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Expresión y estudio de proteínas humanas con dominios TIR en
Saccharomyces cerevisiae.
Nicola Paccione Basmadji.
Plaza Ramón y Cajal s/n. Facultad de Farmacia. Grado en Farmacia. Universidad Complutense de Madrid.
[email protected]
Víctor Jiménez Cid. Isabel Rodríguez Escudero.
Plaza Ramón y Cajal s/n. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid.
[email protected]; [email protected]
Resumen: Los TLRs (Toll-Like Receptors) juegan un papel fundamental en la respuesta
inmune, reconocen moléculas que se encuentran ampliamente distribuidas entre un
gran número de microorganismos patógenos e inician cascadas de señalización que
desencadenan la síntesis de sustancias pro-inflamatorias y apoptóticas. Para
desempeñar su función es necesaria la interacción con proteínas citoplásmicas (MyD88
y TIRAP, entre otras) mediante los llamados dominios TIR (receptor toll/IL-1), motivos
conservados entre los diversos TLRs, el receptor de interleucina 1 y diversas proteínas
tanto de mamíferos como de bacterias. Es por esto que diversos patógenos (Yersinia
pestis, Salmonella entérica, Brucella spp., entre otros) inhiben la activación de esta vía
para impedir una respuesta inmune eficaz. Esto lo consiguen inhibiendo la activación o
la unión a los TLRs de las proteínas con dominios TIR.
Nuestro objetivo consiste en crear un modelo de estudio eucariótico de fácil manejo
genético para realizar estudios moleculares con proteínas TIR. Para ello hemos
seleccionado Saccharomyces cerevisiae como modelo de expresión heteróloga, en el
cual hemos logrado la expresión de TIRAP humano y el factor de virulencia de Brucella
abortus BtpB.
Palabras clave: Levadura humanizada. Proteínas TIR
INTRODUCCIÓN
Los receptores de tipo toll (TLR) son glicoproteínas transmembrana conservadas
evolutivamente y están presentes en un gran número de células inmunitarias (como macrófagos
y células dendríticas) además de fibroblastos y células epiteliales. Son capaces de reconocer los
llamados patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), macromoléculas variadas (P.E:
lipopolisacarido, flagelina, etc.) que no se encuentran en las células del hospedador.¹
Su activación induce la síntesis de sustancias pro-inflamatorias y reguladoras del sistema
inmune. Aunque han demostrado ser más importantes de lo que en un primer momento se
pensó, son necesarios en el proceso de activación de linfocitos T por las células dendríticas y
participan en la regulación de su actividad. Asimismo, su capacidad para distinguir entre
moléculas endógenas y exógenas previene reacciones de autoinmunidad.² ³
Todas estas funciones se desempeñan mediante la unión a otras proteínas, las cuales
presentan dominios receptor toll/IL-1 (TIR). Estos son segmentos de aproximadamente 200
residuos con 3 regiones y una estructura muy conservadas, su cualidad fundamental es que
permiten la interacción entre las proteínas que los presentan.⁴ Existen múltiples proteínas TIR,
aunque las más importantes son MyD88, TIRAP, y en menor medida, Trif y Tram. MyD88 es el
adaptador principal en la activación de los TLRs y su deficiencia inhibe en gran medida la
respuesta. Por otra parte TIRAP (también llamado Mal) actúa principalmente como adaptador y
regulador en la unión de los TLRs y MyD88; además presenta un dominio de unión a
fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2). La activación de los TLRs permite la unión y desencadena
dos posibles rutas de señalización: por un lado la ruta dependiente de MyD88 y por otro la ruta
independiente de MyD88 o dependiente de Trif (Fig. 1). En ambos casos la ruta culminara con la
síntesis de citoquinas pro-inflamatorias (IL-1, 6 y 12), TNF-α e interferones tipo 1. ⁴
Figura1.Representacion esquemática de la activación de los TLRs y la unión a proteínas TIR. Tanto TIRAP como Tram son solo
necesarios en caso de TLRs presentes en la membrana.
