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TRABAJO PRÁCTICO N° 4
Virología e Investigación Parte 1: Propagación de virus. Fundamentos de la
cuantificación de especímenes virales. Titulación de virus.
OBJETIVOS:
1- Comprender la metodología empleada para generar un stock viral a partir de
cultivos celulares.
2- Identificar y comprender diferentes formas de cuantificar una stock viral.
3- Calcular el título de una muestra de células infectadas por el Virus de la Bursitis
Infecciosa Aviar y otra por Rotavirus SA-11 por el método de placas de lisis.
TEORÍA
Para aislar, caracterizar, identificar virus, producir vacunas y realizar
estudios diversos de investigación en el área de la Virología se requieren altas
cantidades de virus. Para ello, podemos hacer uso de diferentes herramientas que
ya hemos detallado en prácticos anteriores, y que recordaremos a continuación:
• Animales de laboratorio:
Los mismos se utilizan durante la propagación viral en organismos
susceptibles sanos, sin embargo como hemos visto anteriormente, su uso está
limitado por razones éticas y por el avance de otras metodologías menos
cuestionadas a este nivel. Sin embargo siguen siendo útiles para el aislamiento y
propagación de virus que no son fácilmente obtenidos en cultivos o huevos
embrionados.
• Huevos Embrionados:
Fue el primer método utilizado para la propagación de virus en tejidos
animales; previo a cultivos de células y tejidos. Actualmente es utilizado para
propagación de virus de aves y muy utilizado para atenuar virus de vacunas a
virus atenuado.
• Cultivo de Células/Tejidos:
Los cultivos celulares son los más ampliamente utilizados para el trabajo
con virus, ya que además de representar una herramienta útil, el uso de líneas
celulares no supone un dilema ético. Además, hoy en día, se han desarrollado tal
cantidad de líneas celulares, que la mayoría de los virus que deseamos estudiar,
poseen al menos una línea celular comercial que es susceptible a la infección.
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Una vez que hayamos definido el sistema de estudio que vamos a utilizar
para aislar el virus en estudio, existen dos formas de poder identificar su infección:
la forma cualitativa y la cuantitativa. Si hablamos de cualificar una determinada
muestra que contiene virus, debemos demostrar las lesiones específicas que el
mismo genera en el huésped (que puede ser: un animal de experimentación, un
embrión de pollo o un cultivo celular). Esta metodología nos permite decir si una
muestra es positiva o negativa a la presencia de virus. Sin embargo si nuestro
objetivo es medir la actividad biológica de una suspensión de virus, es decir,
determinar la cantidad de partículas virales infectivas, entonces la información que
nos brindan las metodologías cualitativas no es suficiente.
Ahora bien...¿En qué casos sería útil conocer el número de partículas
virales infectivas que existe en determinada muestra? Son diversas las situaciones
en las cuales el conocer el número de partículas virales infectivas es importante y
necesario, por ejemplo: durante el desarrollo de estudios epidemiológicos para
determinar la virulencia de cepas circulantes en una población de animales
infectados, en el desarrollo de vacunas a virus atenuado, en la generación de
clones virales, y en todos los estudios de investigación que se realicen tanto in
vivo como in vitro, a fin de evaluar múltiples aspectos relacionados con la
interacción virus-huésped.
Lo primero en lo cual podemos pensar en el momento de hablar de
cuantificación de virus, es el microscopio electrónico. Sin embargo, a pesar de que
este instrumento ha sido enormemente valioso para acercarnos al entendimiento
de la estructura de los virus, no tiene mayor valor a la hora de medir la actividad
biológica del virus, ya que no todas las partículas observables al microscopio
electrónico son infecciosas. Por ejemplo, en el caso del virus de la influenza que
es altamente infeccioso, solo 1 de cada 15 partículas virales producidas en una
célula infectada va a resultar infecciosa. Entonces, la técnica de microscopía
electrónica permite poder estimar el número de partículas virales totales, pero
este valor no me permite determinar cuántas de estas partículas víricas son
capaces de infectar y generar una nueva progenie viral. Otro sistema comúnmente
utilizado para estimar el número de partículas virales totales, cuya metodología es
enormemente más sencilla, rápida y económica, es la técnica de hemaglutinación.
