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VIRUS
Microbiología II
FMVZ
Dra. Virginia Bolaños de Corzo
Métodos de propagación
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Para fines diagnósticos la inoculación de
animales es un medio para detectar virus
en muestras clínicas, como el virus de la
rabia en ratones lactantes.
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Actualmente el uso de animales
experimentales como hospederos para
propagación viral está limitado por razones
éticas.
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Huevos embrionados.
Este sistema se usa para propagación
viral con fines diagnósticos y de
investigación.
Cuando se usa huevos embrionados,
se debe considerar la posible
presencia de anticuerpos maternos en
el saco vitelino del huevo. Por lo que,
frecuentemente es preferible obtener
huevos embrionados de parvadas
libres de patógenos específicos
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(spf)
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Cultivo de explantes
Estos son cultivos de pequeños
fragmentos de tejidos específicos,
tomados directamente del hospedero
animal.
Los cultivos de explantes son útiles
para el aislamiento viral.
Se requieren para el aislamiento de
algunos coronavirus. La demostración
de latencia de algunos alfa
herpesvirus humanos y animales
puede requerir explantes de ganglio
nervioso sensitivo (por ejemplo,
trigémino).
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Cultivos celulares primarios
Estos se derivan de tejidos frescos que
han sido digeridos enzimáticamente con
tripsina u otras proteasas, para liberar
células individuales. En condiciones in
vitro las células de los cultivos primarios
raramente pueden dividirse, o se dividen
a una velocidad muy baja.
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A pesar del tiempo de vida limitado de
los cultivos primarios, son ideales
para el aislamiento de algunos virus.
Los cultivos primarios raramente
sobreviven más allá del vigésimo
pase in vitro.
Cultivos semi-continuos
Son por lo general de fibroblastos.
Los cultivos semi-continuos tienden a
morir entre el 30° y el 50° pase in
vitro.
Son útiles en la propagación de una
gran variedad de virus.
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Cultivos celulares continuos
Estos cultivos se derivan de tejidos
normales o neoplásicos y se
caracterizan por su habilidad para ser
propagados in vitro indefinidamente.
Las líneas celulares continuas no son
tan sensibles como las otras para
propagación viral;
Facilitan la propagación a gran escala
de algunos virus para vacunas e
investigación. Muchas líneas
continuas están disponibles de
proveedores como la Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC)
La mayoría de los laboratorios de
virología almacenan en congelación
alícuotas iniciales de sus cultivos
continuos, debido a que las líneas
celulares que están continuamente en
cultivo pueden sufrir cambios en sus
características celulares.
Ej. Contaminación con otros virus.
Concentración y purificación
de virus
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Una vez que un virus ha sido
propagado adecuadamente, necesita
ser recuperado de las células
hospederas y luego ser purificado.
Esto se logra por varios procesos que
involucran: centrifugación diferencial
(a diferentes velocidades), diálisis,
precipitación, cromatografía y
gradientes de densidad.
Infectividad
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La infectividad es la habilidad de la
partícula viral para infectar una célula
hospedera. La temperatura en el
exterior de la célula hospedera afecta
fácilmente la capacidad del virus para
conservar su infectividad
Infectividad vrs temperatura
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A 60°C: disminuirá rápidamente, en
segundos.
A 37°C: disminuirá dramáticamente, en
minutos.
A 20°C: disminuirá, en cuestión de
horas.
La infectividad en las temperaturas
antes mencionadas influyen en la
transmisión del virus por contacto
directo (a 37°C) y por fomites (a 20°C).
A 4°C: se pierde en cuestión de días.
Almacenamiento
Los tres métodos principales son:
 Congelación a -70°C, con o sin
criopreservante.
 Congelamiento en nitrógeno líquido
(-196°C). Para almacenamiento por
largos periodos:
 Liofilización, en congelación o a
temperatura ambiente.