Al igual que los organismos complejos, algunas bacterias patógenas producen proteínas
con dominios TIR, en este caso actúan como factores de virulencia o reguladores de la respuesta
inmune de los organismos que infectan. Entre ellas cabe TcpC de Escherichia coli uropatogénica
que interfiere a diversos niveles y reduce la secreción de TNF-α e IL-6, YpTdp de Yersinia pestis
que interacciona con MyD88 y modula la secreción de citoquinas durante la infección y BtpA
(también conocida como Btp1 y TcpB) y BtpB de Brucella spp. que interaccionan con MyD88
para inhibir la respuesta inmunitaria.⁵
Levaduras humanizadas como herramientas en la investigación
Llamamos levadura humanizada a cepas de Saccharomyces cerevisiae que
expresen proteínas humanas de manera heteróloga reproduciendo en este modelo su
función. Pese a ser un organismo unicelular y presentar bastantes diferencias con las
células humanas, sigue siendo eucariótico y sus características lo convierten en un
microorganismo idóneo como modelo de experimentación. Por ejemplo, su cultivo es
sencillo y económico, crece rápidamente, su modificación genética es relativamente
sencilla, su biología está caracterizada y conserva gran cantidad de procesos presentes
en organismos eucarióticos superiores.
Asimismo las levaduras conservan aproximadamente un 30% de las proteínas (o
sus homólogos) implicadas en enfermedades humanas, y para las que no presenten
homólogos existen gran cantidad de técnicas para expresarlas, dirigirlas y estudiarlas.
Esto permite reconstruir la maquinaria de interés en el estudio de enfermedades.⁶ En
los últimos años la aplicación de las levaduras humanizadas para la investigación ha ido
en auge, y estas se utilizan para estudiar procesos como el Parkinson⁷ o el cáncer.⁶
Por todo esto estamos diseñando un modelo de levadura humanizada que nos
permita estudiar las cascadas de señalización de los TLRs y por consiguiente las
proteínas con dominios TIR, así como su interacción con factores de virulencia
bacterianos. Esto nos podría permitir identificar interacciones desconocidas o realizar
screenings farmacológicos en busca de nuevos principios activos.
MATERIALES Y METODOS
Se utilizaron cepas de E. coli y S. cerevisiae en el procedimiento. La cepa de E. coli
fue DH5α F´ [K12Δ(lacZYA-argF)U169 deoR supE44 thi-1 recA1 endA1 hsdR17 gyrA96
relA1 (Φ80lacZ_M15)F´]. Por otro lado, la cepa de S. cerevisiae fue YPH499 MATa;
ade2-10; trp1-63; leu2-1; ura3-52; his3-Δ20; lys2-801. Como plásmidos se emplearon
pGEM-T como vector de clonación y pYES2 y pYES3 como vectores de expresión
regulada por el promotor dependiente de galactosa GAL1. Los genes que codifican las
proteínas fluorescentes mCherry y GFP, así como los cDNAs de TIRAP y BtpB proceden
de clones de la colección del Grupo UCM de Señalización Celular en Levaduras. Se
trabajó con 2 construcciones, por un lado se utilizó el plásmido pYES3-GFP-BtpB generado por María
Rodríguez Escudero en nuestro laboratorio, por el otro, se usó un pYES2 al que se integró primero
mCherry con las enzimas HindIII y BamHI y después el cDNA de TIRAP con la enzima BamHI
exclusivamente. Para la segunda construcción se utilizaron los oligonucleótidos:
mCherry Up (HindIII) 5’-GGAAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3
mCherry Lo (BamHI) 5’-GGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’
TIRAP up (BamHI) 5’-GGGGATCCATGGCATCATCGACCTCCC-3
TIRAP lo (BamHI) 5’-GGGGATCCTCAAAGTAGATCAGATACTGTAG-3’
Se siguieron técnicas estándar de cultivo y biología molecular para la PCR, la
clonación y la transformación en E. coli y S. cerevisiae, descritas por Fernández-Acero
et al.⁶ Se empleó además el Western-Blot, el revelado se realizó utilizando el sistema
Odyssey® y anticuerpos de ratón anti-mCherry (dilución 1/1000) como anticuerpo
primario y anti-mouse IRDye® 800CW como secundario (dilución 1/5000).
También se realizaron ensayos de crecimiento en gota mediante diluciones
decimales seriadas, estos consisten en depositar 5 μl de suspensiones celulares
calibradas a una DO600 =0,5 y tres diluciones 1/10 en serie de las mismas sobre una
placa de agar SD o SG, siendo la primera un control y la segunda, al presentar
galactosa, induce la expresión del gen heterólogo. Las placas se incuban a 30ºC y se
observan 2 o 3 días después. Por último, se utilizó microscopia de fluorescencia para
observar mCherry-TIRAP y GFP-BtpB. El equipo consistió de un microscopio Eclipse
TE2000U Nikon, una cámara Orca C4742-95-12ER y un procesador de imagen HCImage.