Aunque, solo los virus que tienen capacidad hemaglutinantes pueden ser
"cuantificados" por este método. Los principales virus en este grupo son los de las
familias de Ortomixoviridae y los Paramixoviridae. La unidad hemaglutinante
(UHA) será la dilución con la mínima concentración de virus que es capaz de
aglutinar glóbulos rojos en forma completa. Si bien la HA se puede considerar en
algún punto como una "actividad biológica" de los virus, no todas las partículas
virales que causen HA son necesariamente infecciosas, ya que la HA es una
propiedad de las superficies externas del virus y no nos dice nada sobre la
integridad de la información genética de la partícula viral, y por lo tanto no nos está
dando idea de la capacidad de esas partículas hemaglutinantes, para producir una
infección productiva.
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Entonces, para poder estimar la actividad biológica de determinada muestra
que contiene virus, necesitamos disponer de un sistema biológico en el cual las
partículas virales de mi muestra interaccionen con células susceptibles a la
infección, y luego de un determinado tiempo y utilizando la técnica indicada,
podamos calcular cuántos virus infectivos tenía la muestra que utilizamos para
infectar ese sistema. Este procedimiento, que consiste en determinar la cantidad
de unidades infecciosas por unidad de volumen, se denomina: Titulación Viral, y
según la técnica que utilicemos para titular virus, el resultado de la misma se
expresará en unidades diferentes. Por ejemplo, como veremos en más detalle en
los párrafos siguientes, en la técnica de placas de lisis, el resultado de la titulación
se expresa en Unidades Formadoras de Placa/ml, mientras que en la técnica de
titulación por inmunofluorescencia, el resultado se expresa en Unidades de Focos
Fluorescentes (FFU/ml). A pesar de las distintas formas de expresarse, las
diferentes técnicas de titulación nos informan la cantidad de unidades infecciosas
que hay presentes en un determinado volumen de muestra.
METODOLOGÍAS PARA LA CUANTIFICACIÓN DE INFECCIONES VIRALES:
TITULACIÓN VIRAL
El primer paso a la hora de cuantificar partículas virales infectivas en una
muestra consiste en realizar diluciones del virus. El método más utilizado es aquel
que utiliza diluciones ya sea decuples, dobles o logarítmicas, y en la cual
interviene un soluto y un diluyente (Figura 1). El diluyente utilizado dependerá de
la técnica que utilicemos para la infección, por ejemplo si trabajamos con el
material de cosecha de huevos embrionados, podríamos utilizar solución
fisiológica, si trabajamos con cultivos celulares generalmente la muestra se va
diluyendo en el medio de cultivo.
Figura 1: Esquema de la preparación de diluciones seriadas decimales (logarítmicas) a partir
de una muestra que contiene virus.
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Una vez que hayamos definido diferentes diluciones del virus con las que
nos proponemos trabajar, ahora debemos evaluar qué técnica vamos a utilizar
para evidenciar la infección y posteriormente cuantificarla.
"Recuerda que la estimación del número de partículas virales infectivos o
unidades infectivas por unidad de volumen se conoce con el nombre de
titulación."
A continuación se describen algunas de las técnicas de titulación más
utilizadas en Virología.
1- TITULACIÓN DE VIRUS POR EL MÉTODO DE
PLACAS DE LISIS:
CUANTIFICACIÓN DE UNIDADES FORMADORAS DE PLACA.
En el método de las unidades formadoras de placa (UFP), varias
monocapas celulares se infectan con diluciones seriadas de la suspensión del virus
en estudio (preparado como se muestra en la Figura 2). Después de una o dos
horas de adsorción ( tiempo que se les da a las partículas virales para que
contacten con las células en monocapa) se cubren las monocapas con un medio
semisólido a fin de limitar el desplazamiento de las partículas virales, y de este
modo favorecer la formación de placas de lisis que sean fácilmente reconocibles a
simple vista. Entonces, allí donde un virus infectivo (una Unidad Formadora de
Placa(UFP)) ha infectado a una célula, aparecerá al cabo de 2-3 ciclos de infección
una placa de lisis visible a nuestros ojos, resultante de la infección de las células
adyacentes a la inicialmente infectada (Figura 3 ). Este método puede ser utilizado
para titular una amplia gama de virus que son capaces de formar placas de lisis en
cultivo, luego de varios días de infección; sin embargo, existen virus que no forman
placas de lisis, y en este caso, la titulación para este tipo de especímenes debe
realizarse por otro método, como son el de inmunofluorescencia o Reed y Muench.
