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ANÁLISIS DE ALIMENTOS
PRÁCTICA # 3
ANÁLISIS BROMATOLÓGICO BÁSICO
ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO EN PROTEÍNAS
POR EL MÉTODO DE KJELDAHL
INTRODUCCIÓN
El problema que representa proporcionar proteínas adecuadas a la
población del mundo es un tanto secundario en el problema general de
alimentación mundial. Además de su significado nutritivo las proteínas juegan
un papel importante en las propiedades organolépticas de los alimentos. Las
proteínas ejercen una influencia controladora en la textura de los alimentos
provenientes de fuentes animales. El contenido protéico del trigo y su harina
es considerado como uno de los mejores indicadores de la calidad de la
panificación. El análisis para la determinación de proteínas, a pesar de no
estar incluido generalmente como factor de clasificación en los estándares de
granos se acepta como un factor comercial.
Las proteínas existen en los alimentos en combinación física o química
con carbohidratos o lípidos. Las glucoproteínas y las lipoproteínas afectan las
propiedades reológicas de las soluciones alimenticias o poseen aplicaciones
técnicas como emulsificantes comestibles. El "envejecimiento" de la carne está
relacionado con cambios químicos en las proteínas. Las proteínas naturales
puras poseen poco sabor. Durante el proceso de calentamiento (ebullición,
panificación, asado) las cadenas laterales de aminoácidos se degradan o
interactúan con otros componentes de los alimentos (ejemplo, la lisina con los
azúcares reductores) para conferir sabores típicos. El calentamiento excesivo
puede, por otro lado, reducir el valor nutritivo.
El analista de alimentos comúnmente desea saber el contenido protéico
total de los alimentos, aunque dicho contenido esté conformado por una mezcla
compleja de proteínas.
Actualmente todos los métodos para determinar el
contenido protéico total de los alimentos son de naturaleza empírica.
El
aislamiento y pesado directo de la proteína proporcionaría un método absoluto,
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sin embargo, dicho método es llevado a cabo sólo a veces en investigaciones
bioquímicas pero es completamente impráctico para el análisis de alimentos.
En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el proceso
básico del conocido método actual de análisis de proteínas por el método
Kjeldahl, más propiamente, para analizar nitrógeno orgánico. En esta técnica
se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos en
una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógeno
orgánico total es convertido en sulfato de amonio.
La mezcla digerida se
neutraliza con una base y se destila posteriormente en una solución de ácido
bórico. Los aniones del borato así formado se titulan con HCl estandarizado, lo
cual se convierte en el nitrógeno de la muestra.
El resultado del análisis
representa el contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno
también proviene de componentes no protéicos. Este método ha sufrido varias
modificaciones. Así, Kjeldahl usó originalmente permanganato de potasio para
llevar a cabo el proceso de oxidación, sin embargo, los resultados no fueron
satisfactorios, de manera que este reactivo se descartó.
En 1885 Wilforth
encontró que se podía acelerar la digestión con ácido sulfúrico añadiendo
algunos catalizadores. Gunning en 1889 sugirió la adición de sulfato de potasio
para elevar el punto de ebullición de la mezcla de la digestión para acortar la
reacción. Por lo tanto, el procedimiento de esta técnica es más correctamente
conocido como Método Kjeldahl-Wilforth-Gunning.
FUENTES DE ERROR
Constituyen fuentes de error en este método son: la inclusión de
nitrógeno no protéico como parte de la proteína; la pérdida de nitrógeno
durante la digestión, la digestión incompleta de la muestra.
Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se
añaden al ácido (para elevar el punto de ebullición) pueden resultar en una
descomposición
por
calor
y
la
consecuente
pérdida
de
amoníaco.
Generalmente se recomiendan temperaturas de digestión de 370-410°C.
También puede ocurrir pérdida de nitrógeno si se utiliza demasiado
selenio o la temperatura de la digestión no se controla cuidadosamente; las
condiciones son aún más críticas que con el cobre o el mercurio cuando se
usan como catalizadores.
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ESTRATEGIA
En la práctica comercial se tienen que analizar un gran número de
muestras diariamente, así que se utilizan estrategias que ahorran tiempo de
análisis.
En el análisis del harina de trigo se digiere 1 gramo de muestra
usando una cantidad conocida de ácido sulfúrico 0.1253N, y titulando
(mediante una bureta de lectura invertida) con hidróxido de sodio 0.1253N, así
se hace posible reportar el porcentaje de proteína directamente de la lectura de
la bureta.
REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MÉTODO DE KJELDAHL
DIGESTIÓN
(1) n - C -NH2 + mH2SO4
proteína
catalizadores
CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2
calor
NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN
(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH
2NH3 + Na2SO4+ 2H2O
(3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico)
borato)
NH 4 + H2BO3-
(ión
TITULACIÓN
El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con
HCl estandarizado:
(4)
H2BO3- + H+
H3BO3
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OBJETIVOS
El estudiante conocerá el fundamento del análisis de proteínas por el
método de Kjeldahl.
El estudiante se familiarizará con los equipos y el procedimiento del
análisis de proteínas por el método de Kjeldahl y la recuperación de amoníaco.
El estudiante aprenderá a realizar los cálculos pertinentes para la
determinación de nitrógeno en proteínas.
MATERIAL
1 matraz de digestión Kjeldahl con capacidad de 125 ml.
1 matraz de Erlenmeyer de 10 ml.
1 matraz volumétrico de 100 ml.
1 mechero de Bunsen.
2 pinzas (nueces).
1 soporte universal
1 pipeta de 5 ml.
1 pipeta de 10 ml.
1 frasco gotero de 25 ml.
1 frasco lámbar con capacidad de 1 litro.
1 piseta grande con agua destilada.
1 microbureta.
3 cuerpos de ebullición.
1 par de guantes de asbesto.
1 pinzas largas.
1 embudo de cristal chico o mediano.
EQUIPO
Aparato digestor Kjeldahl (1 para todo el grupo).
1 aparato destilador micro Kjeldahl (1 por equipo).
REACTIVOS
Verde de bromocresol al 0.1% diluido en alcohol al 95%.
Rojo de metilo al 0.1% diluido en alcohol al 95%.
Ácido bórico al 2%.
Ácido clorhídrico 0.01N (solución valorada).
Hidróxido de sodio al 30%.
Ácido sulfúrico concentrado.
Mezcla catalizadora para la digestión: 2.5 g de dióxido de selenio + 100 g de
sulfato de potasio + 20 g de sulfato de cobre pentahidratado (proporcionada por
la coordinación de laboratorios).
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MÉTODO
ELABORACION DE REACTIVOS
1.- Mezcla Indicadora.- Prepare por separado los indicadores verde de
bromocresol al 0.1% y el rojo de metilo al 0.1% diluidos en alcohol al 95%.
Mezcle 10 ml. de verde de bromocresol con 2 ml. de la solución de rojo de
metilo en un frasco gotero.
2.- Ácido Bórico al 2%.- Disuelva 10 g de ácido bórico (en cristales) en 500 ml.
de agua destilada hirviendo. Después de que se enfríe transfiera la solución a
un frasco tapado. Se conserva indefinidamente.
3.- Ácido Clorhídrico 0.01N.- Prepare un litro y valórela con una solución de
NaOH de la misma normalidad.
4.- Hidróxido de Sodio al 30%.- Disuelva 150g de perlas de hidróxido de sodio
en 350 ml. de agua destilada. Almacene la solución en un frasco ámbar con
tapón de vidrio.
5.- H2SO4 concentrado.
6.- Catalizadores para la Digestión.- Mezcle 2.5g de dióxido de selenio
(SeO2), 100g de sulfato de potasio (K2SO4) y 20 g de sulfato de cobre
pentahidratado (CuSO4 . 5H2O).
PROCEDIMIENTO
DIGESTIÓN
1.- Pese exactamente 0.15g de harina de trigo en un matraz de micro-Kjeldahl
cuidando que la muestra no se adhiera a las parédes o al cuello del matraz.
2.- Añada 2.5 ml. de H2SO4, dos perlas de ebullición y aproximadamente 1.0 g
de mezcla catalizadora.
3.- Someta a digestión la muestra en el aparato de microKjeldahl bajo una
campana de extracción, con el matraz ligeramente inclinado usando baja
temperatura al inicio y aumentando el calor a medida que procede la digestión,
rotando los matraces de vez en cuando para asegurarse de que se digiera toda
la muestra. La digestión terminará cuando el color de la muestra sea azúlverde claro. El proceso tomará aproximadamente 90 minutos.
4.- Enfríe el matraz durante unos 4 minutos para que no se endurezca al
solidificarse la muestra.
5.- Añada 7 ml. de H2O cuidadosamente, poco a poco, a la muestra digerida.
Mezcle y permítale enfriarse.
DESTILACIÓN
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6.- Encienda la unidad destiladora.