RESULTADOS
La fusión del cDNA de TIRAP con mCherry permitiría monitorizar la expresión y
localización en S. cerevisiae. La microscopia de fluorescencia sobre células
transformadas con esta construcción en condiciones de expresión reveló que mCherryTIRAP mostraba un patrón citoplásmico pero tendía a asociarse a la membrana
plasmática (Fig2A). La coexpresión de GFP-BtpB de Brucella y mCherry-TIRAP trasladó
su localización a puntos donde co-localizaba con BtpB (Fig2B)
Figura2. Localización de TIRAP humano en levadura y co-localización con BtpB. A. Microscopía de fluorescencia de
mCherry-TIRAP y su correspondiente captura en campo claro. B. Microscopía de fluorescencia de células co-expresando
GFP-BtpB y mCherry-TIRAP. El panel “Merge” es la superposición de ambos canales.
La expresión se comprobó mediante Western blot (Fig3) en la que se puede
apreciar una doble banda en torno a los 50 KDa, el peso estimado de la fusion
mCherry-TIRAP. Esta banda doble sugiere que la proteina esta sufriendo alguna
modificación. Asimismo se éstudió la posible toxicidad de TIRAP para la levadura y
posteriormente, al ver que no la presentaba (Fig4. A y B), se coexpresó con BtpB,
proteina que resulta muy inhibitoria para el crecimiento de la levadura. A pesar de la
co-localización de ambas, TIRAP no influye en el efecto letal de BtpB (Fig 4. C y D).
Figura3 (Izq). Detección de la expresión de mCherry-TIRAP (carril 1). En el carril 2 se cargó un lisado de células
transformadas con el vector vacío (pYES2) como control.
Figura 4 (Der). Ensayos de crecimiento en gota mediante diluciones decimales seriadas. A y B la expresión de TIRAP no
causa toxicidad en levadura. C y D. TIRAP no interfiere con la toxicidad de BtpB. Se muestra un duplicado de cada
experimento realizado con transformantes distintos.
CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN
En primer lugar, el hecho de que TIRAP, al contrario que BtpB, no inhiba el
crecimiento de la levadura, demuestra que las proteínas con dominios TIR no
presentan una toxicidad intrínseca en el modelo de levadura, sino que ésta es
inherente a ciertos factores de virulencia de origen bacteriano. Por otra parte, la
localización de TIRAP en la membrana plasmática de levadura es interesante para el
estudio de esta proteína, ya que se debe probablemente a su interacción con el PIP2.
En segundo lugar, aunque no está documentada la interacción directa entre BtpB
y TIRAP durante la infección por Brucella,⁵ su co-localización intracelular en nuestro
modelo (Fig. 2) puede implicar que estas proteínas formen un complejo. Esto pone de
manifiesto la utilidad de es modelos para la experimentación.
Por último, el éxito en la expresión y localización de una proteína de la ruta de
señalización de TLRs permite concluir que puede ser posible reconstituir en este
modelo heterólogo esta ruta para su aplicación al estudio molecular de proteínas
bacterianas que interaccionan con su función, así como para el desarrollo de
bioensayos para estudios genéticos y farmacológicos.
BIBLIOGRAFÍA
1. Shizuo A, Uematsu S, Takeuchi O. Pathogen Recognition and Innate Immunity. Cell.
2006 Feb; 124(4): p. 783-801.
2. Blander JM, Sander EL. Beyond pattern recognition: five immune checkpoints for
scaling. Nature Reviews Immunology. 2012 Mar; 12(3): p. 215-225.
3. Akira S. Pathogen recognition by innate immunity and it signaling. Proc Jpn Acad
Ser B Phys Biol Sci. 2009 Apr; 85(4): p. 143–156.
4. Watters TM, Kenny E, O'Neill LAJ. Structure, function and regulation of the Toll/IL-1
receptor adaptor proteins. Immunology and Cell Biology. 2007; 85: p. 411-419.
5. Salcedo S, Marchesini M, Degos C. BtpB, a novel Brucella TIR-containing effector
protein with immune modulatory functions. Frontiers in cellular and infection
microbiology. 2013 Jul
6. Fernández-Acero T. modelo de levadura humanizada mediante expresión de la
proteina oncogenica PI3K: aplicación a la búsqueda de inhibidores y estudio de la
señalización lipídica Madrid: Universidad Complutense de Madrid; 2014.
7. Franssens V, Bynens T, Van den Brande J. The Benefits of Humanized Yeast Models
to Study Parkinson’s Disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2013.