propósito de la prueba es determinar si es microorganismo en cuestión
es capaz de fermentar el manitol.
Procedimiento
Se prepara un medio de cultivo con manitol. Se añade el indicador rojo de
fenol y la muestra y se cultiva a 37ºC.
Viraje del Indicador
El rojo de fenol es:
Rosa/Magenta: pH > 8,2
Rojo: 8,2 > pH > 6,8
Amarillo: pH < 6,8
Interpretación
La fermentación del manitol acidifica el medio y disminuye el pH haciendo virar al indicador.
Si no fermenta el manitol permanecerá el color rojo.
Ensayo positivo: viraje del rojo a amarillo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color, permanece rojo.
Permite identificar a la especie Shigella dysenteriae que es la única d-manitol negativa de las
especies Shigella flexneri, Shigella sonnei y Shigella boydii que son positivas.
PRUEBA DEL ONPG
El propósito de la prueba es ver si el microorganismo en cuestión es capaz de fermentar la
lactosa. En este proceso participa una enzima llamada beta-galactosidasa por ello se busca
identificar la presencia de esa enzima que confirma la capacidad de fermentar la lactosa.
Procedimiento
Se prepara un medio de cultivo conlactosa y ONPG (ortonitrofenil-b-D-galactopiranosido). Se
añade la muestra y se cultiva a 37ºC durante 24horas.
Interpretación
El ONPG se usa una molécula “señuelo” ya que también interacciona con la
enzima pero en este caso cambia a color amarillo en presencia de la enzima
debido a la producción de orto-nitrofenol.
Ensayo positivo: color amarillo.
Ensayo negativo: no hay cambio de color permanece transparente.
Sirve de prueba identificadora de la especie Shigella sonnei ya que del resto de las Shigellas es
la única capaz de fermentar lactosa.
Raquel Terragno, María Inés Caffer y Norma Binsztein (2007), indican que las pruebas citrato
de Christensen, acetato de sodio y mucato de sodio son de valor en la diferenciación de los
miembros del género Shigella y Escherichia, particularmente de biotipos anaerogénicos, no
móviles, porque los aislamientos que fermentan mucato o son alcalinos en agar acetato o citrato
de Christensen es muy probable que sean E.coli.
RESULTADOS
Para identificar la especie que se encontraba en la muestra decidimos guiarnos por el siguiente
flujo grama y realizar las pruebas más convenientes.
Se realizaron las pruebas que se creyeron más adecuadas para la identificación de Shigella o E.
coli y los resultados fueron los siguientes:
Tinción de Gram
Mucato
Acetato
Glucosa (Gas)
-
A raíz de los resultados
se realizaron las últimas
pruebas y se obtuvieron
los siguientes resultados:
D-Manitol
ONPG
+
+
DISCUSIÓN
A la vista de los resultados vimos que la muestra presentaba organismos Gram negativos. Por
ello sabíamos que podía ser alguna de las enterobacterias buscadas.
Para discernir entre Escherichia coli y Shigella se uso la prueba del mucato, acetato y glucosa
(gas). La del mucato dio negativo por lo que ya era muy probable que fuese Shigella, luego las
siguientes 2 pruebas del acetato y glucosa (gas) dieron negativo por lo que confirmaban que se
trataba de Shigella.
Tras confirmarlo se decidió determinar la especie con más pruebas bioquímicas en este caso las
adecuadas son la del D-Manitol y la del ONPG. A partir de la prueba del D-manitol obtuvimos
datos resultado positivo permitiendo descartar a la Shigella dysenteridae y la ONPG también
dio positivo confirmando que se trataba de la especie Shigella sonnei.
BIBLIOGRAFÍA
Raquel Granados Pérez, Mª Carmen Villaverde Peris (2003), Microbiología (Tomo I), Editorial
Paraninfo.
Raquel Granados Pérez, Mª Carmen Villaverde Peris (2007), Microbiología (Tomo II), Editorial
Paraninfo.
Raquel Terragno, María Inés Caffer y Norma Binsztein (2007) Manual de procedimiento.
Diagnóstico, aislamiento y procedimiento de Shigella spp., Departamento de bacteriología,
Organización Panamericana de la Salud.
Adrian N. C. Delaat (1976), Microbiología, Nueva editorial interamericana.
Lansing M. Prescott, John P. Harley y Donald A. Klein (2000), Microbiología, McGrawHill.
Jorge J. Banwart (1982), Microbiología básica de los alimentos, Ediciones Bellaterra.
Ramón Parés y Antonio Juárez (1997), Bioquímica de los microoganismos, Editorial Reverté.
I. Poilane y A. Collignon (2006), Biodiagnóstico de las diarreas agudas bacterianas y virales,
Acta bioquímica clínica latinoamericana.
Página oficial de Intuitive Systems Inc.