Para poder visualizar las placas de lisis, las monocapas celulares se
deben teñir con un colorante, como por ejemplo el cristal violeta, el cual va a
incorporarse a las células que se conserven aún en la monocapa. De esta forma,
las placas podrán contarse fácilmente, pues donde no hayan células, el colorante
no penetrará y veremos "agujeritos" que representan a cada placa de lisis.
Observa que en la Figura 4 las primeras diluciones del virus (-1 a -3), en donde el
mismo está más concentrado, se han formado tantas placas de lisis que
prácticamente toda la monocapa de células desaparece, mientras que en las
diluciones mayores (-4 y -5) donde hay menos virus, se produce un menor número
de placas de lisis, llegando a una dilución en la cual el número de placas se puede
contar perfectamente, sin que haya interferencia de placas vecinas (dilución -5). Es
muy importante dejar un pocillo de células como control de células no infectadas,
en cuyo caso no debemos observar ninguna placa de lisis, es decir debemos
visualizar una monocapa homogéneamente teñida de violeta e intacta.
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Figura 2: Preparación de diluciones seriadas para el método de placas de lisis. Formación
decreciente de placas de lisis según la dilución utilizada para infectar las monocapas.
Figura 3: Esquema de la formación de una placa de lisis
Entonces, una vez que hayamos podido contar el número total de placas
de lisis que se encuentran presentes en la mayor dilución de virus que resultó
positiva par a la infección (en el ejemplo de la Figura 4 sería la dilución -5),
entonces expresaremos el título del virus en unidades formadoras de placa por
mililitro (UFP/ml). Para ello, aplicamos el siguiente cálculo:
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número de placas x 1/dilución x 1/ml de inóculo= PFU/ml
Figura 5: Placa de 6 pocillos en donde se ha realizado la titulación de un virus que forma
placas de lisis.
"Recuerda que una unidad formadora de placa corresponde a una partícula
viral infectiva capaz de generar una placa de lisis en una monocapa celular
susceptible a su infección."
EJERCICIO
¿Cual es el título del virus que ha sido titulado como se muestra en la Figura
4?
20 x 1/ 1x10-5 x 1/0,5ml= 4X106 PFU/ml
- 20 es el número de placas que contamos en la dilución -5, que es la mayor
dilución en la cual veo placas que puedo contar fácilmente.
- 1x10-5 es la mayor dilución de virus en la cual cuantificamos las placas.
- 0,5 ml es el volumen de las distintas diluciones con las cuales infectamos
las monocapas.
2- TITULACIÓN POR TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA
Si bien, como vimos anteriormente, la Inmunofluorescencia es una técnica
serológica muy utilizada para realizar el diagnóstico directo e indirecto de una
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gran cantidad de virus, no debemos confundirlo con la explicación siguiente, que
trata sobre la titulación de especímenes virales de una muestra con el fin de
determinar la cantidad de partículas virales infectivas por unidad de volumen y el
resultado se expresa en Unidades Formadoras de Focos/ml (FFU/ml).
La cuantificación de partículas virales infectivas por focos fluorescentes es
una metodología mucho más rápida que la metodología anterior, que resulta útil
en el caso de virus que no generen placas de lisis fácilmente detectables . El
ensayo detecta focos de fluorescencia, mediante el uso de anticuerpos que
reaccionen con las células infectadas por el virus (Figura 6).
El principal limitante de esta técnica es el costo económico que genera el
uso de grandes cantidades de anticuerpos por ensayo. Además se necesita un
microscopio fluorescente invertido.
Figura 6: Titulación por inmunofluorescencia
Según el formato que presente, el ensayo puede ser directo o indirecto,
dependiendo de la cantidad de anticuerpos utilizados (Figura 7).