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Visualización de los virus

Los dos métodos principales usados
para visualizar la estructura /
morfología de los virus son: la
microscopía electrónica y la
microscopía de fuerza atómica. Otros
tipos de microscopía se usan para
observar cambios inducidos por la
replicación viral en las células
infectadas
Microscopia electronica
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La microscopía electrónica proporciona
imágenes tridimensionales de viriones y de
su localización (nuclear o citoplasmática)
dentro de la célula hospedera en un
momento dado durante la infección. La
observación de viriones en células vivas no
es posible, debido a que las muestras
tienen que ser tratadas con metales
pesados.
Microscopia de fuerza atómica
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Los electrones son capaces de "atravesar
por túnel" entre los átomos, provocando
una fuerza pequeña pero cuantificable. El
resultado de estas mediciones es un mapa
detallado del contorno o la superficie de la
estructura.
La ventaja de la microscopía de fuerza
atómica es que la preparación de la
muestra es mínima y pueden usarse
especímenes vivos.
Microscopia óptica.
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Es útil para observar los efectos de la
infección viral en la célula hospedera.
El daño celular o la destrucción
causada por el virus es conocida
como efecto citopático (CPE por sus
siglas en inglés). Los efectos
citopáticos que pueden observarse
incluyen:
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Células redondeadas y agregados en forma
de racimo de uvas, como se observa con
adenovirus.
Células redondeadas, encogidas, lisadas,
dejando gran cantidad de restos celulares,
como se observa con los enterovirus.
Células agrandadas y redondeadas en áreas
focales, como los herpesvirus.
Fusión de células que se convierten en
células multinucleadas (sinsitios) como en el
caso de paramyxovirus.
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Además es posible observar cuerpos
de inclusión, característicos de
algunos virus
Microscopia de fluorescencia
Puede ser usada para visualizar células
o tejidos infectados por virus, usando
anticuerpos antígeno-específicos
marcados con fluorocromos. El
anticuerpo se une específicamente a los
antígenos virales presentes dentro de
las células o tejidos y los marca con la
molécula fluorescente (generalmente
fluoresceína)
Enumeración indirecta de virus
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Los métodos indirectos de cuantificación
viral son aquellos que usan factores
asociados con la infectividad (actividad
biológica). Los tres métodos principales
usados para determinar indirectamente
concentraciones virales son:
ensayos de hemoaglutinación,
ensayos de formación de placas
el método de la dilución limitante.
Hemoaglutinacion

Esta prueba se basa en la propiedad
que tienen muchos virus envueltos
para aglutinar glóbulos rojos.
Se realiza en una microplaca,
añadiendo glóbulos rojos a diluciones
de la muestra que contiene virus, y
observando posteriormente la
hemoaglutinación.
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La hemoaglutinación es útil en la
concentración y purificación de
algunos virus, y como prueba
presuntiva rápida para la presencia de
este tipo de virus en fluidos de
cultivos celulares infectados y de
embriones de pollo.
Formacion de placas
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la inoculación de células hospederas
susceptibles con un virus, y usar su
actividad biológica para estimar el
número de viriones presentes.
En este procedimiento se usan
diluciones decimales seriadas del
virus para inocular monocapas de
células hospederas
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Con los virus citopaticos la
destrucción de las células lleva a la
formación de zonas desocupadas
llamadas placas, que pueden ser
vistas entre las 24 y 72 horas de
incubación.
El método de dilución limitante
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Basado en titulación, mide un efecto
in vitro sobre las células, como el
CPE, cuando éstas se expone a
varias diluciones de la solución que
contiene el virus. Dependiendo del
virus, se hacen diluciones seriadas
dobles o diluciones seriadas
decimales del material viral y se
ponen en contacto con las células.
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. El título infectivo (el recíproco de la
dilución más alta que provoca el 50%
de CPE en el cultivo infectado) se
expresa como TCID50/ml (dosis
infectiva 50 cultivo celular). Este
ensayo puede usarse con células en
cultivo, embriones de pollo o incluso
con animales de laboratorio.
Metodos Inmunologicos
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Los animales infectados con virus
responden produciendo anticuerpos
específicos. La detección y
cuantificación de estos anticuerpos,
reflejan el estado de la enfermedad.