7.- Si es posible ajuste la velocidad de destilación a aproximadamente 5 ml.
por minuto
8.- Abra la llave del agua para tener H2O circulando por el refrigerante todo el
tiempo.
9.- Añada la muestra a la cámara de ebullición por medio de un embudo (para
recuperar las perlas de ebullición) y enjuague el matraz con aproximadamente
5ml. de H2O destilada.
10.- Coloque 1 frasco Erlenmeyer con 10 ml de ácido bórico y 2 gotas de
indicador bajo la salida de destilación.
11.- Añada aproximadamente 10 ml. de la solución de NaOH a la cámara de
ebullición LENTAMENTE. La mezcla digerida se tornará oscura (azúl-gris o
café oscuro). Si no cambia de color añada más NaOH.
12.- Deje un poco de NaOH en la copita superior del destilador.
13.- Colecte aproximadamente 20 ml. del destilado (4-5 minutos). El destilado
estará listo para ser titulado cuando se torna verde en el matraz receptor.
14.- Retire el matraz de Erlenmeyer y limpie la unidad destiladora enjuagando
la cámara de ebullición varias veces con agua destilada. Cada vez que se
añada agua destilada hasta llenar la copita superior de la unidad destiladora
para el enjuague deje que ésta hierva primero. Luego abra la llave de la parte
que permite salir las muestras hacia fuera de la unidad destiladora. Una vez
vacía la parte en donde se procesa la muestra asegúrese de que esté bien
vacía. Si queda todavía un poco de agua en el fondo permita que hierva para
que se vaya toda hacia esa segunda parte de la unidad destiladora. El matraz
estará listo para recibir la segunda cantidad de agua destilada para lavar la
unidad destiladora. Esta operación se repite al menos unas 4 veces.
NOTA: La llavecita de la segunda parte de la unidad destiladora (que conduce
la muestra procesada hacia el vasito permanece cerrada (en posición
horizontal) durante el procesamiento de la muestra. Sólo se abre cuando se
enjuaga el destilador.
TITULACIÓN
15.- Titule la muestra con 0.1N de HCl. Un color violeta indica el punto final de
la titulación. Compárese este color con el del blanco. Cada equivalente del
HCl usado corresponde a un equivalente de NH3 o a un equivalente de N en la
muestra original. El peso del N en mg está dado por miliequivalentes del ácido
X 14 (el peso equivalente del N).
RECUPERACIÓN DEL AMONÍACO
Una posible fuente de variación en este método es la pérdida del gas
amoníaco o una falla en atrapar el amoníaco en el ácido bórico. Esto puede
ocurrir en diferentes pasos del proceso.
Una técnica para buscar la
recuperación del amoníaco consiste en destilar cantidades conocidas de
amoníaco líquido y titularlo con HCl. Se obtendrá otra vez el color púrpura en
el ácido bórico.
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Mientras se digieren las muestras, se puede destilar una solución de
sulfato de amonio. Añada 5, 10 ó 15 ml (mediante una pipeta) de solución de
sulfato de amonio a la cámara de ebullición de la unidad destiladora.
Enjuáguela después con agua destilada y, si es posible, desionizada. Coloque
inmediatamente la punta de la unidad destiladora en 10 ml de ácido bórico +
indicador. Colecte aproximadamente 20 ml. de destilado.
Titule la muestra con el HCl estandarizado, registre los ml. de HCl
empleados y calcule el peso del nitrógeno en el (NH4)2SO4.
Cálculos
Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra
% N = NHCl x Volumen de ácido corregido x 14 g N x 100
g de muestra
mol
en donde:
NHCl = Normalidad del HCl en moles/1000ml.
Volumen del ácido corregido = (ml. del ácido estandarizado para la
muestra) - (ml. de ácido estandarizado para el blanco).
14 = Peso atómico del nitrógeno.
Se utiliza un factor para convertir el porcentaje de N a porciento de
proteína cruda. El porcentaje de N en proteína para el harina de trigo es de
18% y su factor de conversión es de 5.70.
BIBLIOGRAFÍA
A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists.
Methods of Analysis. Washington, D.C.
Official
Nielsen, S.S. 1994. Introduction to the Chemical Analysis of Foods. Ed.
Jones and Bartlett Publishers. U.S.A. pp 209-212.
Ranganna, S. 1977. Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Products.
Ed. McGraw-Hill Publishing Co. Ltd. New Delhi.
Yeshajahu P. y Meloan C.E. 1987. Food Analysis. Theory and Practice.
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