Figura 7: Representación esquemática de los dos tipos de metodología empleadas para
titular un virus por inmunofluorescencia
En este caso, la fórmula utilizada para cuantificar la infección es la siguiente:
focos de fluorescencia x 1/dilución x 1/volumen de inóculo= FFU/ml
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3- TITULACIÓN POR TÉCNICA DE REED Y MUENCH/ DILUCIÓN LÍMIT/ TICD
50
Si pensamos en los virus como "venenos", una de las unidades de más
frecuente uso de medida de la actividad viral, es la dosis letal 50% (DL50). Esta
unidad representa la concentración mínima de una suspensión viral que es capaz
de matar al 50% de los huéspedes indicadores. En un principio, los virus se
probaban en los mismos huéspedes naturales. Posteriormente, los modelos
animales fueron reemplazados por los huevos embrionados, los ratones lactantes
y posteriormente los cultivos celulares. En este último caso, la unidad de medida
de la actividad viral es la TICD 50 (Tissue Culture Infectious Dose50). Esta se
utiliza cuando se está trabajando con células y consiste en calcular la menor
concentración del virus que es capaz de producir un efecto citopático en el 50% de
las células inoculadas. Para ello, se realizan diluciones seriadas del virus, en
escala logarítmica (-1, -2, -3, -4, etc) y luego se inocula una cantidad constante de
cada dilución a cada uno de los pocillos que van a contener las monocapas a
infectar.
El cálculo del título viral se hace a simple vista o con la ayuda de un
microscopio óptico, determinando la dilución que mata a aproximadamente el 50%
de las células.
Reed and Muench idearon un algoritmo para poder calcular el TICD50 y
posteriormente, mediante una serie de cálculos matemáticos en los cuales
interviene un factor de conversión, el resultado de TICD50 puede ser transformado
en unidades de PFU/ml.
En la Figura 8 podemos observar cómo a medida que aumenta el número
de diluciones del virus (es decir que disminuye la cantidad de virus presente en
cada dilución), disminuye la cantidad de positivos (pocillos positivos por presentar
efecto citopático) hasta llegar a la dilución -10 en la cual ninguno de los pocillos
que han sido inoculados con dicha dilución del virus son positivos. Por otro lado,
observa también la importancia de los pocillos control, los cuales siempre deben
ser negativos pues no han sido inoculados con virus.
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Figura 8: Esquema de titulación por técnica de Reed and Muench
PRÁCTICA:
1- Resolveremos las dudas relacionadas al marco teórico del trabajo práctico
2- Observaremos los elementos de cultivo y equipamiento necesarios para
generar un stock viral del Virus de la Bursitis Infecciosa Aviar en cultivo de células
QM7 y del SA-11 Rotavirus en células MA104. Luego de esta actividad los
alumnos deberán confeccionar un protocolo simulando los pasos necesarios para
llegar a obtener una población de virus a partir de un cultivo de células infectadas.
3- Calcularemos el título de stocks del virus de la bursitis infecciosa aviar y del SA11 Rotavirus por la técnica de placas de lisis, a partir de muestras ya procesadas.
4- Actividad en el Aula Virtual:
Deberás responder el cuestionario correspondiente al TP 4, el cual se subirá
a la plataforma virtual del Módulo de Virología Año 2015. TODOS deberán
responder el cuestionario. El tiempo del cual disponen para poder completar
el cuestionario es de 6 días (contando desde el Viernes que realizaron el
práctico, hasta el miércoles de la semana siguiente inclusive). Aquel alumno
que no haya entregado el cuestionario en la fecha pactada, no podrá rendir
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el examen post-práctico correspondiente al práctico siguiente, y por tanto se
tomará a este práctico como desaprobado.
BIBLIOGRAFÍA
Libros y publicaciones científicas
- Basualdo Juan A; Coto Celia E; Torres Ramon A. Microbiología Biomédica.
2006.Segunda Edición. Capítulo 72.
- Cann y col. Principles of molecular virology. 2005. 4th edition. El Sevier.
Páginas web:
http://datateca.unad.edu.co/contenidos/203016/contLinea/leccin_11_virus_de_la_r
abia.html
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